第九章 亲和色谱

色谱分析法基本原理

色谱分析法基本原理 色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子 交换色谱与排阻色谱等方法。 吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。 分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。 离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而 使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。 排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小 的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。 色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。 分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸 色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。柱色谱法 所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤 维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果，除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应予注意。 吸附剂的填装干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，

高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率

2011年4 月Vo.l 29No .4 April 2011 Chi n ese Journal of Chromatography 358~361 研究论文 DOI :10.3724/SP .J .1123.2011.00358 *通讯联系人:张秀莉,副研究员,主要研究天然小分子和多肽的分离分析.Te :l (0411)84379521,E m ai:l zhangx i uli @dicp .ac .cn .基金项目:重大新药创制专项(N o .2009ZX 09313 003)和国家自然科学基金面上项目(No .30801513).收稿日期:2010 12 08 高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率 蔡晓明1 , 张 岩2 , 于 龙1 , 郭志谋1 , 张秀莉1* , 梁鑫淼 1 (1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析重点实验室,辽宁大连116023; 2.Un ivers ity of C alifon ia Irvi ne ,CA 92697 4625,USA ) 摘要:采用高效亲和色谱技术(HPAC )对中药成分与人血清白蛋白(HSA )的相互作用进行了研究。首先采用点击化学的方法制备了表面键合有HSA 蛋白的硅胶固定相并装填成亲和色谱柱,根据药物在该色谱柱上与空白硅胶 柱上的保留时间差计算得到药物与蛋白的结合率。利用该方法测得模型化合物华法令与H SA 的结合率与文献中采用超滤法测得的结果基本一致,表明该方法可用于测定药物与HSA 的结合率。在此基础上用该方法测定了葛根素和告依春两种中药成分与HSA 的相对结合率分别为10 26%和10 20%。同时用超滤的方法测定了葛根素与H SA 的结合率为14 25%。结果表明,HPAC 可以作为研究药物与蛋白相互作用的一种简便可行的方法,其测定结果与超滤方法一致。 关键词:高效亲和色谱法;人血清白蛋白;葛根素;告依春;结合率;超滤 中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2011)04 0358 04 Detection of drug hu m an seru m albu m in b ind i ng ratios of t wo Ch i nese m edici nal ingred ients by h igh perfor m ance affinity chro matography CAI Xiao m i n g 1 ,Z HANG Yan 2 ,YU Long 1 ,GUO Zhi m ou 1 ,ZHANG X iuli 1* ,LI ANG X in m iao 1 (1.CAS K ey L abora tory of Sepa ra tion Sc ien ce for An a ly tica l Che m istry ,D a lian In stitu te o f Che m ica l Phy sics,Chin ese Acade m y o f Scie n ces,Da lian 116023,Ch i n a; 2.Un iver sity o f Ca lifon ia Ir vin e,CA 92697 4625,U SA ) A bstract :The i n teraction of t wo Chinese m edici n al i n gredi e nts and hum an seru m al b u m in (HSA )has been investigat ed by high perf or m ance affi n it y chro m atography (HPAC ).HSA bounded silica based stati o nary phase w as prepared based on t he click chem istry strategy ,and packed in a colu m n (nam ed as HSA col u m n).The drug HSA binding rati o was calculated fro m t he diff erence of t he drug s ret enti o n ti m es on the H SA colu m n and silica col u m n (blank col u m n).T he warfari n HSA bindi n g rati o det er m ined by t his m ethod was s i m ilar to t he refer ence reported value by ultrafiltration m et hod .The results i n dicat ed that the new HSA colu m n and t he HPAC m et hod can be used for t he detection of binding ratio of drug and HSA .T he bi n di n g ratios of puerari n and goitri n deter m i n ed by the HPAC m ethod were 10 26%and 10 20%,respecti v e l y .And the binding rati o of puerarin deter m i n ed by ultrafiltrati o n was 14 25%.A ll t hese results showed t hat HPAC is a usef ul m et hod t o i n vestigate the interacti o n bet ween drugs and protein . K ey words :high perf or m ance affinity chro m atography (HPAC);hu m an seru m albu m i n ;puer ari n ;goitrin ;binding ratio ;ultrafiltration 人血清白蛋白(hu m an seru m albu m in ,HSA)是由585个氨基酸残基组成的一条单肽链,相对分子质量约为66500,是血浆中含量最丰富的重要载 体蛋白[1] 。H SA 上有多个药物结合位点,药物进入 血浆后,首先与血清白蛋白结合,然后再被输送到身体的各个部位产生药效。药物进入体内后的许多重

色谱分析基本原理..

