毒品苯环利啶PCP单克隆抗体的制备及鉴定
云南大学学报(自然科学版),2003,25(增刊):217～219CN53-1045/N ISSN0258-7971 Journal of Yunnan U niversity
Ξ毒品苯环利啶(PCP)单克隆抗体的制备及鉴定
马 涛,吕 琦,马 岚
(云南大学单克隆抗体工程技术中心,云南昆明 650091)
摘要:将毒品苯环利啶(PCP)与牛血清白蛋白(BSA)偶联形成复合抗原免疫Balb/c小鼠,获得6株稳定分泌抗PCP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.它们的腹水效价在1∶105～1∶106.抗体类型鉴定结果表明,属
于IgG1,κ型.这些抗PCP单抗均可用于毒品的免疫检测.
关键词:毒品;苯环利啶;单克隆抗体;酶联免疫吸附测定
中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2003)S-0217-03
苯环利啶(Phencyclidine,PCP)是毒品中的一种,被归为具有致幻作用的神经活性药物.在欧美、亚洲年轻的吸毒者中甚为流行,被称为“天使粉”.该致幻剂能影响中枢神经系统,引起感觉和情绪上的变化,导致自我歪曲和思维分裂,使人脱离现实,有时还可能引起精神病行为[1,2],严重影响人们的身体健康和生命安全.毒品问题一直是危及全球人类的、亟待解决的严重社会问题[3].人们在呼吁严打重治贬卖毒品者的同时,迫切需要解决现场快速检测毒品的问题.
利用毒品和毒品代谢物的抗体来检测吸毒者尿液中的抗原物质(毒品和毒品代谢物)是毒品检测中较为常用的免疫检测方法,其中免疫层析检测试纸是目前新兴的、可方便快速准确地检测毒品的方法.而应用单克隆技术获取抗体是研制免疫层析检测试纸的关键.
由于PCP分子较小,不易引起小鼠产生相应的体液免疫学反应,本研究以PCP与牛血清白蛋白(BSA)共价连接的结合蛋白PCP-BSA为免疫原,通过免疫Balb/c小鼠,用聚乙二醇细胞融合法获得了6株稳定分泌抗PCP单抗的杂交瘤细胞株,并对其进行了鉴定.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和实验动物 NS-1骨髓瘤细胞,自本实验室.Balb/c小鼠,自北京实验动物中心.
1.1.2 主要试剂 DM EM培养基和小牛血清FBCS(Hyclone);HA T和HT(G ibco);聚乙二醇PEG(Fluka);G oat-anti-mIg G-HRP(Pierce); PCP-BSA(Arista);抗体亚类检测试剂盒(晶美生物技术有限公司).
1.1.3 主要设备 酶标仪(TECAN);CO2培养箱;紫外分光光度计(Beckman,Du640).
1.2 方法
1.2.1 小鼠免疫 取4～6周龄的Balb/c小鼠,以PCP-BSA进行免疫,皮下多点基础免疫2次,免疫剂量为50μg/只,8d后鼠尾取血进行免疫效果的检测,2周后,脾内注射法进行加强免疫,免疫剂量为100μg/只.
1.2.2 细胞融合、筛选与克隆 取免疫效果好的小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞以5∶1的比例按常规方法[2]进行融合.HA T选择培养基进行筛选,待克隆生长增殖至1/3或1/2孔时,进行抗体检测,即EL ISA检测培养上清中是否含有所需的特异抗体存在,确定杂交瘤细胞的阳性克隆情况.确定了阳性克隆后,按常规方法进行扩增和冻存.然后选取阳性值较高的细胞克隆进行有限稀释法单克隆化培养.
1.2.3 单抗效价测定 采用间接EL ISA法测定.即以BSA-PCP复合抗原包被酶标板,并设空白对照,37℃包被过夜,0.05%Tween-20的磷酸盐
Ξ收稿日期:2003-03-02
作者简介:马 涛(1972- ),女,云南人,回族,硕士生,主要从事生物技术方面的研究.
缓冲液(PBS-T)洗5次.用1%BSA-PBS-T37℃封闭2h,PBS-T洗5次.加入待测样,以封闭液梯度稀释(10-1～10-8),并设空白、阴性、阳性对照孔,37℃孵育1h,PBS-T洗5次.加入抗鼠Ig G酶标二抗,37℃孵育1h.PBS-T洗5次, d2H2O洗3次.OPD-H2O2底物显色系统显色5～10min,测定OD值.
1.2.4 单抗类别鉴定 采用间接EL ISA法测定.二抗分别为抗鼠Ig G酶标抗体和抗鼠IgM和IgA 酶标抗体.其余操作同上述1.2.3.
