人外周血内皮组细胞的培养与鉴定

付强，郑昭芬?，彭建强，何晋，王照飞

（湖南师范大学第一附属医院湖南省人民医院心内科湖南省长沙市410005）

摘要：从外周血中分离单个核细胞（MNCs），种植在纤维连接蛋白（Fn）包被的六孔板，以EGM-2培养基定向诱导培养。培养第4天，全量换液后可见梭形或多角形贴壁细胞，镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞。培养初始2周，梭形细胞首尾相连呈条索样生长或两排细胞平行排列呈管样生长，并可见条索样或管样排列的细胞相互交错成网。培养至第3周，细胞呈现为铺路石样外观；经传代后具有次级集落形成能力。流式细胞术显示内皮组细胞（EPCs）表面标志物CD34，KDR呈阳性，而单核、巨噬细胞系表面标志物CD14无表达。激光共聚焦显微镜下，EPCs具有摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力。

关键词：单个核细胞；内皮祖细胞；细胞形态学；细胞表型

1. 材料与方法

1.1 材料

淋巴细胞分离液购自天津灏洋，磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胎牛血清（FBS）、青链霉素购自Hyclone，EGM-2购自Lonza，胰蛋白酶购自Amresco，人纤维连接蛋白（HFN）购自merck，DiI-acLDL购自Molecular probes，FITC-UEA-I、Galetin 购自Sigma，PerCP/Cy5.5-KDR、PerCP/Cy5.5-IgG购自BioLegend，PE-CD34、PE-IgG、FITC-CD34、FITC-IgG购自Beckerman。外周学取自本课题组志愿者。1.2 方法

1.2.1 密度梯度离心法分离人外周血MNCs及其诱导培养

1.2.1.1 采集人外周血25ml至含枸橼酸钠的50ml离心管，然后将抗凝血用PBS等倍稀释；将稀释后的抗凝血与人淋巴细胞分离液按1：1的比例沿离心管壁缓慢置于淋巴细胞分离液上，4℃、400g离心30 min；离心后分为4层：上层为血

浆、血小板和PBS，中层为淋巴细胞分离液，底层为红细胞和粒细胞，中层与上?通讯作者。E-mail: xyxnzzf@https://www.360docs.net/doc/c510404091.html,

长沙市民生科技支撑资金专项K1106022-31

层交界呈混浊的白膜层为MNCs层；用移液枪吸取MNCs层收集于新的50ml离心管中，用适量PBS洗涤两遍；洗涤条件为：4℃、250 g离心10min。

1.2.1.2 接种前预先将6孔板用50ug/ml Fn包被24小时（5μg/cm2）,接种时吸弃Fn，用PBS洗涤2次；用EGM-2诱导培养液(含 10%FBS和100U/ml青链霉素)重悬MNCs；用EGM-2诱导培养液调整其浓度至5×106个/mL，接种至6孔板中，每

，湿度大于95%下培养；4天后首次更换培养液继续培孔加2mL，置于37℃，5%CO

养，以后根据营养状况每周换液2-3次，相差显微镜下观察内皮祖细胞的形态特征。

1.2.1.3 待细胞融合约80%时，弃尽旧培养液，用2mlPBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 200μL消化约1min，倒置显微镜下观察，若细胞胞质回缩、细胞间隙增宽、细胞变圆，立即用EGM-2培养液2mL终止消化，轻柔吹打混匀细胞；吸取细胞悬液置入15mL离心管中，用PBS稀释至15mL，4℃下100g离心5min，洗涤后加入EGM-2培养液重悬细胞；细胞计数后以1×104/cm2的接种密度进行传代，根据营养状况每周换液2-3次。

1.2.2 人外周血EPCs的鉴定

1.2.2.1 EPCs表型流式细胞术鉴定：第二代细胞培养至约80%融合时消化至加入1ml PBS的EP管中，250g离心5min 洗涤细胞；用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×107/ml，取1OO ul细胞混悬液置于编号（A,a-C,c）的EP管中；A-C管中分别加入下述直标抗体10 ul：鼠抗人PE-CD34、鼠抗人PerCP/Cy5.5-KDR、鼠抗人FITC-CD14，同型对照a-c管中加入等量各自荧光标记的鼠IgG，室温避光孵育1h；孵育完毕后各管加入PBS 500u1，250g，离心5min，用500u1 PBS重悬、混匀后，Accuri C6流式细胞仪检测。