一、色谱分析法基本原理 色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处

液相色谱仪结构及原理

液相色谱仪结构及原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一、特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。 2 ．液—固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：

色谱法的分类及其原理

色谱法的分类及其原理 （一）按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 （二）按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) ：柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法（paper chromatography）：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) ：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 （三）按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：

1、吸附色谱法：利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。 2、分配色谱法：利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法：相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，

郑大远程教育《现代色谱分析》在线练习参考答案

郑大远程教育《现代色谱分析》在线练习参考答案 你当前正在学习《现代色谱分析》课程01版，本课程共4学分，分6个教学章。考试形式：撰写论文；考试级别：远程教育学院。 本课程你已通过考试，并取得了学分。成绩是：89 《现代色谱分析》第01章在线测试的得分为 20分 恭喜，交卷操作成功完成！你本次进行的《现代色谱分析》第01章在线测试的得分为20分（满分2 0分），本次成绩已入库。若对成绩不满意，可重新再测，取最高分。 测试结果如下： ? 1.1 [单选] [对] 气相色谱应归属的范畴是（A ） ? 1.2 [单选] [对] 毛细管电色谱所依靠的驱动力为（B ） ? 1.3 [单选] [对] GLC、LLC均应归属于（ B）、 ? 1.4 [单选] [对] 能将分离分析一次完成的方法是（D ） ? 1.5 [单选] [对] 1952年获诺贝尔化学奖的学者是（ B） ? 2.1 [多选] [对] 按流动相的状态分类，色谱法可分为（ ABC） ? 2.2 [多选] [对] 按操作形成分类，色谱法可分为（ABC ） ? 2.3 [多选] [对] 属分配色谱范畴的是（AB ） ? 2.4 [多选] [对] 属吸附色谱范畴的是（ CD） ? 2.5 [多选] [对] 制备型色谱仪主要用于（AB ） ? 3.1 [判断] [对] 薄层色谱属于液相色谱的范畴。（V ） ? 3.2 [判断] [对] 离子交换色谱和离子色谱的原理是一样的。（ X） ? 3.3 [判断] [对] 色谱法对分析对象的鉴别力是较强的。（X ） ? 3.4 [判断] [对] 亲和色谱用于分离纯化生化样品。（V ） ? 3.5 [判断] [对] 色谱法是用于分离有色物质的技术。（X ） 《现代色谱分析》第02章在线测试的得分为 20分 恭喜，交卷操作成功完成！你本次进行的《现代色谱分析》第02章在线测试的得分为20分（满分2 0分），因未超过库中记录的成绩18分，本次成绩未入库。若对成绩不满意，可重新再测，取最高分。 测试结果如下： ? 1.1 [单选] [对] 分离度增加一倍，柱长增加的倍数是（D ） ? 1.2 [单选] [对] 容量因子的表示式为 C ? 1.3 [单选] [对] 两组分的保留时间分别为8.0和10.0min，峰宽分别为2.8和3.2mm，记录纸速为5.0mm/min，则两峰的分离度为（B ） ? 1.4 [单选] [对] 描述组分在流动相与固定相间的“平衡”关系的参数是（ D） ? 1.5 [单选] [对] 色谱的定性参数有（ D） ? 2.1 [多选] [对] 描述色谱流出曲线的基线情况，可用的参数是（AB ） ? 2.2 [多选] [对] GC中纵向扩散项受影响的因素有（ABC ）

快速高效偶联亲和层析介质试剂盒试用装说明书

快速高效偶联亲和层析介质试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：CDI预活化琼脂糖凝胶4B试剂盒。 商品名称：快速高效偶联试剂盒。 【包装规格】 20mL活化柱+500mL缓冲液/盒，附送亲和层析用空柱一支。 【预期用途】 快速高效偶联试剂盒适用于亲和层析填料的快速制备以及固相吸附、固定化酶等用途。

