天津农学院毕业论文格式示范-实例

天津农学院

毕业论文

中文题目:小球藻无菌培养体系的建立及对UV-B辐射

的响应

英文题目:Establishment of aseptic culture of Chlorella

and the response to UV-B radiation

学生姓名张洁

系别水产科学系

专业班级2007级海洋渔业科学与技术专业1班

指导教师周文礼

成绩评定

2011年 6月

1 前言 (1)

2 材料与方法 (1)

2.1 微藻及培养 (2)

2.2 抗生素 (2)

2.3 UV-B辐射处理 (2)

2.4 实验方法 (2)

2.5 数据统计 (4)

3 实验结果 (4)

3.1 真菌的排除与检测 (4)

3.2 稀释前后小球藻培养液中可培养细菌的变化 (4)

3.3 小球藻对抗生素的敏感性 (5)

3.4 小球藻培养液中异养细菌对抗生素的敏感性 (8)

3.5 小球藻无菌培养体系的建立 (10)

3.6 无菌小球藻的种群增长 (10)

3.7 无菌小球藻的种群增长对UV-B辐射增强的响应变化 (11)

4 讨论 (12)

4.1 真菌的排除与检测 (12)

4.2 小球藻对抗生素的敏感性 (13)

4.3 小球藻培养液中异养细菌对抗生素的敏感性 (13)

4.4 小球藻无菌培养体系的建立 (14)

4.5 无菌小球藻的种群增长 (15)

4.6 无菌小球藻的种群增长对UV-B辐射增强的响应变化 (15)

5 结论 (16)

参考文献 (17)

致谢 (21)

附录1 相关英文文献

附录2 英文文献中文译文

摘要

本文以我国常见饵料微藻-小球藻（Chlorella vulgaris）为实验对象，采用实验生态学的方法探讨了微藻无菌培养体系的建立以及对UV-B辐射增强的响应。以期为阐明UV-B辐射增强对水生生态系统的影响机制提供科学依据,同时为海水养殖的生态修复技术提供理论支持。研究结果如下：

利用生态毒理学方法研究了小球藻和共栖异养细菌对抗生素的敏感性差异及建立小球藻无菌体系的方法。结果表明：建立小球藻无菌系的适宜抗生素为青霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素。通过涂平板挑取单克隆小球藻个体去除霉菌后，将小球藻培养液进行稀释过滤处理，依次加入法加入100IU的青霉素、庆大霉素、卡那霉素，分别处理两次，获得了无菌的小球藻藻株。

小球藻除菌后，生长规律发生明显变化。除菌藻的阻滞期、对数期和稳定期都明显延长，最大细胞密度增加。UV-B辐射胁迫改变了自然带菌藻和除菌藻的生长规律。0.2 J/m2 -0.8J/m2的UV-B辐射促进自然带菌藻和除菌小球藻的生长，相同剂量对自然带菌藻的促进作用更大；大于1.6J/m2的UV-B辐射剂量，抑制二者的生长，相同剂量对除菌藻的抑制作用较大。

关键词: 小球藻；共栖异养细菌；UV-B辐射；抗生素

Abstract

A common diet microalgae-Chlorella vulgaris was selected to serve as experimental materials and the relationship between C.vulgaris and associated heterotrophic bacteria was estimated under controlled laboratory conditions and change of relationship when stressed by enhanced UV-

B radiation. The results could supply experimental base to answer the effect of enhanced UV-B radiation on aquatic ecosystem, while provide theoretical evidences to ecological restoration technology in mariculture. Results showed:

The ecotoxicological method was used to determine the different effect of antibiotics on Chlorella vulgaris and associated heterotrophic bacteria, worked out a practicable method for establishing axenic Chlorella vulgaris. The results showed that: Penicillin, Gentamycin, Kanamycin and Neomycin were feasible antibiotics for removing bacteria in Chlorella vulgaris medium; after removing mould by taking monoclonal Chlorella vulgaris on the plate, Penicillin, Gentamycin, Kanamycin were added to cultural system of diluted and filtered Chlorella vulgaris in turn, which the concentrations were 100IU respectively. Axenic Chlorella vulgaris was obtained after twice treatment.

