荧光定量PCR实验的影响因素小结

关于荧光定量PCR实验的影响因素小结

荧光定量PCR实验的影响因素小结

引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。可以说,不合理的设计意味着绝对的失败。但是,好的设计并不等于好的实验结果,影响PCR和荧光PCR的因素非常多,下面择其重要进行介绍。

1、引物退火温度

引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进行:以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃,就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2 、引物浓度

引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度,可以在260nm(OD260)测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数(nmol/OD),通过Beers 法则(公式1)计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同,确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短,碱基组成差异很大。在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数(OD/μmol)和消光系数的倒数(μmol/OD)。

一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少,在一般情况下,20个碱基长的引物,1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul(50μM)。也可以用OLIGO 软件,根据引物的的消光系数(OD/μmol),计算出一定的工作浓度下,引物的加水量。

浓度(μM)=A260(OD/ml)×稀释系数×消光系数的倒数(nmol/OD)

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