1.2.5 杂交瘤细胞株的染色体分析 按常规方法[4]进行.
1.2.6 小鼠腹水的制备 选取10周龄的BALB/C鼠,腹腔注射石蜡油,剂量为0.5mL/只.7～10d后腹腔注射已克隆化的阳性杂交瘤细胞,数量为1.15×106～1.3×106/只;接种细胞7～10d 后抽取腹水,每隔2d放取1次,直至小鼠死亡;所收集的腹水1000r/min离心10min,收集上清,检测抗体效价,并于-20℃保存备用.
2 结 果
2.1 小鼠血清抗体效价检测 检测结果见表1.从表1的结果可知,2只免疫鼠的血清抗体效价都达到了10-6,说明免疫效果较好.
2.2 杂交瘤细胞株的建立 用PCP-BSA免疫鼠进行细胞融合,融合率为11%,用间接EL ISA 筛选,取OD值高的阳性孔细胞进行2次有限稀释,阳性率达100%,获得了6株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(1B2a1,1D5a2,2H8a2,3G3a 2,6F12a1,6F12a2).
2.3 细胞克隆化培养过程中细胞上清的EL ISA 检测 检测结果见表2.
表1 免疫小鼠血清抗体效价
Tab.1Anti-PCP antibody titers of sera from immunized mice
免疫鼠
血清抗体效价
10-110-210-310-410-510-610-710-8 1++++++--2++++++--
表2 E L ISA检测培养细胞上清中PCP抗体滴度
Tab.2Anti-PCP antibody titers of supernatants from cultured cell lines by EL ISA
母细胞株OD值一次克隆化
细胞株
OD值
二次克隆化
细胞株
OD值
1B2 1.5721B2-5E8 1.6431B2a1 2.167 1D5 1.6131D5-6B11 1.6221D5a2 1.712 2H8 1.3752H8-14C8 1.7272H8a2 1.747 3G3 1.5393G3-42A12 1.8053G3a2 1.985
6F12 1.6536F12-23C6 1.8986F12a1 1.932 6F12a2 1.966
由上表可知,最终所获得的6株杂交瘤细胞株的OD值都在1.7以上,说明其分泌抗体的能力较强,在克隆化培养过程中,其OD值都呈稳定升高趋势,说明细胞株分泌抗体的稳定性良好.
2.4 核型分析结果 其结果见图1.其结果表明,杂交瘤细胞的染色体众数在90～97条之间,在NS-1(54～64条)骨髓瘤细胞染色体数和脾细胞(40条)染色体数之和的范围内,说明杂交瘤细胞株具有稳定分泌抗体的能力.
2.5 单抗类型的鉴定 按标准方法进行间接
812云南大学学报(自然科学版) 第25卷
EL ISA 检测,6株单抗类型均为Ig G 1,κ型.2.6 腹水收获情况 其结果见表3
.
图1 6株杂交瘤细胞株核型分析
Fig.1K aryotypes of 6hybridoma cell lines
结果显示,所获得的6株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白,且抗体效价均在
10-5以上.
表3 收获腹水的蛋白质量浓度及抗体效价
Tab.3Protein concentrations and antibody titers of acsites
杂交瘤细胞株
腹水蛋白质量浓度
/(mg ?mL -1)
腹水抗体效价
1B 2a 131.4010-51D 5a 226.5510-5
2H 8a 228.5310-5～10-6
3G 3a 228.5610-5
6F 12a 125.4410
-5～10
-6
6F 12a 2
25.39
10-
5
3 讨 论
毒品检验是刑事科学技术的重要组成部分,是揭露和证实贩毒等毒品犯罪行为的重要技术手段.具有十分重要的情报作用[5]
.自上世纪70年代以来,国外连续报道了许多毒品检测方法,其中以理化检测法居多,包括薄层层析法,气相色谱法、气-质联用法、红外分光光度法以及高效液相色谱法等,这些方法主要用于尿液样本中毒品及其代谢物的鉴定,具有简便、快速、准确等特点,但需要依赖一些价格昂贵的检测仪[6].
免疫学检测是毒品检测的另一发展方向.毒品
免疫检测已经历了3个发展阶段[6],酶联免疫吸附法是第1代免疫检测法,检测时步骤冗长,试剂繁多,操作很不方便,且实验的重复性较差.上世纪80年代末,第2代免疫检测法(渗滤法)开始走向市场,它以免疫斑点印渍法(Dot immunoblotting ,DIB )为原理,用印渍纸代替96孔酶标板,该法灵敏度和特异性与EL ISA 相似,但抗体用量少(只需几微升),操作较简便、快速,但仍存在着需附加几种试剂的不足.随着免疫学方法的快速发展和更新换代,如今免疫检测技术的应用已可不依赖于任何仪器设备,达到简便价廉、准确快速,甚至家庭自测的诊断目标.第3代毒品免疫检测法———免疫层析检测试纸便是以此为目标诞生的.它应用胶体金法,将免疫亲合技术、印渍术和薄层层析技术相结合.使用时,只需将试条下端直接插入样本溶液中,2～5min 即可判断结果,可以说是目前最简易、快速的检测方法.