The results about effect of enhanced UV-B radiation on Chlorella vulgaris pre and post removing bacteria indicated that there was not significantly difference between axenic and non-axenic Chlorella vulgaris by comparing their population growth. But the growth rhythm was varied obviously; the lag phase, log phase and stationary phase were prolonged significantly; and maximal cell density increased. When the dose of UV-B radiation was from 0.2 J/m2 to 0.8J/m2, axenic and non-axenic Chlorella vulgaris were promoted and the non-axenic Chlorella vulgaris had a better growth compared with the growth of axenic Chlorella vulgaris under the same dose of UV-B radiation. While two experimental groups were inhibited when the doses of UV-B radiation exceed 1.6J/m2, and axenic Chlorella vulgaris was

presented more obvious inhibitory effect under the same dose of UV-B radiation.

Keywords：Chlorella vulgaris;Concomitant heterotrophic bacteria; UV-B radiation; antibiotics;

小球藻无菌培养体系的建立及对UV-B辐射的响应

张洁

（天津农学院水产科学系）

1 前言

藻类尤其是海洋微藻,富含蛋白质、脂肪、EPA、DH A等多种生物活性物质,具有重要经济价值[1]。开发利用微藻已经成为人类获得食品、药品、燃料等一个新途径[2]。近年来，藻类研究者开展了大量的研究,藻类学得到了前所未有的发展, 但与其他一些学科相比,起步较晚,进展相对滞后。无法获得一些藻的无菌株是制约藻类学研究的因素之一。从自然界采集的藻细胞能直接进行诸多研究,但对于藻类生理、生化、营养价值、药理学、毒理学、分子遗传学等方面的研究，纯培养是必须的[3]。在已鉴定的20000余种微藻中,仅有很小的一部分获得纯培养[4]。一方面培养方法可能不适合某些微藻的生长,无法获得具有活性的藻细胞, 纯化工作难以进行[5，6]；另一方面目前采用的常规分离方法如离心洗涤法、稀释过滤法、抗生素法、化学消毒法、毛细管显微分离法、辐照技术、利用特性法和物理法等分离纯系藻株的研究表明，单一方法分离纯系无菌藻往往难度很大。

目前，紫外线辐射增强是目前颇受关注的全球变化问题之一，由它引起的生物学效应和生态学效应也是当今环境科学研究的热点和难点[7]。对由UV-B辐射所产生的生物学效应研究，在生态系统的各个层面上都得到不同程度的开展[8-11]；海洋微藻作为海洋初级生产力的主要贡献者，其对UV-B辐射增强的响应研究是目前海洋环境科学和生态学交叉学科的国际前沿领域。海洋微藻在个体、种群和群落水平上对UV-B辐射增强的响应在国内外正在逐步展开[12-14]。

但是，当前多数研究中所采用的微藻实际上是微藻和细菌的混合体系，使得藻类生理，遗传、毒理和藻菌关系等方面的研究工作无法深入[4，15]。本研究利用微藻比细菌具有更强的抗生素耐受性的特点,试图寻找对微藻本身影响小,但能抑制或消灭伴生杂菌的抗生素,研究不同的抗生素对微藻生物学效应的影响,以确定对藻细胞无害而能抑制杂菌生长的抗生素及其用量与培养时间。通过稀释过滤和抗生素处理方法相结合排除微藻培养液中的细菌，分离小球藻无菌藻株，为探讨藻菌关系及其对UV-B辐射的响应变化提供科学依据。

2 材料与方法

2.1 微藻及培养

小球藻（Chlorella vulgaris Beij.）由国家海洋局一所藻种室提供，培养海水系（海宝牌）海水晶配制而成，经沉淀、过滤、1.05 kg/cm2,121.3 ℃灭菌20 mi n 后使用。f/2培养液中培养[16]，光照培养箱中培养。培养温度为(20 ± 0.1) ℃,光照60 μmol/m·s,光暗周期12 L∶12 D.每天摇动培养瓶数次，防止附壁或下沉。

2.2 抗生素

氯霉素 (Chloramphenicol Cm)，遗传霉素418(Geneticin G418)，青霉素(Penicillin)，链霉素（streptomycin）、庆大霉素（Gentamycin）、卡那霉素（Kanamycin）、新霉素（Neomycin）购自Sigma公司。抗生素母液配制参照文献[17]，经细菌过滤器(0.22 μm)抽滤灭菌后用于后续试验。