【主要组成成份】 ●预活化琼脂糖凝胶4B ●缓冲液 【原理】 本试剂盒系用优质琼脂糖凝胶4B活化后存放于保护液中和适合的偶联缓冲液制成，用活性咪唑碳酸酯基团偶联需要的配体。 使用时，保护液被洗去后就可使欲偶联的配体的氨基和活性咪唑碳酸酯反应，脱去咪唑基，使得配体的氨基通过共价键牢固的链接在基质上，即可方便得到高偶联效率的亲和层析填料。 【存储条件和有效期】 存储条件：原包装应储存于4-8 C。密封保存在阴凉干燥处切忌冷冻。有效期：一年。 【适用仪器】 本产品无需特殊仪器辅助使用，只需要在操作时使用抽滤装置帮助抽去洗涤液，以免洗涤时间过长造成偶联效果不理想。 附送的亲和层析空柱可安装适合的接口用于自动纯化仪。 【配体要求】 配体溶液的质量至关重要。配体需溶解于偶联缓冲液中并使得浓度大于15mg/mL，并且浓度越大，偶联效果越好，如已经溶解在其他缓冲液中，可用偶联缓冲液透析平衡。 【偶联方法】 方法一： 1、预先准备好溶解在偶联缓冲液中的配体（可用直接溶解或透析

方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。 2、将活化琼脂糖摇匀，倒入抽滤漏斗，加5倍体积的去离子水，抽气至快干时拔掉抽气管，注意不可抽干，此步速度宜快。 3、用配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），室温3小时或4摄氏度过夜，然后洗净即可。洗出来的配体可回收使用。 此方法适用于比较昂贵的配体。 方法二： 1、用干燥枪头吸去保护剂。制备配体在溶液B中的溶液（可用直接溶解或透析方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。 2、用5倍以上体积配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，4度摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），过夜后用适当缓冲液洗净即可。洗出来的配体可回收使用。 此方法适用于比较廉价的配体。 注意： 如果配体不耐高pH条件，可以用1M盐酸调节缓冲液至适合pH。 【装柱】 塑料层析柱 1、将层析柱固定，封闭层析柱下端出口，向柱内充入去离子水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。 2、先将介质混匀，打开层析柱下端出口，排出柱中去离子水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用导流棒沿内壁倒入介质或移液枪吸取介质，将介质加入到层析柱中；静置，待介质自

第十八章 高效液相色谱法

1、简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 2、什么是化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？ 化学键合相：化学键合相是通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相，简称键合相。 ①非极性键合相。例如十八烷基硅烷（ODS）。通常用于反相色谱。 ②弱极性键合固定相。常见的有醚基和二羟基键合相。这种键合相可作为正相或反相 色谱的固定相，视流动相的极性而定。这类固定相应用较少。 ③极性键合相。常用氨基、氰基键合相。一般都用作正相色谱的固定相，但有时也用 于反相色谱。氰基键合相与双键化合物可能发生选择性作用，因而对双键异构体或 含双键数不同的环状化合物有较好的分离能力。氨基键合相兼有氢键接受和给予两 种性能。对多功能基化合物有很好的分离选择性。氨基键合相上的氨基可与糖分子 中的羟基选择性作用，因此在糖的分离中广泛使用。在酸性介质中它还是一种弱阴 离子交换剂，能分离核苷酸。 3、什么是正相色谱？什么是反相色谱？各适用于分离哪些化合物/ 正相色谱：固定相极性大于流动相极性的色谱。主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。 反相色谱：固定相极性小于流动相极性的色谱。适合分离非极性至中等极性的组分，由它派生的离子抑制色谱法和反相离子对色谱法，还可以分离有机酸、碱及盐等离子型化合物。 4、简述反相键合相色谱法的分离机制。 387页。 原理：将离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法，称之为离子色谱法。 应用范围：一些在可见或近紫外光区没有吸收，难于用紫外—可见检测器进行检测的无机离子等。 原理：把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。分析酸类或者带负电荷的物质时，一般用季铵盐作离子对试剂，分析碱类或者带正电荷的物质时，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐作离子对试剂。 应用范围：适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。 原理：在反相色谱中，流动相的pH变化会改变溶质的离解程度，在其他条件不变时，溶质的离解程度越高，k值越小。因此常加入少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加它与固定相的疏水缔合作用，已达到分离目的。一般来说对于弱酸，降低流动相的pH，k增大，t R增大。对于弱碱，则需提高流动相的pH，才能使k增大，t R增大。 应用范围：适用于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。 6、亲和色谱的分离机制是什么？有何特点？ 亲和色谱法（AC）是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂试样中分离和分析能产生专一性亲合作用的物质的一种色谱方法。亲和色谱是基于试样中组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的。当含有亲何物的试样流经固定相时，亲和物