无论是哪种免疫检测法,都需获得性质均一,稳定的单抗.我们所获得的6株杂交瘤细胞,经染色体分析和EL ISA 鉴定,均具有稳定分泌抗PCP 单抗的能力,由它们所制备的腹水均可收获较高质量浓度的蛋白(25～31mg/mL ),而且抗体效价都较高,为10-5以上.通过纯化,应完全能满足上述免疫检测的需要.结合本试验室拥有的金标技术,将可进行毒品检测试纸条的研制和生产.
参考文献:
[1] 刘 耀,斐 相.毒品及毒品鉴定[J ].中国法医学杂
志,2000,15(2):125—128.
[2] 梁军成,郑继旺.苯环利啶的作用机制[J ].中国药物
依赖性杂志,1999,8(3):164—168.
[3] 蔡志基.全球毒品问题的现状与动向[J ].中国药物依
赖性杂志,1999,8(1):6—10.
[4] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M ].北京:科学出版
社,2001.
[5] 苗翠英,王建伟.试论毒品检验在禁毒中的情报作用
[J ].云南公安高等专科学校学报,2000(4):44—46.[6] 李 莉,吴福根.毒品的免疫检测方法研究进展[J ].
法医学杂志,1997,13(4):245—246.
(下转第227页)
9
12增刊 马 涛等:毒品苯环利啶(PCP )单克隆抗体的制备及鉴定
[2] 陈 云,张富春,陈幼珍,等.恒河猴CG
β亚基(rmCG β)DNA 在HeLa 细胞中的表达及其对小鼠免
疫反应的诱导[J ].动物学报,2001,47(4):419—424.
[3] 郑亦辉.动物激素及应用[M ].南京:江苏科学技术出
版社,1996.
[4] 陈晓丽,潘善培,芦春斌,等.重组质粒βhCG -Ppic9K
的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris )的转化[J ].暨南大学学报(自然科学版),2000,21(5):116—121.
[5] MICHAEL G ,GREG OR Y W ,ANN ETTE G ,et al.G e 2
netic immunization with the free human chorionic go 2madotropin βsubunit elicit cytotoxic t lymphocyte re 2sponses and protects against tumor formation in mice [J ].Laboratory Investigation ,1997,76(7):859—871.[6] 余传霖,叶天星,陆得源,等.现代医学免疫学[M ].上
海:上海医科大学出版社,1998.
[7] 薛庆善.体外培养的原理与技术[M ].北京:科学出版
社,2001.
[8] 郭葆玉.细胞分子生物学实验操作指南[M ].上海:第
二军医大学出版社,1998.
[9] 曾蓉芳.单克隆抗体妊娠试剂的研制-四种hCG
McAb 的特性分析[J ].中国免疫学杂志,1986,2(6):362—365.
[10] 赵宜为,杨朝辉,杜正军,等.抗人绒毛膜促性腺激素
(hCG )避孕疫苗的研制[J ].中国生物制品学杂志,1998,11(2):65—67.
[11] 颜建华,Vernon C S ,吴建华,等.分子改进后人绒毛
膜促性腺激素β链C -末端肽免疫活性的初步观察
[J ].生殖免疫学杂志,2000,9(2):92—95.
[12] 王 健,沈卫英,周清平,等.人绒毛膜促性腺激素β
亚基羧基端37肽四聚体基因在E.Coli 中的表达
[J ].生殖免疫学杂志,2000,20(3):137—141.
G eneration and identification of monoclonal antibody against human
chorionic gonadotropin βsubunit
XIAO Xue ,LV Qi ,MA Lan
(Monoclonal Antibody Technology Center of Yunnan University ,Kunming 650091,China )
Abstract :To generate monoclonal antibody against human chorionic gonadotropin βsubunit (hCG -β),Balb/c mice were immunized with hCG protein and 4of hybridomas were obtained by using cell fusion and
limited dilution techniques.The types of all antibodies were identified as M Ig G1and M Ig (κ)by EL ISA and all of the titers of acsites were 10-6respectively.