1.2.2.2 EPCs摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的功能鉴定：细胞接种前将圆形盖玻片浸于含200μl Galetin的24孔板中，孵育过夜；次日吸弃Galetin，消化第二代细胞，传代接种至24孔板中盖玻片上，根据营养状况及时更换培养基；待细胞融合约50%时吸弃培养基，PBS漂洗3次，避光加入含Di1- ac-LDL(10 ug/mL)

, 95%湿度下孵育4小时；孵育完毕吸弃培养的培养液200 ul，置于37℃, 5%C0

液，PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min；吸弃4%多聚甲醛，PBS漂洗3次，避光加入FITC-UEA-1(10 ug/mL)200 ul,置于37℃, 5%C02, 95%湿度下1小时。滴

少量Fluorescence Mounting Medium于载玻片上，用镊子小心将盖玻片夹出，PBS 浸洗3次，吹干后覆盖于载玻片上，激光共聚焦显微镜观察，拍照。

2.结果

2.1 EPCs形态学特征

外周血MNCs诱导培养第4天，全量换液后可见梭形或多角形贴壁细胞（图1A），镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞（图1B）。诱导培养初始2周，梭形细胞形态逐渐变细长，数量逐渐减少，未表现出明显的增殖能力，期间可见细胞首尾相连呈条索样生长或两排细胞平行排列呈管样生长，并可见条索样或管样排列的细胞相互交错成网(图1C)。诱导培养至第3周，细胞呈现为铺路石样外观；经传代后椭圆形细胞具有次级集落形成能力(图1D)；传代后细胞增殖迅速，3-4天细胞即融合成片。

图1 外周血单个核细胞向内皮祖细胞定向诱导培养的形态学特征。

2.2 EPCs的鉴定

2.2.1 EPCs表型流式细胞术鉴定

流式细胞术检测EPCs的表面标志，结果显示CD34，KDR呈阳性，而CD14无表达。

图2 流式细胞术检测EPCs细胞表型

2.2.2 EPCs摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的功能鉴定

激光共聚焦显微镜下，EPCs胞吞Dil-ac-LDL入胞浆，可见围绕胞核呈红色荧

光的内吞泡（图3A）；胞膜结合FITC-UEA-1，呈现为绿色荧光（图3B），并胞吞入胞浆与摄取的Dil-ac-LDL共同呈现为黄色荧光（图3C）。

图3 EPCs摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的细胞荧光特征

3.讨论

Ito等1将MNCs接种于Fn包被的培养皿中培养24小时后，将非贴壁细胞再次接种于Fn包被的培养皿，培养7天后出现类似Asaraha等2描述的“血岛样”细胞集落。该法预接种24小时是为了去除快速贴壁的单核细胞、内皮细胞等混杂细胞。Hill等3则预接种48小时后才将非贴壁细胞再次接种培养，该法诱导出的细胞称为Hill集落形成单位(Hill Colony Forming Unit，CFU-Hill)。随后Ingram等4将CFU-Hill中呈放射状的梭形细胞标记后移植入体内，未发现新生血管有标记细胞存在，研究证明这种细胞虽然表达内皮细胞标志eNOS、VEGFR2等,具有内皮细胞吞噬ac-LDL和结合UEA-1（荆豆凝集素）的性质；但这些细胞表达单核巨噬细胞系标志CD14，并具有吞噬细菌能力。Vasa等5将MNCs接种于包被Fn和明胶的培养皿，4天后去除非贴壁细胞，贴壁细胞进一步培养数天后同样表达内皮细胞标志vWF、VEGFR2,具有内皮细胞吞噬ac-LDL和结合UEA-1的能力。但该法获得的细胞也表达CD14等，并具有巨噬细胞样吞噬功能。分析认为这些单核巨噬系细胞促进血管新生的机制在于其旁分泌功能，即通过分泌促血管生成的细胞因子刺激EPCs成血管。因此也被称为循环促成血管细胞（circulating angiogenic cells，CACs）6。由此可见，不论是贴壁还是非贴壁细胞，经这些方法诱导培养后，都具有内皮细胞的一些特征，并参与血管新生，但却不直接形成新生血管。由于CFU-Hill、CAC在培养的早期阶段出现，因此称为早期新出集落（Early outgrowth colonies）或早期EPCs（Early EPCs）。我们将外周血MNCs诱导培养第4天后可见梭形或多角形贴壁细胞（图1A），镜

