间接ELISA法测定抗人血清白蛋白效价

间接ELISA法测定抗人血清白蛋白效价作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）

【摘要】目的通过运用间接ELISA法，来测定抗人血清白蛋白的效价。方法用抗原、酪蛋白分别包被、封闭微孔板，再加入待检血清、一抗、二抗，建立间接包被模式酶联免疫法。经方阵滴定确定抗原和酶标抗体的最适浓度后，测定抗体效价。结果在包被的人ALB浓度为0.1ug/ml，二抗1：20000的稀释倍数时，测出的抗人ALB的效价范围为1：51200。结论运用间接ELISA法，在检测抗人ALB的灵敏度高，优化了反应条件，可用于初步抗人ALB的检测。

【关键词】间接ELISA；抗人血清白蛋白；效价；羊抗人ALB、兔抗羊IgG-HRP

间接ELISA法，是目前最常用的方法，因其灵敏度高，操作简便而被运用广泛。此方法是测定抗体最常用的方法，属于非竞争结合试验。

其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。此次试验就是用间接ELISA测定未知的抗人ALB的效价。

1、主要试剂、仪器、材料及主要溶液的配制

1.1主要试剂：人ALB标准品（250mg/支）；一抗(羊抗人ALB，效价 1:70 1ml/瓶，批号：201106 贮存于4～20℃，有效期：2年)；二抗(兔抗羊IgG-HRP，购自武汉博士德生物工程有限公司)；显色剂：A液、B液，ME002 可溶性TMB显色液；终止液（2M H2SO4）；包被液：0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液；洗涤液

0.05%TWEEN-PBS；PBS缓冲液0.1M PH7.4；封闭液1%酪蛋白-PBST.

1.2仪器：洗板机（BIO-RAD MODEL1575）、孵箱（上海-恒科学仪器有限公司型号：DHP-9272）、SM-3自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所）

1.3材料：96孔酶标板、一次性塑料试管、加样枪（上海求精生化试剂仪器有限公司）

1.4主要溶液的配制：1)、0.05Mol/L PH9．6的碳酸盐缓冲液（包被稀释液）：准确称取1.6g碳酸钠，

2.9g碳酸氢钠于烧杯中加水适量使溶解，用去离子水定溶于1L的容量瓶中，同时调节PH值至9.6；2)、PH7.4 PBS缓冲液: 准确称取氯化钠 8g，氯化钾0.2g，十二水和磷酸氢二钠

3.58g，磷酸二氢钾0.2g于烧杯中，用去离子水定溶于1L的容量瓶中，同时调节PH值至7.4；3)、封闭液1%酪蛋白-PBS-T：准确称取3g酪蛋白于以洁净烧杯中，再加入300ml PBS溶液和150ul Tween20 。将烧杯置于电炉上边搅拌边加热，直至酪蛋白完全溶解；4)、洗涤液0.05%TWEEN-PBS：向1000 ml PH7.4 PBS缓冲液中加入500μl Tween20。PBS-T既是洗板液也是溶解封闭剂酪蛋白（1%）的溶解试剂，配方为PBS+Tween20.

2、方法

2.1微孔板制备：将96孔板划分为四个区域，每个区域4行6列。在1至4区的每微孔中分别加入100ul浓度为10μg/ml、1μg/ml 、0.1μg/ml、0.01μg/ml 的包被抗原，用标签纸封板后，于4℃下过夜。取出微孔板于洗板机中洗涤3次，

拍干后，每孔加入300ul 1%酪蛋白-PBS-T 封闭液,，用标签纸封板后，4℃过夜。 2.2标本及酶标二抗的加入：从冰箱中取出微孔板并于洗板机中洗涤3次，拍干后，向每一区域前5列微孔板中分别加入100μl 浓度为1:100,1:400,1:1600，1:6400,1:12800的标本-羊抗人ALB ，最后一列加入100μl PBS/ 孔，封板后于37摄氏度烘箱中孵育。1小时后取出微孔板，洗涤5次，拍干后向每一区域一至四行微孔板中分别加入100μl 浓度1:1000,1:4000,1:16000，1:64000酶标抗体兔抗羊-HRP ，37℃孵育30分钟。滴加一抗、二抗的布局如表1所示。

表1

2.3显色及OD 值的测定：取出微孔板洗涤5次，拍干后每孔加入各50μl 显色液

A,B 液，于37摄氏度烘箱中孵育15至20分钟后向每孔加入100μl 终止液。在SM-3自动化酶免疫分析仪上，于双波长450nm （参比波长630nm ）处，测各孔OD 值。

2.4血清效价的测定：根据全班8个96孔板中筛选出包被抗原在0.01μg/ml 和0.1μg/ml ，二抗浓度在1：10000和1:20000的条件下，得出稍微有梯度的数据，然后根据以上数据设计如下确定实验。包被抗原浓度分别为0.1μg/ml 、0.01μg/ml 包被酶标板，封闭后，将待测血清按1：100、1:200、…、1:102400倍比稀释后分别加入到1至11号的各酶标孔中，最后第12孔加入PBS 做空白对照，酶标二抗的加入浓度以1：10000，1：20000加入，（如表2所示），其他步骤同上2.1～2.3所述。