K ey w ords :human chorionic gonadotropin βsubunit (hCG -β);monoclonal antibody (McAb );enzyme
linked immunosorbent assay (EL ISA )
33333333333333333333333333333333333333333
(上接第219页)
Preparation and identification of monoclonal antibidies
against phencyclidine (PCP )
MA Tao ,L U Qi ,MA Lan
(Monoclonal Antibody Technology Center of Yunnan University ,Kunming 650091,China )
Abstract :6hybridomas were obtained by immunization of Balb/c mice with PCP -BSA.The titers of ac 2
sites were between 1∶105～1∶106.The types of all antibodies were identified as M Ig G 1/M Ig (
κ)in EL ISA.They all could be used in drug of abuse (DOA )immunoassay.
K ey w ords :drug of abuse (DOA );phencyclidine (PCP );monoclonal antibodies (McAbs );enzyme linked immunosorbent assay (EL ISA )
7
22增刊 肖 雪等:人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG -β
)单克隆抗体的制备及鉴定
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
实验室毒品鉴定基本程序
（一）取样的基本要求 正确采集毒品检样是鉴定成功的前提与保证，应根据不同种类的检样及时、全面采集。 由于实验室中检验毒品的多数方法（包括定性、定量检验）需要的试样较少，完成一个毒品试样的鉴定，一般来说，最多只需要I克样品，而且多年的办案实践证明，缉查的可疑毒品多数为混合物，所含成分复杂。如鸦片中含有吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁等几十种生物碱；海洛因除含吗啡衍生物外， 还含有咖啡因、扑热息痛等掺杂剂；摇头丸的成分 更加复杂，包括苯丙胺类毒品及其衍生物，大部分还含有氯胺酮、咖啡因。因此，能否合理取样，使其有较理想的鉴定性，关系到在毒品犯罪案件中，对采集的样品的鉴定结果能否代表缉查缴获的可疑物品的全部，从而直接影响鉴定结果的法律意义。 取样一般由禁毒部门的办案民警完成，特殊情况可邀请技术部门人员进行取样。取样应遵守以下原则： （1）无论是定性还是定量分析，所取样品必须具有代表性、全面性和均匀性。 （2）取样应当面进行，由两名以上的民警共同完成，并由在场民警、见证人和毒品违法犯罪嫌疑人签字后当场封存。也可邀请有关群众或协作地公安机关派人在现场监督并签名。 （二）检材的采集数量 一般而言，精制型毒品，如海洛因、冰毒、吗啡及可卡因等，需采集~ lg。植物型毒品，如鸦片、大麻及古柯叶等，需采集1 —5g。液体型毒品：若为纯品，需采集1—5ml;若为混合品，需采集10~ 50ml （盛装液体的瓶子不要装满，要留有1/3?1/4空间）。 （三）单包装毒品的采集规则 取样时，除去外包装物，将样品转移到干净的塑料袋或器皿中。称重量并记录其净重。 （1）细粉末。混合均匀后，以锥形四分法取样。具体操作为：将样品置于干净的平面器皿、塑料膜或白纸上，样品堆成圆锥形并压平，然后在样品上划“十”字，将样品分为四部分，取任意两个对角部分的样品为采集样，剩余部分放回原包装物。（2）带颗粒粉末。将颗粒压成粉末，过筛混合均匀，以锥形四分法取样。 （3）均匀颗粒。以锥形四分法取样。 （4）黏稠膏状物。将样品搅拌均匀后取样。（5）块状物。 ①全重小于500g。各个面取样粉碎混合均匀，以锥形四分法取样。 ②全重1000~ 2000g。样品呈十字形切开，各个面取样后合并为采集的样品，并以锥形四分法取样。 ③全重大于2000g。样品呈十字形切开，各个面取样后合并为采集的样品，并以锥形四分法取样。 6）片剂和胶囊。 ①1?50片。任意取总数的1/2，碾碎过20目筛并混合均匀。②50 N100片。任意20片，碾碎过20目筛并混合均匀。 ③101~1000片。任意30片，碾碎过20目筛并混合均匀。 ④大于1000片。总数开平方后取最大整数，碾碎过20目筛并混合均匀。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
