分子生物学期末复习资料

DNA的一级结构:DNA碱基排列顺序（生物学定义）; 由A、T、G、C四种脱氧核苷酸组成，通过3’-5’-磷酸二酯键连接成的线形结构。（化学定义）组成：1功能较明确的序列①编码序列：与代谢有关的序列、调控蛋白（阻遏蛋白）②调控序列（基因表达水平由调控蛋白和调控序列决定）2功能不明确的序意义：蕴藏遗传信息；决定DNA的二级结构和空间结构；二级结构和空间结构将成为弄清生命遗传奥秘的主要领域之一。

DNA二级结构双螺旋模型的特点：(1) DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋(2) 糖一磷酸键是在双螺旋的外侧，碱基对位于内侧，与轴线垂直，与糖一磷酸骨架近于垂直。(3) 碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶(4) DNA双螺旋有大沟和小沟的存在。DNA二级结构的稳定因素(1)碱基对之间的氢键。(2)碱基的堆集力。二者协同作用影响DNA双链构象的因素：1）碱基组成及顺序；2）盐的种类；3）相对湿度。DNA的三级结构是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，是指双螺旋基础上的卷曲。三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状DNA中的连环体。

原核生物基因组结构特点：①拟核（类核）结构；②除rRNA基因外，基本是单一拷贝的；利于核糖体的快速组装，短时间内合成大量核糖体。③非编码序列相对较少；④多顺反子结构；

真核生物核基因组：①基因组较大；②真核生物核DNA与蛋白质结合，形成核小体，再缠绕成染色体；③基因组一般为双倍体;④基因组中非编码序列多于编码序列，有大量的冗余DNA；⑤存在大量重复序列，重复次数可高达百万倍；⑥基因为单顺反子。一个基因单独转录，一个基因一条mRNA, 翻译成一条多肽链；⑦大部分基因有内含子，因此基因不连续；

⑧具有基因家族。(重复性、基因家族、不连续性。)

简述原核和真核生物mRNA的区别？

原核生物mRNA的特征:

A、半衰期短

B、多以多顺反子的形式存在

C、单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。

D、多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA；

E、5’端无“帽子”结构，3’端没有或只有较短的poly（A ）结构；

F、SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。真核生物mRNA的特征:

a、5’端存在“帽子”结构

b、多数mRNA 3’端具有poly（A ）尾巴（组蛋白除外）C、以单顺反子的形式存在

病毒基因组、原核生物基因组、真核生物基因组核酸复制特点。

答：DNA复制基本特点：①复制都有固定起始点，②复制过程中形成复制泡和复制叉，③复制基本单位是复制子，④复制是半保留复制，保证遗传信息忠实传递，⑤复制是半不连续复制，克服了DNA空间结构对DNA新链合成的制约。

原核生物有特定复制起点和终点结构，只有一个复制起点；在起始点上可以连续开始新的复制；复制过程都是DNA双链复制，也有Θ复制、滚环复制、D环复制等方式。

真核生物复制需要解开和重装核小体结构；复制过程中的引物及冈崎片断长度小于原核生物；有多个复制位点；需要特殊机制复制端粒，涉及逆转录；一次复制完成以前不会启动新一轮复制；线粒体DNA以D环模式进行复制。

不同病毒的基因组核酸以不同模式进行复制。单链环状DNA可通过成环滚环模式复制，双链环状DNA可通过不同方式复制，有些病毒双链环状DNA通过RNA中间体进行复制，病毒线性DNA利用特殊末端起始引物复制，RNA病毒通过RNA复制过程复制。

分子标记（Molecular Markers），是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。

根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交（印迹杂交）为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；

⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。

基因芯片技术（原理）

基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TA TGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

启动子/ 终止子。均为真核生物基因两侧不能被转录且对基因表达、调控有重要作用的序列。启动子是能与RNA聚合酶结合并起始转录的核苷酸序列，包括TA TA盒、CAAT盒、GC盒一组序列，一般位于基因转录起始点上游-100～-200碱基对范围；终止子是提供转录停止信号的DNA序列，当mRNA转录到此部位后，产生poly(U),被结合在RNA聚合酶上的延长因子识别并与其结合，促使RNA聚合酶与DNA模板解离，终止转录。