第十四章色谱法分离原理

第十四章色谱法分离原理 一．教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二．重点与难点 1.塔板理论，包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数 (n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三．教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法 四．学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素

中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度，可将色谱法分类如下： 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（G C） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的 一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（G S C）和气液色谱（GL C）。液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（L SC）和液液色谱（L LC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SF C）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CB PC）. 2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离

蛋白A高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G的含量(精)

蛋白A 高效亲和膜色谱法测定 人血浆中免疫球蛋白G 的含量 周冬梅邹汉法 ** 杨利贾凌云张玉奎 (中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011 提要研究了蛋白A 高效亲和膜色谱对水溶液及人血浆中人免疫球蛋白G (HIgG 的特异性吸附和定量测定。方法具有较高的精确度和较好的重复性:HIg G 标样5次重复进样的相对标准偏差为1. 5%, 人血浆样品3次重复进样的相对标准偏差为3. 6%; 所测得的定量标定曲线的线性相关系数达到0. 9993; 不含己二胺间隔臂的亲和介质的非特异性吸附极低, 基本检测不出来。快速实验中, 一次分析可在0. 5min 内完成。实验表明, 利用所建立的方法对人血浆中的HIgG 进行定量测定可以得到较为满意的结果。关键词高效亲和膜色谱法, 蛋白A , 人免疫球蛋白G 分类号O 658/Q 51 1前言 人免疫球蛋白G (HI gG 是一种活性生物大分子, 是人血浆中的主要成分之一, 通常采用免疫学的方法来对它进行测定。蛋白A (Pr ot ein A 是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白, 分子量为42000。在蛋白A 与免疫球蛋白G 分子的F c 区之间具有很强的特异性的亲和作用, 因而固载蛋白A 的亲和介质可用于分离、纯化和分析各种免疫球蛋白G [1～4]。我们曾采用灌流亲和色谱分析分离单克隆抗体[5, 6]。本文采用含己二胺间隔臂和不含己二胺间隔臂两种方法合成出了以甲基丙烯酸缩水甘油酯复合纤维素膜为基质的亲和膜及以蛋白A 为配基的亲和介质, 研制出可与高效液相色谱仪配套使用的高效亲和膜色谱柱[7], 建立了一种对人血浆中的HIg G 进行定量测定的方法, 并对两种介质进行了比较; 同时对HIg G 的快速分析进行了一定的

气相色谱的分离基本原理

一、气相色谱的分离基本原理是什么？ 1.利用混合物中各组分在流动相和固定相中具有不同的溶解和解吸能力，或不同的吸附和脱附能力或其他亲和性能作用的差异。 2.当两相作相对运动时样品各组分在两相中反复多次受到各种作用力的作用，从而使混合物中各组分获得分离。 二、简述气相色谱仪的基本组成。 基本部件包括5个组成部分。 1.气路系统；2.进样系统;3.分离系统;4.检测系统;5.记录系统。 简述气相色谱法的特点？ 1、高分离效能； 2、高选择性； 3、高灵敏度； 4、快速； 5、应用广泛。 三、什么叫保留时间？ 从进样开始至每个组分流出曲线达极大值所需的时间，可作为色谱峰位置的标志，此时间称为保留时间，用t表示。 四、什么是色谱图？ 进样后色谱柱流出物通过检测器系统时，所产生的响应信号时间或载气流出气体积的叫曲线图称为色谱图。 五、什么是色谱峰？峰面积？ 1、色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线称为色谱峰。 2、出峰到峰回到基线所包围的面积，称为峰面积。 六、怎样测定载气流速？ 高档色谱仪上均安装有自动测试装置，无自动测试装置可用皂膜流量计测，将皂膜流量计连接在测检测出口（也可将色谱柱与检测器断开皂膜流量计测接在色谱柱一端），测试每分钟的流速。测完后色谱升温压力表指示会升高，原因是温度升高色谱柱对气体的阻力增加，不要把压力调下来，当色谱温度升高稳流指示不会改变。测试载气流速在室温下测试。 七、怎样控制载气流速？ 载气流速的控制主要靠气路上高压钢瓶上的减压阀减压，然后经仪器的稳压阀稳压，再经稳流阀以达到控制载气流量稳定，减压阀给出的压力要高出稳压后的压力。非程序升温色谱一般没有稳流阀，只靠稳压阀控制流速。 八、气相色谱分析怎样测其线速度？ 1、一般测定线速度实际上是测定色谱柱的死时间； 2、甲烷作为不滞留物，测定甲烷的保留时间（TCD检测器以空气峰）， 3、用色谱柱的长度除以甲烷的保留时间得到色谱柱的平均线速度。 九、气相色谱分析中如何选择载气流速的最佳操作条件？ 在色谱分析中，选择好最佳的载气流速可获得塔板高度的最小值。因此，从速率理论关于峰形扩张公式可求出最佳流速值。通常色谱柱内径4mm，可用流速为30ml/min 十、气相色谱分析中如何选择载气的最佳操作条件？ 1、载气的性质对柱效和分析时间有影响； 2、用相对分子质量小的载气时，最佳流速和最