关于办理毒品犯罪案件审查判断证据
关于办理毒品犯罪案件审查判断证据若干问题的规定 为提高毒品犯罪案件证据质量，依法、公正、规范地办理毒品犯罪案件，有效地打击毒品犯罪，尊重和保障人权，根据《中华人民共和国刑法》、《中华人民共和国刑事诉讼法》等有关法律规定，结合司法实际，制定本规定。 一、一般规定 第一条办理毒品犯罪案件，必须严格执行刑法和刑事诉讼法，切实做到事实清楚，证据确实、充分，诉讼程序合法，适用法律正确，确保案件质量。 第二条认定案件事实，必须以证据为根据。 第三条公安机关、人民检察院和人民法院应当各司其职，各尽其责。上级公安机关、人民检察院和人民法院应当加强对下领导和监督指导，确保准确有效地执行法律。侦查人员应当严格依法全面、客观收集证据，检察人员应当严格依法审查、核实证据，审判人员应当严格依法认定、采信证据。 省公安厅、省检察院和省法院相关业务部门应当加强联系沟通，积极协调解决毒品犯罪案件办理工作中存在的突出问题，及时提出相关意见和措施。第四条应查清犯罪嫌疑人、被告人的身份。确定犯罪嫌疑人、被告人的身份，应由其户籍所在地派出所出具户籍证明，加盖户籍专用章，必要时应通过同案犯、家属、村委会、社区（街道）或者其所在单位人员辨认等方式加以确认。 第五条应查清犯罪嫌疑人、被告人是否有前科犯罪，是否构成累犯、毒品再犯。证明犯罪嫌疑人、被告人构成累犯、毒品再犯的证据材料应当包括前罪的生效裁判文书、释放证明等材料；材料不全的，人民检察院应当要求侦查机关提供。 如果前科犯罪涉及剥夺政治权利，而释放证明中未注明剥夺政治权利是否变动的，必要时侦查机关应调取刑罚执行机关相关证据，证明是否存在减免剥夺政治权利的情形。 对于经审查没有前科犯罪的，应当将《前科犯罪情况查询表》等相关材料附卷，并加盖办案单位的印章，由办案人员签名，不能仅以侦查机关出具的情况说明作为依据。
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
《实验室毒品鉴定基本程序》
《实验室毒品鉴定基本程序》《毒品检测与鉴定教程》作者：周向阳 一、毒品鉴定的取样 （一）取样的基本要求 正确采集毒品检样是鉴定成功的前提与保证，应根据不同种类的检样及时、全面采集。 由于实验室中检验毒品的多数方法（包括定性、定量检验）需要的试样较少，完成一个毒品试样的鉴定，一般来说，最多只需要l克样品，而且多年的办案实践证明，缉查的可疑毒品多数为混合物，所含成分复杂。如鸦片中含有吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁等几十种生物碱;海洛因除含吗啡衍生物外，还含有咖啡因、扑热息痛等掺杂剂;摇头丸的成分更加复杂，包括苯丙胺类毒品及其衍生物，大部分还含有氯胺酮、咖啡因。因此，能否合理取样，使其有较理想的鉴定性，关系到在毒品犯罪案件中，对采集的样品的鉴定结果能否代表缉查缴获的可疑物品的全部，从而直接影响鉴定结果的法律意义。 取样一般由禁毒部门的办案民警完成，特殊情况可邀请技术部门人员进行取样。取样应遵守以下原则： （1）无论是定性还是定量分析，所取样品必须具有代表性、全面性和均匀性。 （2）取样应当面进行，由两名以上的民警共同完成，并由在场民警、见证人和毒品违法签字后当场封存。也可邀请有关群众或协作
地公安机关派人在现场监督并签名。 （二）检材的采集数量 一般而言，精制型毒品，如海洛因、冰毒、吗啡及可卡因等，需采集0.1~lg。植物型毒品，如鸦片、大麻及古柯叶等，需采集1—5g。液体型毒品：若为纯品，需采集1—5ml;若为混合品，需采集10~50ml （盛装液体的瓶子不要装满，要留有1/3～1/4空间）。 （三）单包装毒品的采集规则 取样时，除去外包装物，将样品转移到干净的塑料袋或器皿中。称重量并记录其净重。 （1）细粉末。混合均匀后，以锥形四分法取样。具体操作为：将样品置于干净的平面器皿、塑料膜或白纸上，样品堆成圆锥形并压平，然后在样品上划“十”字，将样品分为四部分，取任意两个对角部分的样品为采集样，剩余部分放回原包装物。（2）带颗粒粉末。将颗粒压成粉末，过筛混合均匀，以锥形四分法取样。 （3）均匀颗粒。以锥形四分法取样。 （4）黏稠膏状物。将样品搅拌均匀后取样。（5）块状物。 ①全重小于500g。各个面取样粉碎混合均匀，以锥形四分法取样。 ②全重1000~xxg。样品呈十字形切开，各个面取样后合并为采集的样品，并以锥形四分法取样。 ③全重大于xxg。样品呈十字形切开，各个面取样后合并为采集的样品，并以锥形四分法取样。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