下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞（图1B）。表现出早期EPCs的形态特征。诱导培养初始2周，梭形细胞形态逐渐变细长，数量逐渐减少，未表现出明显的增殖能力。

延长MNCs诱导培养时间，于培养较晚阶段出现的铺路石样细胞称为晚期新出集落（late outgrowth colonies）或晚期EPCs（late EPCs），这种细胞具有较强的增殖能力，经传代后能形成次级集落。Lin 等7将性别不匹配的骨髓移植患者的MNCs分离出来接种于1型鼠尾胶原包被的培养皿中，培养1周后所获得的细胞为受体细胞来源，这种细胞增殖能力有限。而14-21天出现的细胞克隆具有较高的增殖能力，为供体细胞来源，该研究说明具有高增殖活性的细胞来源于骨髓。Ingram等6成功地将脐带血、外周血MNCs诱导为具有高增殖活性的内皮克隆形成细胞（Endothelial Colony Forming Cells ,ECFCs)。并发现脐带血中的ECFCs增殖能力强于外周血。研究发现ECFCs仅表达内皮细胞表面标志，但是不表达CD14等巨噬细胞表面标志，也不具备细菌吞噬能力。尤为重要的是，将这些细胞标记后移植入体内，新生血管中出现标记细胞，说明ECFCs直接参与血管的形成。本研究诱导培养第3周，成功获得了铺路石样细胞；经传代后具有次级集落形成能力(图1D)；该细胞增殖迅速，3-4天细胞即融合成片，表现为晚期EPCs的形态特征。随后我们采用流式细胞术检测了细胞的表面标志，结果显示内皮细胞表面标志物CD34，KDR呈阳性，而单核、巨噬细胞系表面标志物CD14无表达(图2)；与上文所述的晚期EPCs特征相符。最后，本实验进一步从功能学角度鉴定了诱导培养的细胞，激光共聚焦显微镜下，细胞胞吞Dil-ac-LDL入胞浆，可见围绕胞核呈红色荧光的内吞泡（图3A）；胞膜结合FITC-UEA-1，呈现为绿色荧光（图3B），并胞吞入胞浆与摄取的Dil-ac-LDL共同呈现为黄色荧光（图3C），说明该细胞具有内皮功能。

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小胶质细胞培养及鉴定

2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混

合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片

外周血单个核细胞的分离(优质参考)

实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。 4.Hank,s液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。

树突状细胞培养与鉴定

树突状细胞的培养与鉴定【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原 cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用 gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式 molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting

外周血单个核细胞

外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。 ●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养 PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。 Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 ●工具／原料全血（以10ml为例）无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水蔗糖溶液（FicollPague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) RPMI 1640培养基（Invitrogen）胎牛血清（FBS）（GIBCO）双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）

【整理】外周血细胞形态学检验及诊断技巧

外周血细胞形态学检验及诊断技巧主讲：卫生部北京医院郑天林录制：卫星卫生科技教育网监制：卫生部科教司一.概述（一）血细胞形态学基本概念（二）血细胞形态学检查方法（三）血液学及血细胞形态学临床应用（四）临床/形态学诊断与血液学检验及专业人员素质问题二．血细胞染色法（一）细胞染色机理（二）瑞氏染色（三）姬姆萨染色（四）瑞氏-姬姆萨染色液鉴定（五）瑞氏-姬姆萨混合染色三．形态学与血液检查与自身特性（一）血常规（二）白细胞分类（三）骨髓外周血细胞形态学及分类（四）血细胞涂片特性四．血细胞形态学采样、制片与检查程序（一）采样、制片、染色工序至关重要（二）染色五．外周血细胞形态学检验技巧（一）WBC形态学

