荧光定量PCR实验的影响因素小结

关于荧光定量PCR实验的影响因素小结

荧光定量 PCR 实验的影响因素小结

引物的设计和选择符合荧光 PCR 的探针并进行设计对于实时荧光 PCR 尤其 重要。可以说,不合理的设计意味着绝对的失败。但是,好的设计并不等于好的 实验结果,影响 PCR 和荧光 PCR 的因素非常多,下面择其重要进行介绍。

1、 引物退火温度

引物的一个重要参数是熔解温度(Tm )。这是当 50%的引物和互补序列表 现为双链 DNA 分子时的温度。 Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的。在理想状态 下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减 少非特异性结合。合理的退火温度从 55℃到 70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5℃。

设定 Tm 有几种公式。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。大部分计 算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂 交稳定性。所有 oligo 软件会自动计算引物的 Tm 值。在设置退火温度时可以如 下进行:以低于估算的 Tm5℃作为起始的退火温度,以 2℃为增量,逐步提高退 火温度。 较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳 结果,两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5℃,就会由于 在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。 如果两个引物 Tm 不同, 将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5个循环, 然后再根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩 余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2 、 引物浓度

引物的浓度会影响特异性。 最佳的引物浓度一般在 0.1到 0.5μM 。 较高的引 物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度,可以在 260nm (OD260) 测量光密度值。 然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数 (nmol/OD) , 通过 Beers 法则(公式 1)计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式 2计算。与大分子双 链 DNA 可以使用平均消光系数不同, 确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系 数。 这是因为引物较短, 碱基组成差异很大。 在 oligo 软件上可以计算出引物的 的消光系数(OD/μmol )和消光系数的倒数(μmol/OD)。

一般商业合成的引物以 O.D. 值表示量的多少,在一般情况下, 20个碱基长 的引物, 1个 O.D. 加 100ul 水后引物浓度为 50pmol/ul(50μM ) 。 也可以用 OLIGO 软件,根据引物的的消光系数(OD/μmol ),计算出一定的工作浓度下,引物的 加水量。

浓度 (μM) =A260(OD/ml)×稀释系数×消光系数的倒数(nmol/OD)

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