毒品的辨别与危害
每个吸毒人员对毒品成瘾时间的快慢，往往与其所使用毒品的性质、类别、毒性的强弱、吸毒的方式、吸食的剂量、次数和吸毒者个人的心理素质、身体耐受程度以及文化素质、社会环境等诸多因素直接有关。一般来讲，毒性强的成瘾快，毒性弱的成瘾慢。吗啡、海洛因，如采用静脉注射的方式，每天两次，每次0．1克，2至3天即可成瘾。 1、吸毒容易成瘾：吸毒，是指非医疗用途，强迫性地要连续或定期使用毒品、麻醉药品与精神药品的行为，是一种慢性中毒的成瘾状态。吸毒在医学生叫做“药物滥用”。吸毒方式有口服、鼻吸、烫吸、烟吸以及将毒品溶解后作皮下．、肌肉和静脉注射等。由于医疗上用药不当造成麻醉药品和精神药品成瘾，叫做“医疗性药物滥用”。 毒品的成瘾性是指人对毒品产生强烈的渴求欲望，并反复地使用毒品，以取得快感，或避免出现痛苦，使吸毒者处在一种特殊的精神和身体病态状况。毒品成瘾可分精神依赖性和身体依赖性两种。 (1)精神依赖性 精神依赖性亦称心理依赖性，俗称“心瘾”。这是毒品对中枢神经系统作用所产生的一种特殊的精神效应，毒品使用者处于一种追求使用毒品的强烈欲念下，有一种“渴求”，这种欲念强迫吸毒者不顾一切地去寻求毒品，以满足自己的欲望。这样做一方面为了享受毒品所带来的“欣快”，另一方面也是为了避免一旦戒断毒品所带来难以忍受的痛苦，即戒断症状。这两方面因素使吸毒者身不由已，陷入不能自拔的毒品滥用深渊。 (2)身体依赖性 身体依赖性又叫生理依赖，这是中枢神经系统对长期使用成瘾性毒品所产生的一种适应性状态。这时候身体必须在足量毒品维持下，才能保持正常状态，一旦停止使用毒品后，生理功能就会发生紊乱，出现一系列严重反应，称戒断症举。以海洛因为例，其戒断症状表现为哈欠、流泪、流鼻涕、皮肤起鸡皮疙瘩，出汗、睦孔散大，肌肉、骨、关节疼痛，寒战、体温升高、焦虑、烦躁不安；严重者嚎叫，撞堵，在地上寸丁滚，甚至出现自杀行为。 (3)吸毒多久会成瘾 每个吸毒人员对毒品成瘾时间的快慢，往往与其所使用毒品的性质、类别、毒性的强弱、吸毒的方式、吸食的剂量、次数和吸毒者个人的心理素质、身体耐受程度以及文化素质、社会环境等诸多因素直接有关。一般来讲，毒性强的成瘾快，毒性弱的成瘾慢。吗啡、海洛因，如采用静脉注射的方式，每天两次，每次0．1克，2至3天即可成瘾。 2、如何识别吸毒人员 染上毒瘾一般有以下迹象： (1)无故旷工、旷课，学业成绩、纪律或工作表现突然变坏。 (2)在家中或单位偷窃钱财、物品，或突然频频地向父母或朋友索要，或借钱。 (3)长时间躲在自己房间内，或远离家人、他人，不愿见人。 (4)外出行动表现神秘鬼祟。 (5)藏有毒品及吸毒工具(如注射器、锡纸、切断的吸管、匙羹、烟斗等)。 (6)遮掩收缩的瞌孔，在不适当的场合佩戴太阳镜 (7)为掩盖手臂上的注射针孔，长期穿着长袖衬衣。 (8)面色灰暗、眼睛无神、食欲不振、身体消瘦。 (9)情绪不稳定，经常地发怒、发脾气，坐立不安、睡眠差。 (10)经常元故出入偏僻的地方，与吸毒者交往。 3、吸毒的方式 吸毒的方式主要有：烟吸、烫吸、鼻嗅、口服、注射五种常见方式。 (1)烟吸：将毒品掺入烟丝，通过吸烟将毒品吸入体内。 (2)烫吸：将海洛因放在铝馅纸上或金属匙上，下面用火加热，毒品升华为烟雾，吸毒
毒品及其检验实验
实验一薄层板的铺涂和活化 一、实验目的要求 培养学生从事刑事化验工作的基本操作技能。要求学生了解和掌握薄层板的铺涂和活化等操作技术。 二、实验原理 硅胶是一种应用非常广泛的吸附剂，其性质稳定，薄层层析分离效果好，能分离绝大部分毒物。 硅胶有加粘合剂和不加粘合剂的，还有加入荧光指示剂的。加入石膏粘合剂的硅胶，商品名叫硅胶G；不加粘合剂的硅胶，商品名叫硅胶H；加入荧光剂的硅胶则叫硅胶GF366、硅胶GF254（F表示荧光，366、254指波长）。 三、实验仪器设备 恒温干燥箱、玻璃板（200×50毫米）、三角烧瓶、烧杯、标签纸、吸水纸、天平等。 四、实验试剂 硅胶H、蒸馏水等。 五、实验步骤与方法 称10克硅胶G于带塞三角瓶中，加水20毫升，用力振摇45到60秒钟，立即将浆液倾倒在玻璃板上，均匀摇晃，迅速涂层。硅胶加水量也可用1∶3或1∶4。 上述铺好的薄层板，放于水平台上，以保持板的厚度均匀，待其水份自然挥发干燥，薄层不流动时，再进行活化。一般硅胶薄层板，在110℃活化半小时至1小时即可。 六、注意事项 1、薄层板厚薄应均匀，厚度在1毫米之内； 2、铺板过程中不能出现气泡。