气相色谱原理

气相色谱仪原理 什么是气相色谱 本章介绍气相色谱的功能和用途，以及色谱仪的基本结构。 气相色谱（GC)是一种把混合物分离成单个组分的实验技术。它被用来对样品组分进行鉴定和定量测定》 基子时间的差别进行分离 和物理分离（比如蒸馏和类似的技术）不同，气相色谱（GC)是基于时间差别的分离技术。 将气化的混合物或气体通过含有某种物质的管，基于管中物质对不同化合物的保留性能不同而得到分离。这样，就是基于时间的差别对化合物进行分离。样品经过检测器以后，被记录的就是色谱图（图1),每一个峰代表最初混合样品中不同的组分。 峰出现的时间称为保留时间，可以用来对每个组分进行定性，而峰的大小（峰高或峰面积）则是组分含量大小的度量。 图1典型色谱图

系统 一个气相色谱系统包括 可控而纯净的载气源.它能将样品带入GC系统进样口，它同时还作为液体样品的气化室色谱柱，实现随时间的分离 检测器，当组分通过时，检测器电信号的输出值改变，从而对组分做出响应 某种数据处理装置图2是对此作出的一个总结。 样品 载气源一^ 进样口一^ 色谱柱一^ 检测器一_ 数据处理」 图2色谱系统 气源

载气必须是纯净的。污染物可能与样品或色谱柱反应，产生假峰进入检测器使基线噪音增大等。推荐使用配备有水分、烃类化合物和氧气捕集阱的高纯载气。见图 钢瓶阀 若使用气体发生器而不是气体钢瓶时，应对每一台GC都装配净化器，并且使气源尽可能靠近仪器的背面。 进样口 进样口就是将挥发后的样品引入载气流。最常用的进样装置是注射进样口和进样阀。注射进样口 用于气体和液体样品进样。常用来加热使液体样品蒸发。用气体或液体注射器穿透隔垫将样品注入载气流。其原理（非实际设计尺寸）如图4所示。

色谱法的基本原理

色谱法的基本原理：利用样品混合物中各组分理 利用样品混合物中各组分理、化性质的差异，各组分程度不同的分配到互不相溶的两相中。当两相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。 两相中，固定不动的一相称固定相;移动的一相称流动相。 分类： 根据两相的物态类型，有液-固色谱和液-液色谱两类基本色谱方法。 液-固色谱的固定相是粉末状或颗粒状固体，具有表面吸附活性，流动相是液体。混合物中各组分在固定相表面上的吸附强度不同，当流动相流过时各组分随流动相的移动速度不同而实现分离。柱色谱、薄层色谱大都属于这类色谱。 液-液色谱的固定相是附着于载体的液层，流动相是另一种液体。混合物中各组分在两液相间的分配系数不同，则在两液相中的浓度不同，随流动相移动的速度也不同，从而实现分离。纸色谱和有些薄层色谱属于这类色谱。 一、液-固色谱原理 液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术，柱色谱属于液-固吸附色谱。 当混合物溶液加在固定相上，固体表面借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分，以不同的作用强度被吸附在固体表面。 柱色谱分离原理 放大浏览 由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，当流动相流过固体表面时，混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少，吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。 二、柱色谱分离条件 氧化铝对有机物的作用类型 放大浏览 ⑴固定相选择 柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。 吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱;极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为： 成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。 表1：各种吸附剂对于极性有机物的吸附作用强度 放大浏览 常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等(表1)。 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质;中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广;碱性氧化铝pH为9-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。 吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。 活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。