顺式作用元件/ 反式作用因子。均为真核生物基因中的转录调控序列。顺式作用元件是与结构基因表达调控相关、能被基因调控蛋白特异性识别和结合的特定DNA序列，包括启动子和上游启动子元件、增强子、反应元件和poly（A）加尾信号。反式作用因子是能与顺式作用元件特异性结合、对基因表达的转录起始过程有调控作用的蛋白质因子，如RNA 聚合酶、转录因子、转录激活因子、抑制因子。

DNA损伤及其修复的主要方式。

答：DNA损伤形式有：交联、DNA链断裂、碱基突变、DNA重组等。

①交联包括链内共价交联(碱基之间)和链间共价交联（链与链之间）。

②DNA链断裂指DNA链内磷酸二酯键断裂。

③碱基突变包括单点突变和多点突变。点突变分为转换（同型碱基替代）和颠换（异型碱基替代），此外还有缺失（核苷酸丢失）、插入（核苷酸增加）、倒位（核苷酸序列方向倒转）。

④DNA重组指DNA分子内发生较大片段的交换。

DNA损伤修复机制有：

①直接修复。如：DNA断裂口在链两端未损伤情况下可由连接酶直接修复，二聚体可被光复活酶直接修复，烷基化碱基可直接修复。

②切除修复。可分为单个核苷酸切除修复和核苷酸片段切除修复。

③重组修复。即先进行复制再进行切除修复。

④SOS修复。是DNA损伤严重时的应急性修复方式。

⑤细胞周期检查点控制是真核生物诱导修复的主要机制。

原核生物基因表达转录环节的调控模式、调控方式。

答：基因表达调控的环节，主要在转录水平。多种因素以特定的方式影响转录。

①启动子决定转录的效率与方向及模板链。

②σ因子的种类与浓度调节基因的表达。

③负调控：阻遏蛋白结合于DNA后抑制转录，分为诱导和阻遏2种情况。

④正调控：调控蛋白结合于特定DNA序列后促进基因的转录。CAP蛋白调节糖代谢相关基因的表达；ntrC蛋白调节氮代谢相关基因的表达。

⑤倒位蛋白通过DNA重组倒位调节基因表达。

⑥RNA聚合酶抑制物可与RNA结合并抑制转录。

⑦衰减子减弱转录。

真核生物基因表达各环节的基本要素。真核生物基因表达调控的环节及其主要特征。

答：真核生物基因表达共有7个环节：

①转录起始。RNA聚合酶在转录因子帮助下识别和结合启动子，形成转录起始复合物。

②RNA延伸。RNA聚合酶开始依碱基配对关系按模板链碱基序列加入核糖核苷酸。

③转录终止。RNA聚合酶ⅠⅢ均有对应的终止信号，RNA聚合酶Ⅱ没有明确中止信号。

④转录产物的加工。mRNA前体加工：5`端加帽→3`端加尾→剪接→化学修饰→编辑; tRNA前体加工：剪接去除内含子→剪切5`端先导序列→添加或修复3`端CCA→化学修饰。rRNA前体加工：前体剪接→化学修饰。

⑤RNA跨核膜运输。mRNA与多种蛋白质合成核蛋白颗粒，rRNA前体在核仁合成并被加工成熟后，与核糖体蛋白形成核糖体，从胞核运到胞质。

⑥翻译。翻译起始阶段：起始复合物前体形成→起始复合物前体与mRNA结合形成起始复合物→40亚基―Met―tRNA复合物沿mRNA扫描→40亚基―Met―tRNA复合物识别密码子。延长阶段：氨基酸活化与搬运→延长因子→肽链延伸（进位、转态、移位）。终止阶段：释放因子RF识别终止子。⑦翻译后加工。肽链折叠、肽链中氨基酸共价修饰、肽链水解修饰、亚单位聚合。

真核生物基因表达的调控是多级调控，可发生在：DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平。

①DNA水平：基因丢失、基因扩增与放大、基因重排、低甲基化、转座与致癌基因的表达。

②转录水平：转录起始复合物的形成是转录可调控环节、反式作用因子是真核细胞重要基因表达调控蛋白、转录起始是由多种激活的反式作用因子复合调控。

③转录后水平调控：5`端加帽和3`端加尾有调控意义、mRNA的选择剪接可调控基因表达、mRNA运输控制调节进入细胞质的mRNA量。

④翻译水平：某些mRNA翻译起始可受特定因素调控、mRNA稳定性调节蛋白质合成水平、小分子mRNA可调控翻译效率。

翻译后水平：新生肽链水解影响蛋白质含量、肽链中氨基酸共价修饰是快速调节方式、通过信号肽分拣、运输、定位影响蛋白质功能发挥。

PCR技术的基本原理、反应体系构成及其优化，PCR优化的条件，主要应用。

答：原理：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能被激发出荧光。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5`端和3`端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，反复重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。参与PCR反应体系的因素：①模板核酸；②引物；③缓冲液④Tag DNA聚合酶；