（二）红细胞形态学（三）出现有核（内/巨幼）红/幼粒细胞意义（四）血小板巨核细胞六．外周血细胞形态学检查步骤、注意事项及检查报告书写内容（一）注意事项（二）外周血涂片检查步骤（三）外周血涂片报告内容一、概述（一）．血细胞形态学基本概念（二）血细胞形态学检查方法（三）血液学及血细胞形态学临床应用（四）临床/形态学诊断与血液学检验及专业人员素质问题一．概述血细胞形态学是血液病基础诊断与血液学检验的重要项目 ●正常人的血液及造血器官中，各种血细胞的数量有一定的正常范围，不同血细胞及细胞发育的不同阶段有一定形态结构特点。 ●观察血细胞形态和数量及其比例的变化来研究造血器官的结构和功能是血液学的重要组成部分，是诊断造血系统疾病最基本、被临床普遍应用的最简便实用的检查方法。 ●在造血系统疾病发生造血功能紊乱，引起血细胞形态学的量和质的改变。在临床各科某些原发性疾病患者出现继发性血液学形态学的病理改变，籍以了解患者机体状况如感染（细菌、病毒、寄生虫、药物）等反应。 ●血细胞形态学检查是为临产提供诊断依据，应备有患者的临床表现基础检查初步诊断的病历摘要，才能进行形态学检查。必要时还要做骨髓活检（切片、活检材料滚片、活检穿刺针残液图片）细胞化学染色,免疫学表型等检查的必备程序。 ●血细胞形态学检查应包括外周血和骨髓两部分组成，必须平行进行检查。外周血细胞改变往往反映骨髓病变的重要信息，有利于诊断。 ●疑似血液病和血液学检查异常情况不能只依赖使用分析仪做血常规检查而废弃镜下血涂片细

外周血细胞形态检验

外周血细胞形态检验 1.外周血涂片检查步骤：（1）肉眼观察：涂片面膜大小、厚薄是否适中，染色好坏。（2）低倍镜观察全貌： ①涂片及染色好坏； ②了解白细胞数（可大体校对WBC直接计数是否正确）； ③了解白细胞大致分布及其各阶段大致比例，特别要注意由于涂片过力，把WBC及成熟粒细胞大多推于片尾部位，造成分类比值误差。片尾有无异常细胞。 ④选择具有代表性的细胞镜检区域。（3）油镜观察：进行WBC分类计数，观察细胞形态、比例、有无巨大或异常细胞。 ①血涂片对WBC总数准确性估计：从低倍及油镜中估计WBC数及其分布。医|学教育网搜集整理一般区分WBC数几个等级（油镜视野中WBC密度、分散无重叠）。参见WBC形态诊断技巧节段。 ②白细胞分类计数：血中主要两大比例的中性成熟粒细胞与淋巴细胞及其他小比例细胞是否属正常范围及形态有无异常。

③注意片尾端有无巨大或出现不成熟或异常细胞（如中晚幼粒、中晚幼红细胞、异常淋巴细胞、吞噬细胞、肿瘤细胞等）。 ④红细胞形态（群体、个体）、排列（重叠、缗钱状）。 ⑤血小板数量、形态及聚集性。⑥寄生虫。 ●注意事项 1．血膜呈舌状，头、体、尾分明 2.空气中晃动，尽快干燥；37℃恒温箱中促干 3．涂片的厚薄、长度与血滴大小（10~20μl）与血片质量4．1h内染色或在1h内甲醇固定 5.正确清洁玻片 6．抗凝血或毛细血管血涂片；EDTA能阻止PLT聚集 7．抗凝血液4h内涂片，先在低倍镜下浏览全片，了解染色好坏和细胞分布情况，观察有无异常细胞。选择涂片体尾交界处染色良好的区域，在油镜下计数100个白细胞，按其形态特征进行分类计数。求出各类细胞所占百分数。 8.分类时应从血膜体尾交界处边缘向中央依次上下呈城垛状迂回移动，计数使不能重复和遗漏。

人外周血单核细胞分离技术

人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640

细胞培养与细胞生死状态的鉴别

姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者孙琳科目分子细胞生物学目细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号201000232012 【实验目的】 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞技术方法，计算细胞存货率。【实验原理】细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。【实验材料】 1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基 2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红【实验步骤】