实验二安定的检验 一、实验目的 （一）掌握安定的薄层色谱检验方法。 二、实验原理 安定属于苯并二氮杂卓类药物。常见的苯并二氮杂卓类药物有安定、舒乐安定等。安定在酸性、中性及碱性条件下均可被有机溶剂提取，它和碘化铋钾试剂反应生成橙黄色沉淀。 薄层色谱法是利用混合样品中各组份的物理化学性质的差别，使样品各组份以不同程度分布在两个不相混溶的相中，各组份以不同的速度移动，从而达到分离。由于各组份的性质不同，移动的速度也不同，故比移值（Rf值）不同，通过层析斑点的数量、颜色和相对比移值进行分析比对。 组份斑点中心至原点距离 Rf值＝ 展开剂前沿至原点距离 三、实验器材与设备 硅胶H薄层板，薄层喷壶，层析缸，研钵，试管，量筒或量杯，烧杯，试管架，试剂瓶，毛细管，酒精灯，天平。 四、实验样品与试剂 （一）样品： 安定、舒乐安定片剂。 （二）试剂： 氯仿，丙酮，乙醇，冰醋酸，乙醚，蒸馏水，次硝酸铋，碘化钾。 1、展开剂：氯仿:丙酮（9:1）； 2、显色剂：碘化铋钾试剂： A、称取次硝酸铋0.85克，加热溶于10毫升冰醋酸中，加水40毫升，混匀。 B、称取碘化钾8克，溶于20毫升水中。 临用时，取A、B各5毫升，加冰醋酸20毫升，水60毫升，混匀即可。 五、实验步骤与方法 取安定、舒乐安定片剂各2片用研钵研碎，取2/3分别置于1、2试管中，剩余粉末混合后置于3试管中，各用5毫升乙醚充分振摇溶解。 用毛细管点样于薄板上。
单克隆抗体制备过程中的两次筛选
单克隆抗体制备过程中的两次筛选 动物细胞工程中动物细胞融合的主要应用是制备单克隆抗体。在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，这地方学生很容易弄混了。第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法并不相同。 第一次筛选： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。
毒品化验 复习(完整)
1、刑事化验主要的仪器分析方法。 答：气相色谱分析；液相色谱分析；气相色谱—质谱联用法；扫描电镜分析。 2、刑事化验研究对象，化学物证分为几类？ 答：两类。微量物证和毒品毒物。 3、刑事化验的作用。 答：（1）作为立案的依据。通过对物证进行分析鉴定，可以证实是否发生了的案件，从而为立案侦查提供依据。 （2）提供破案线索。刑事化验能够通过对物证与比对样本的分析检验，判断物证的来龙去脉，从而为破案提供线索。 （3）可以排除嫌疑，认定犯罪。刑事化验通过分析检验，能作出物证与嫌疑样本是否同一的结论，从而排除嫌疑者或无辜者，或为认定犯罪提供有力的证据。 4、微量物证包括哪些？ 答：常见的种类有：涂料，纤维，玻璃，金属，泥土，塑料，油脂，纸张，油墨，粘合剂，火药以及纵火剂，爆炸和枪弹射击残留物等。 5、海洛因、冰毒、K粉、摇头丸的化学名称。 答：海洛因：二乙酰吗啡；冰毒：甲基苯丙胺；K粉：氯胺酮；摇头丸：亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）。 6、单根纤维、射击残留物、油痕、血液中酒精应如何提取？ 答：用镊子夹取单根纤维置于两载玻片间夹紧，用胶带夹紧。 用射击残留物专用取样盒，打开盖子，撕开保护膜后于手的虎口中粘取，粘至无粘性，然后放回取样盒。 用棉签擦拭，放于密封玻璃瓶中。 血液中的酒精：1、及时采血；2、贴标签；3、密封保存；4、防止污染；5无及时送检时应低温保存。 7、影响毒物作用的因素有哪些？ 答：1、毒物本身的因素。（1）毒物的理化性质。（2）毒物的剂量。 2、机体状态。（1）年龄、性别。（2）健康状况。（3）习惯性、过敏性。（4）机体的代谢状况。（5）吸收毒品的途径：注射、口服等。 8、定性分析与定量分析的任务分别是什么？ 答：定性分析就的任务是确定各色谱峰所代表的化合物。 定量分析就的任务是求出混合样品中各组分百分含量。 9、实验一炸药残留物中无机离子及TNT的检验 （1）无机离子、TNT的提取方法答：无机离子用蒸馏水提取；TNT用丙酮溶解提取。 （2）气相色谱法原理答：对混合物中各组分进行分离、分析. （3）如何根据标准与检材的色谱图进行定性和定量
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体
说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody ，北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合（Cell fusion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围