⑥Mg 2＋；⑥dNTP；⑦反应温度与循环次数；⑧PCR仪等。

应用：①目的基因克隆，②基因体外突变，③DNA微量分析④mRNA含量分析。可应用于遗传病的基因诊断；肿瘤的诊断、转移确定；组织器官移植的配型选择等等。

优化条件: ①Mg2+－降低浓度阻止非特异和不想要的PCR产物。增加浓度赢得更多的产量。EDTA螯合Mg2+，因而可以改变Mg2+的浓度。

②DNA模板浓度－为了减少Taq DNA聚合酶的产生错误的可能性，使用更高浓度的DNA。但是使用太多可能增加污染物的量，降低反应效率。

③聚合酶－与Pfx相比较，TaqDNA聚合酶具有更高的错配率（没有可以进行校正的3’到5’外切酶活性）。如果需要高保真度，可以使用Pfx。Taq酶倾向在3’末端增加非模板的A.为了提高效率，可以额外增加酶的量（由于Taq酶可能在重复的循环中损耗），然而这可能增加非特异的PCR产物.

④dNTP－可以使用高达1.5mM dNTP。dNTP螯合Mg。过高dNTP可能增加错配率。降低dNTP的浓度（10-50μM）可以减少错配率。大PCR片段比小的片段要求更多的dNTP。

⑤引物－可以使用高达3μM的引物。高引物模板比可能导致非特异扩增和引物二聚体的形成。小批量分装储存引物，以避免多次反复冻融。

⑥热循环－如果模板GC含量高，增加变性的时间。对于较大的PCR片段应该增加延伸的时间，但是这可能会对酶造成损害。如果模板DNA的量非常低，增加循环的次数，如果模板DNA的量大，减少循环次数。

⑦PCR缓冲液－更高浓度的缓冲液可以用来提高反应的效率。

基因工程载体基本概念、基本条件，基因工程常用载体的特点及主要用途。

答：载体：携带靶DNA片段（外源DNA片段）进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

克隆载体：主要用来获得大量纯化的目的DNA片段（目的基因），以便进一步研究其结构

和功能。

表达载体：主要用来产生插入基因和mRNA，进而合成相关蛋白质。

载体基本条件：①能自主复制；②具备筛选标记；

③适当大小的分子量和适当限制性内切酶酶切位点；④在细胞中拷贝数高；

⑤应配备有与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、加尾信号、增强子等调控DNA元件

常用的载体：质粒、噬菌体、病毒载体等

①质粒载体。用途：保存和扩增片段小于2kb的DNA、构建cDNA文库、目的DNA测序、制备探针。特点：分子量较小，能在细菌内稳定存在；具有多个遗传标志，能对宿主细胞选择；具有多个限制性内切酶单一切点，便于外源基因插入。缺点：所能接受的DNA片段容量小；转化效率低。

②噬菌体载体，包括插入型载体和置换型载体。用途：重要的基因组文库和cDNA文库克隆载体。优点：能携带的外源DNA片段更长，感染能力也大于质粒载体。缺点：进行真核基因组文库构建时，其容量仍然受到一定的限制。

③粘粒载体。用途：根据载体携带的抗药性标记筛选阳性克隆细胞株。特点：含质粒抗药性标记和自主复制成分，可在细菌内大量扩增；带粘性末端区，可体外包装；有多个限制性内切酶酶切位点；本身不大；重组体的本底很低，有利于筛选。

④BAC。特点：与标准质粒载体相似，但有不同的ori和编码ori蛋白的F因子、可容纳大于300kb的外源DNA、重组子可通过电脉冲穿孔高效导入细菌细胞、进入细胞的拷贝数低。

⑤Y AC。用途：人类基因组计划中作物理图的工具。优点：酵母是真核细胞能克隆真核基因序列尤其是重复序列、能克隆很大的DNA片段（2Mb）。缺点：转化效率低，形成的克隆数少，每个细胞仅含一个拷贝。