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。

外周血细胞形态学检验及技巧

外周血细胞形态学检验及技巧卫生部医院血液科天林卫生部临床检验中心明婷谷小林陆红一．血液学及血细胞形态学临床应用： ●是临床血液病诊断与治疗及临床医学检验学的基础工作。 ●血细胞形态学适用于临床血液病诊断快速简捷的要求。 ●近年来由于血细胞学及超微结构、免疫学、细胞遗传学、融合基因、造血干细胞及其细胞因子、骨髓造血微环境、基质细胞、树突状细胞、淋巴系细胞发生及其疾病表现，细胞增殖动力学与细胞凋亡以及骨髓组织病理学应用，推动了血液的临床与实验室的新知识迅猛发展。 ●当前血液病不能单凭临床与形态学作出诊断，必须以临床和血细胞形态学为基础，将免疫学、细胞遗传学及分子生物学新知识、新技术应用到血液学中，构成现代临床血液学与分子生物学诊断技术，弥补形态学的经验性与主观性带来负面缺陷，才能提高血液病的诊断与治疗水平。 ●进入90 年代以来，国外采用多学科联合技术综合诊断技术与方案： ○FAB-AL （1976 ）、NCL （美国国家癌症研究所）对FAB-AL 分型的补充（1995 ）、AL-MIC 分（类）型，MIC 及MICM 分型（1985-1990 ）； ○FAB-CL 分型（1989 ）、中国CL 分型（1997 ）； ○FAB-MDS 分型（1982 ）、MIC 协作组对FAB-MDS 分型提出补充建议（1987 ）； ○WHO 对造血系统及髓系恶性疾病和淋巴系恶性肿瘤WHO 分类（2000 ）； ●血细胞形态学诊断技术正在进入显微图象软件时期： ○创造出许多多功能软件，如血细胞形态学、细胞化学染色、血液病诊断与鉴别诊断、CL 诊断与治疗及教学系统多媒体软件等。 ○将显微镜与微机相连，应用储存、分类、检索软件，编辑、打印诊断报告，并可附多幅细胞图象。二．血细胞形态学基本概念血细胞形态学作为临床血液病基础诊断：

HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告

HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告前言肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞（fat-storing cell，FSC）、脂细胞（1ipocyte）、维生素A贮存细胞（vitamin A-storing cell）、窦周细胞（perisinusoidal cell）、Ito细胞等。HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型，其功能主要有：（1）代谢和贮存Vitamin A：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。（2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。（3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。目前的研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要合成细胞。正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。HSC 还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。（4）合成基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase, MMP）及其组织抑制剂（tissue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）:正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2等以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。（5）表达细胞因子及受体：正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。

原代细胞培养：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题

Case：新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋白与基因实验设计一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞二、细胞培养分组： a)对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养 b)高糖72h培养 c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养 d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h f)正常培养48h+（氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h 三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。实验报告一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养： 1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小； 2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置； 3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化； 4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃，5％CO2 培养箱中培养； 5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定： 1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min； 2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min； 3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min； 4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜； 5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗（嘉美生物公司）， 37℃条件下放置1h； 6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

人外周血单个核细胞分离液说明书

分离后分离前水平离心血浆层单个核细胞层分离液层红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书货号：P9010/P9011 规格：200mL 产品简介：本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/mL左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090g/mL，血小板为1.030~1.035g/mL。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。产品指标：密度 1.077±0.001g/mL 渗透压 290~350mOsm/kg H2O 无菌 0.1μm 滤膜过滤保存条件：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血。 2.在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意

保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。 5.小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心 10min。 6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h以内），为保持单个核细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。 E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。 F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件。 G.吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加；吸取过多的血浆层可能会导致单个核细胞中血浆蛋白及血小板污染。

海马细胞培养与鉴定

3.1海马原代培养操作准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把，小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打

↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定：取培养7-9天的细胞海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。

神经干细胞培养与鉴定

．1神经干细胞的原代培养 1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。 2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔组织后，放入D．Hanks液中冲洗。．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。收集细胞悬液后先后在100目和200 目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。 4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。 5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活) ．2神经干细胞的传代大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d 后成为悬浮生长的神经球。将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心 5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。 Nestin免疫组化检测步骤： 1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清； 2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟； 3)PBS浸洗3min 2次，去上清； 4)Triton液破膜10 min； 5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。自然干燥，让细胞贴在载玻片上； 6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶； 7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。甩去多余液体，不洗； 8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。C过夜。PBS 洗2 min 3次； 9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min； 10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3 次，每次5min； 11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色；研究论文 12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