2.3 UV-B辐射处理

使用8根UV-B灯管，UV-B灯外用乙酸纤维素薄膜包被，以除去小于280nm 的短波照射，整个装置在实验前需连续照射72h，以减少薄膜的滤过作用的不稳定性。UV-B灯垂直下方有一个低速（16rpm）转动的平台，培养皿与平台同心距放置，以保证受光均匀而且模拟海水波动，防止微藻沉底，保证浮游状态[12]。由于UV-B穿透力很弱，所以在实验中将藻液倒于直径为15cm的培养皿中，置于距离UV-B灯20cm的正下方处。打开培养皿,照射一定时间后，转移至100ml 三角瓶中。光照培养箱中培养。整个过程严格执行无菌操作规定。

2.4 实验方法

2.4.1 真菌的排除与检测

取0.1ml小球藻培养液，稀释为系列梯度，分别涂布于f/2固体培养基（f/2培养液+0.7%琼脂）上，培养30天，培养条件同上。取无霉菌平板，挑取单藻落于新配制f/2培养液中，逐级扩大培养。培养过程中取藻液加入葡萄糖酵母膏培养液，进行真菌检测[18]。

葡萄糖酵母膏培养基（1）液体：葡萄糖1g，酵母膏0.1g，海水1000ml；

（2）固体：液体+15g琼脂。

2.4.2 小球藻对抗生素的敏感性

2.4.2.1 抗生素加入

在预备试验的基础上，将七种抗生素分别加入到处于对数生长初期的小球藻培养液中，抗生素终浓度分别为10，25，50，100，200 mg/L。

2.4.2.2 细胞密度及叶绿素a测定

每24h取0.1m l藻液，Lugol’s碘液固定，血球计数板计数观察细胞密度的变化。

在抽气负压小于50 kPa的条件下，用0.65 μm玻璃纤维滤膜过滤微藻，过滤体积为50 ml。过滤后的滤膜放入15 ml具塞试管中，加入10 ml体积分数为90%的丙酮，盖紧试管塞，振荡后用铝箔包裹立即放入冰箱，萃取12～24h后测定。取出样品半小时，使样品温度与室温一致后，荧光分光光度法测定叶绿素a含量[19]，实验共10 d，计算相对增长率的变化[20]。相对增长率计算公式为：K = (lg N t-lg N0) / T ，N0：藻的起始密度或叶绿素a起始含量；N t：培养t时间后的藻的起始密度或叶绿素a含量；T：培养时间。

2.4.3 小球藻培养液中异养细菌对抗生素的敏感性

2.4.

3.1 纸碟制备

根据小球藻对抗生素的敏感性测试结果，选取小球藻不敏感的抗生素进行实验。用无菌进样器各吸取5ul、10μl、20μl、40μl加到预先灭菌的烘干纸碟上（上海森工，直径为5.5mm）。纸碟抗生素的终浓度分别为：15、30、60、120IU/片。

2.4.

3.2 共栖异养细菌的分离

取小球藻培养液0.45 μm滤膜过滤，稀释为不同密度梯度,取0.1ml稀释液涂布2216 E平板,20℃培养3～7d。挑取具有不同形态特征的菌落划线纯化后于2216 E斜面培养48h(20℃)，4℃保存。

2216 E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g；磷酸高铁0.1g；陈海水1000ml；

pH7.6；琼脂15g。

2.4.

3.3 测试

取2216 E斜面20℃培养48h的纯化菌株。以无菌海水制成菌悬液，使细菌密度为107cfu/ml，吸取0.1ml涂布2216 E平板，将抗生素纸碟贴于平板表面。20℃恒温培养箱中培养，选择抑菌圈直径大于等于20mm的抗生素作为除菌抗生素。

2.4.4 小球藻的无菌培养体系的建立

根据小球藻及细菌对抗生素敏感性实验结果，取小球藻不敏感，细菌敏感的抗生素进行实验。抗生素处理前取对数期小球藻藻液用50μm的无菌滤膜过滤，再用无菌海水将小球藻小心洗入无菌f/2培养液中培养10d后，再用同样的方法处理一次。用于抗生素处理（下同）。

2.4.4.1 抗生素处理方法

处理方法分为单一抗生素加入，抗生素依次加入，抗生素混合加入3种形式。

抗生素浓度依上述实验结果确定。抗生素处理按照林伟[20]（2000）的方法进行。

平板培养和显微镜直接检测细菌的去除效果，确认无菌后，传代5次，消除抗生

素的影响。

2.4.4.2 无菌检测方法

平板培养检测每种抗生素处理后,0.1 ml藻培养液涂布2216 E平板。进行细

菌培养检测(20 ℃培养30d) 。

镜检法吖啶橙荧光直接镜检技术（Acridine Orange Direct Count, AODC) 取1 ml已排除抗生素影响的微藻培养液用终浓度为0.1%的吖啶橙染色3min，抽滤