亲和色谱法及其在我国的研究发展状况

亲和色谱法及其在我国的研究发展状况 【摘要】：亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。技术蓬勃发展，中国色谱专 家同时也非常注重国际间色谱技术的交流。随着国际间交流加深，中国的色谱技术已经跟上了世界的步伐。色谱与生命科学 的交叉研究、色谱与其它分析技术的联用表现得异常活跃。 【关键词】：亲和色谱历史现状 1．亲和色谱 1.1色谱概述 20世纪初，俄国植物学家茨维特首次提出色谱法。他把碳酸钙粉末装到玻璃管中，将植物叶 子的石油醚萃取液作为样品倒入管内，然后再用石油醚自上而下洗脱。随着洗脱的进行，植物叶子中的各种色素向下移动逐渐形成一圈圈的色带，茨维特将这种色带分离过程称为色谱，所用的玻璃管内的碳酸钙填充物称为固定相,洗脱用的石油醚称为洗脱液或洗脱剂，也就是我们常说的流动相。后来，采用该法分离了许许多多的物质，虽然分离过程中看不到色带存在，但色谱法一直沿用至今。 色谱法在当今物质尤其是具有生物活性物质的分离中起到举足轻重的作用。然而在色谱发展的早期有许多的人往往将色谱看做一种艺术, 但是随着色谱理论的发展，以及色谱技术的不断推广，色谱逐渐的称为了一种科学。对于从事生物大分子分离的物质常常用一句话来形容色谱的重要作用：“色谱技术是当今生物工程下游技术的核心”。当今的色谱法包括分离和检查两部分，能够同时实现分离和分析。色谱法也必定会随着材料、生物等多学科研究的深入会更加广泛的应用到分离科学和分析化学之中的。 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原 和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种 特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法。 在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称 为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。 亲和色谱法的基本过程是： 1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称

色谱法原理

第十二章色谱分析法 一、选择题 1.反映色谱柱柱型特性的参数是：（） A.分配系数 B.分配比 C.相比. D.保留值 2.对某一组分来说，在一定的柱长下，色谱峰的宽或窄主要决定于组分在色谱柱中的：（） A.保留值 B.扩散速度 C.分配比 D.理论塔板数 3.载体填充的均匀程度主要影响（） A.涡流扩散B分子扩散 C.气象传质阻力 D.液相传质阻力 4.指出下列哪些参数改变会引起相对保留值的增加（） A.柱长增加 B.相比率增加 C.降低柱温. D.流动相速度降低 5. 在色谱分析中，柱长从1m 增加到4m ，其它条件不变，则分离度增加( ) (1) 4 倍(2) 1 倍(3) 2 倍(4) 10 倍 6. 相对响应值s'或校正因子f'与下列哪个因素无关？( ) (1)基准物(2)检测器类型(3)被测试样(4)载气流速 7..试指出下述说法中, 哪一种是错误的? ( ) (1) 根据色谱峰的保留时间可以进行定性分析 (2) 根据色谱峰的面积可以进行定量分析 (3) 色谱图上峰的个数一定等于试样中的组分数 (4) 色谱峰的区域宽度体现了组分在柱中的运动情况 8.以电子积分仪的积分方法计算色谱峰的峰面积，适用于何种类型的色谱峰？（）（1）呈高斯分布的色谱峰（2）不对称的色谱峰 （3）同系物的色谱峰（4）所有的色谱峰 二、问答题 色谱图上的色谱峰流出曲线可以说明什么问题？ 三、计算题 1.在5%DNP柱上，分离苯系物，测得苯、甲苯的保留值时间为 2.5和5.5min，死时间为 1min，问：（1）甲苯停留在固定相中的时间是苯的几倍？（2）甲苯的分配系数是苯的几倍？ 2.已知某色谱柱的理论塔板数为3600，组分A与B在该柱上的保留时间为27mm和30mm，求两峰的底宽和分离度。 气相色谱部分 1.在气相色谱分析中, 用于定性分析的参数是( ) (1)保留值(2)峰面积(3)分离度(4)半峰宽 2在气相色谱分析中, 用于定量分析的参数是( ) (1)保留时间(2)保留体积(3)半峰宽(4)峰面积 3. 良好的气-液色谱固定液为( ) (1)蒸气压低、稳定性好(2)化学性质稳定 (3)溶解度大, 对相邻两组分有一定的分离能力(4) (1)、(2)和(3) 4. 使用热导池检测器时, 应选用下列哪种气体作载气, 其效果最好？( ) (1)H2(2)He (3)Ar (4)N2