的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3?5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟， 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2X 105/ml，备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基，配好后过滤除菌 (0.22um),分装，4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基:
实验室毒品鉴定基本程序
实验室毒品鉴定基本程序 来源：《毒品检测与鉴定教程》作者：周向阳 一、毒品鉴定的取样 (一)取样的基本要求 正确采集毒品检样是鉴定成功的前提与保证，应根据不同种类的检样及时、全面采集。 由于实验室中检验毒品的多数方法(包括定性、定量检验)需要的试样较少，完成一个毒品试样的鉴定，一般来说，最多只需要l克样品，而且多年的办案实践证明，缉查的可疑毒品多数为混合物，所含成分复杂。如鸦片中含有吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁等几十种生物碱;海洛因除含吗啡衍生物外，还含有咖啡因、扑热息痛等掺杂剂;摇头丸的成分更加复杂，包括苯丙胺类毒品及其衍生物，大部分还含有氯胺酮、咖啡因。因此，能否合理取样，使其有较理想的鉴定性，关系到在毒品犯罪案件中，对采集的样品的鉴定结果能否代表缉查缴获的可疑物品的全部，从而直接影响鉴定结果的法律意义。 取样一般由禁毒部门的办案民警完成，特殊情况可邀请技术部门人员进行取样。取样应遵守以下原则： (1)无论是定性还是定量分析，所取样品必须具有代表性、全面性和均匀性。 (2)取样应当面进行，由两名以上的民警共同完成，并由在场民警、见证人和毒品违法犯罪嫌疑人签字后当场封存。也可邀请有关群众或协作地公安机关派人在现场监督并签名。 (二)检材的采集数量 一般而言，精制型毒品，如海洛因、冰毒、吗啡及可卡因等，需采集0.1~ lg。植物型毒品，如鸦片、大麻及古柯叶等，需采集1—5g。液体型毒品：若为纯品，需采集1—5ml;若为混合品，需采集10~ 50ml(盛装液体的瓶子不要装满，要留有1/3～1/4空间)。 (三)单包装毒品的采集规则 取样时，除去外包装物，将样品转移到干净的塑料袋或器皿中。称重量并记录其净重。 (1)细粉末。混合均匀后，以锥形四分法取样。具体操作为：将样品置于干净的平面器皿、塑料膜或白纸上，样品堆成圆锥形并压平，然后在样品上划“十”字，将样品分为四部分，取任意两个对角部分的样品为采集样，剩余部分放回原包装物。(2)带颗粒粉末。将颗粒压成粉末，过筛混合均匀，以锥形四分法取样。 (3)均匀颗粒。以锥形四分法取样。 (4)黏稠膏状物。将样品搅拌均匀后取样。(5)块状物。 ①全重小于500g。各个面取样粉碎混合均匀，以锥形四分法取样。 ②全重1000~ 2000g。样品呈十字形切开，各个面取样后合并为采集的样品，并以锥形四分法取样。 ③全重大于2000g。样品呈十字形切开，各个面取样后合并为采集的样品，并以锥形四分法取样。 6)片剂和胶囊。 ①1～50片。任意取总数的1/2，碾碎过20目筛并混合均匀。②50 N100片。任意20片，碾碎过20目筛并混合均匀。 ③101~1000片。任意30片，碾碎过20目筛并混合均匀。 ④大于1000片。总数开平方后取最大整数，碾碎过20目筛并混合均匀。
制备单克隆抗体方法
制备单克隆抗体方法 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法，利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 制备过程
1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备 摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。 关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞 现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。 1．国外现代生物技术产业发展的现状 自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。