羊抗人Alb 血清

兔抗羊 -HRP 1:100 1:400 1:1600 1:6400 1:12800

PBS

兔抗羊 -HRP 1:100 1:400 1:1600 1:6400 1:12800 PBS

1:1000

1:1000 1:400 1:400 1:1600 1:1600 1:64000

1:64000

羊抗人Alb 血清

兔抗羊 -HRP 1:100 1:400 1:1600 1:6400 1:12800

PBS

兔抗羊 -HRP 1:100 1:400 1:1600 1:6400 1:12800 PBS

1:1000 1:1000 1:400

1:400 1:1600 1:1600 1:64000

1:64000

人ALB: 10μg/ml

人ALB: 1μg/ml 人ALB: 0.1μg/ml 人

ALB: 0.01μg/ml

表2

3、结果

3.1 酶标抗体工作浓度的结果

预实验检测人ALB 的最适浓度和兔抗羊-HRP 最适比例，测得的光密度（OD 值）：

表3

实验结果显示：本次预实验中，4种不同包被抗原浓度组的结果均出现了不同程度跳跃，未出现正确的梯度变化，且背景太高，背景过高导致所有组均无法进行线性分析，所以预实验失败。

根据全班8个96孔板中筛选出包被抗原在0.01μg/ml 和0.1μg/ml ，二抗浓度在1：10000和1:20000的条件下，得出稍微有梯度的数据。

3.2待测血清效价的确定实验结果

检测人ALB 的最适浓度和兔抗羊IgG-HRP 最适比例，测得的光密度（OD 值）：

一抗二抗 1:100 1:200 1:400 1：800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400 PBS

1:10000

1:20000

1:10000

1:20000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H

1.963

2.253 2.000 2.138 2.195 1.823 1.609 1.844 1.791 1.992 1.867 1.380 1.925 1.735 1.851 2.041 2.091 1.796 1.835 1.913 1.843 1.657 1.644 1.568 1.619 1.821 1.596 1.328 1.377 1.120 1.693 1.521 1.744 1.093 1.515 0.909 0.786 0.614 0.610 0.513 0.427 0.069 0.820 1.010 0.430 0.313 0.254 0.612 1.765 1.522 1.658 1.750 1.871 1.729 1.426 1.696 1.640 2.064 0.138 1.514 1.676 1.902 1.806 1.786 1.675 0.743 1.481 1.378 1.314 1.439 1.782 1.368 1.299 1.503 1.497 1.392 1.541 1.356 0.433 1.247 1.353 1.270 1.349 0.639 1.105

1.606

1.284

1.340

1.524

0.406

0.393

0.529

0.272

0.176

1.119

1.390

人ALB:0.1μg /ml

人ALB:0.01u μg /ml

表4

本次确定实验在包被抗原为0.1ug/ml ，二抗浓度在1:20000的稀释倍数下时得到梯度的数据，实验成功。

分析上述表格，可以在包被抗原为0.1ug/ml ，二抗浓度在1:20000的稀释倍数下时，一抗与吸光度的线性关系最好，因此以包被抗原0.1μg/ml ，二抗1：20000的稀释倍数为最佳工作浓度的情况下，标本兔抗人白蛋白效价的线性范围为1:100～1:51200，以一抗稀释倍数为横坐标，对应吸光度为纵坐标，做回归曲线：

4、讨论

本实验采用间接ELISA 的方法测定抗人血清白蛋白效价，利用抗原抗体特异性结合，酶标二抗与一抗结合后通过酶标显色后用酶标仪测出OD 值，再计算出空白值，根据样品的OD 值与空白值的之比，若大于2.1则为阳性，若小于2.1则为阴性。这样即可确定工作浓度以及效价。在预实验当中，本小组并未得到很好的梯度来确定包被抗原与二抗的最适工作浓度，故在进行确定实验时是根据全

一抗二抗

1:100 1:200 1:400 1：800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400 PBS

A 1.267 1.331 1.341 1.382 1.099 1.401 0.762 0.985 0.761 0.736 0.276 0.080

B 1.014 0.874 0.795 0.768 0.604 0.526 0.383 0.399 0.336 0.148 0.281 0.086

C 1.661 1.886 1.327 1.370 1.102 1.073 1.358 0.960 1.476 0.526 1.775 1.362 D

0.983 0.874 0.838 1.021

0.750

0.622

1.145

0.091

0.760

0.587

0.850

0.573

班的实验结果来确定的工作浓度，由于在包被抗原为0.1μg/ml和0.01μg/ml，二抗稀释在1:16000时，有其它小组得出梯度数据，所以确定二抗的稀释为1:10000和1:20000。

造成预实验结果出现跳跃，未出现适宜的梯度可能的原因有：（1）本次实验是有小组内成员分工合作，共同完成的，由于每个人操作方法都存在着差异性，这样势必会给最后的结果造成极大的误差；（2）实验中由于加量的孔众多，且均有一个人完成，容易造成每孔中的浓度与实验设计的浓度不一致，这样结果就不具真实性；（3）微孔板封闭后本应4℃过夜后即拿出进行洗板，但因为课程安排的问题，在封闭后第四天下午才进行洗板，取出酶标板部分孔底部有白色沉渣沉积，猜测可能因封闭时间太长，封闭液中已经出现微生物污染，从而影响最后的实验结果；（4）在加一抗和二抗时用手指放在反应板上，手上很多杂质比如蛋白质、汗液、细菌污染了反应板，继而影响了板底得抗原或者一抗二抗等物质；（5）加入终止液的速度太慢，导致各孔的显色时间不太统一，最终测出的OD值跳跃太大而没有规律。

待测血清效价的确定实验通过测定各组合的OD值，分析结果得出当包被抗原为0.1μg/ml，二抗1：20000的稀释倍数时，一抗与吸光度的线性关系最好。

5、结论

通过间接ELISA法，我们确定了最佳抗原的工作浓度为0.1μg/ml，二抗稀释倍数1：20000，标本兔抗人白蛋白效价的线性范围为1:100～1:51200，回归方程为y=-0.1292lnx+1.5827 ，R=0.988。故抗人ALB的效价为1:51200。

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