亲和色谱的分离技术

亲和色谱的分离技术 摘要本文主要对亲和色谱的相关信息如起源发展、分类、应用、前景等做了介绍。重点介绍了亲和色谱的分类以及不同的亲和色谱的原理特点以及应用。 关键词亲和色谱起源发展；亲和色谱分类；亲和色谱应用；亲和色谱前景 前言亲和色谱在就是把与目的产物具有特特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，可把目的产物从混合物中分离出来。如抗原与抗体，酶蛋白与辅酶。如今，很多研究学者研究不同类型的亲和色谱。冯文科等［1］介绍了三嗪染料配基亲和色谱(包括高效亲和色谱)分离纯化蛋白质的基本原理和方法，并介绍了染料亲和色谱固定相制备方法及应用的最新发展；赵胜利等［2］介绍了固定金属离子亲和色谱(IMAC)吸附蛋白质的基本原理、蛋白质吸附与解吸的影响因素以及洗脱过程中需要注意的问题，并简述了IMAC今后研究的方向；孙维敏［等3］研究抗体纯化中亲和色谱配体的进展；庄海宁［4］研究免疫亲和色谱的原理及其在食品安全检测中的应用；王迪等［5］研究免疫亲和色谱及其在兽药残留检测中的应用；王继华等［6］阐述了免疫亲和色谱技术生化提纯可溶性核糖核蛋白SSA抗原、SSB抗原的特点，同时展望了免疫亲和色谱的发展状况；贾凌云等［8］研究亲和色谱仿生配基在筛选和设计方面的进展；苏成芝等［10］制备了Trypsin Sepharose 4B亲和层析柱，采用硫酸铵、三氯醋酸沉淀、离心色谱、降冻干燥等技术，对猪胰脏中胰蛋白酶抑制剂进行分离纯化，测定各步中的活性；钱俊青［11］等应用前沿亲和色谱研究分子间相互作用及其应用。 本文主要介绍亲和色谱的发展、原理、分类以及各种亲和色谱的特点以及应用，还有其前景发展。 1、亲和色谱的起源和发展 1910年Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附到高岭土上研究了抗体和抗原的相互作用并发现淀粉酶与不溶解淀粉键合得十分紧密； 1924年Engelhardt提出固定配偶原理作为分离生物活性物质的方法； 1933年Holmtergh利用淀粉凝胶进行色谱分离从淀粉酶中分离出淀粉酶； 1951年Camptell将抗原白蛋白固定在重氮基对氨基苄基纤维上用以纯化抗体； 1953年Lerman将偶氮染料固定在纤维素上纯化蘑菇中的络氨酸酶； 1954年GrubhoferSchleith为应用目的将羧肽酶淀粉酶胃蛋白酶核糖核酸酶固定在重氮化氨基聚苯乙酰树脂上； 1959年Porath和Flodin将葡萄糖Sephadex基体引入亲和色谱中使亲和色谱得到快速发展； 1963年Merrifield提出固相肽合成方法为亲和色谱固定相制备提供了可借鉴的途径； 1964年Hjerten研制出球形琼脂糖它与葡聚糖都适用作亲和色谱的基体材质； 1967年AxenPorthErnback提出用溴化氰活化琼脂糖的方法为多肽蛋白质在基体上固定化开辟了新的方法； 1968年Cuatrecases和Wilchek定义亲和色谱的概念扩展亲和配位体范围包括酶抗原半抗原抗体激素维生素外援凝集素糖蛋白膜蛋白病毒细胞等确立了生物特效亲和色谱方法； 1970年Cuatrecasces进一步完善溴化氰活化琼脂糖的方法并提出在固相基体和配位体之间插入空间间隔壁的概念和方法成功的解决了配位体的立体可接受性问题对亲和色谱的发展做出了突破贡献； 1972年Yon提出利用在水溶液中非极性官能团之间的接触组合来分离蛋白质和核酸的硫水作用色谱方法Wulff提出了印迹分子色谱法； 1973年Couper提供甲基丙烯酸乙二醇聚酯载体SpheronBrocklehurst提出用2吡啶二硫化物作配位体的共价色谱法Hayman用亲和色谱法分离细胞；