于直径25mm孔径为0.2μm的无菌无颗粒的黑色核孔滤膜上。将滤膜置于载玻片上, 滴加一滴无自发荧光的显微镜油,加盖玻片,再滴一滴。荧光倒置显微镜下观

测有无细菌存在。

2.4.5 无菌小球藻的种群增长规律及对UV-B辐射增强的响应变化

2.4.5.1 无菌小球藻的种群增长规律

按1∶9的比例接种对数期无菌小球藻，每48h取样，血球计数板计数，观

察藻细胞密度和叶绿素a含量的变化。计算相对增长率。

2.4.5.2 无菌小球藻的种群增长对UV-B辐射增强的响应变化

按1∶9的比例接种对数期无菌小球藻，预实验的基础上设UV-B辐射剂量

分别为：0；0.2；0.4；0.8；1.6；3.2（J/m2），每天以紫外B灯取代日光灯管照

射处理。培养30天，血球计数板计数，计算不同辐射剂量下小球藻相对增长率

的变化。以自然带菌藻为对照组。

2.5 数据统计

实验设置对照组，3个平行，两次重复，取平均值作为实验结果。

3 实验结果

3.1 真菌的排除与检测

在f/2固体培养基上挑取无污染小球藻单克隆个体扩大培养后。进行真菌检测。培养过程中，在葡萄糖酵母膏培养液中没有发现丝状或絮状沉淀物出现。表

明小球藻没有受到真菌的污染。可以用于后续实验。

3.2 稀释前后小球藻培养液中可培养细菌的变化

抗生素处理前对小球藻培养液中的细菌进行了稀释处理，观察处理前后小球

藻培养液（10-3稀释液）中异养细菌的培养情况。可以看出，通过两次稀释处理

后，异养细菌的数量显著减少，由处理前的约39×103cell/ml 下降到8103cell/ml 。一方面说明稀释处理可明显降低异养菌的数量，同时也显示单纯的稀释处理和无菌洗涤无法完全去除藻液中的细菌。 3.3 小球藻对抗生素的敏感性

在实验浓度范围内，小球藻对10-100 mg/L 的氯霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素和新霉素不敏感。这几种抗生素在培养时间内，其细胞密度和叶绿素a 的含量变化与对照组无明显差异（p >0.05）；低于25 mg/L 的各处理组对小球藻的生长有促进作用（图1，图3-图7）；200 mg/L 的氯霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素处理组中，小球藻生长受到不同程度抑制。

图 1 氯霉素对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的影响

a:小球藻细胞数量；b:小球藻叶绿素a 含量

不同浓度的G418对小球藻细胞数量和叶绿素a 含量均有明显抑制。与对照组相比，抗生素处理的第五天，10-200 mg/L 的G418对小球藻数量增长和叶绿素a 含量变化的影响均呈显著差异（p <0.05）；100mg/L 的G418对小球藻的影响差异极显著（p <0.01），在加入G418的第5天，小球藻的生长完全被抑制(图2)。

图 2 G418对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的影响

a:小球藻细胞数量；b:小球藻叶绿素a 含量

c e l l s /m L (104)

t / d

C e l l s m L -1

(104

)

/ d

t / d

图 3 青霉素对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的影响

a:小球藻细胞数量；b:小球藻叶绿素a 含量

图 4 链霉素对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的影响

a:小球藻细胞数量；b:小球藻叶绿素a 含量

图 5 庆大霉素对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的影响

a:小球藻细胞数量；b:小球藻叶绿素a 含量

c e l l s m L -1(104)

t / d

c e l l s m L -1(104)

t / d

c e l l s m L -1(104)

t / d

图 6 卡那霉素对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的影响

a:小球藻细胞数量；b:小球藻叶绿素a 含量

图 7 新霉素对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的影响

a :小球藻细胞数量；b:小球藻叶绿素a 含量

根据图1至图7利用直线内插法求得7种抗生素对小球藻藻细胞密度和叶绿素a 含量的96h 半数抑制浓度。如表1所示。

表1 7种抗生素对小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的96h 半数抑制浓度

抗生素 antibiotics 96 h K d -EC 50 （mg·L -1） 96hK Chl-a -EC 50 （mg·L -1）

氯霉素 Chloramphenicol 205 187 遗传霉素 Geneticin 418 59 21 青霉素 Penicillin 243 224 链霉素 streptomycin 304 298 庆大霉素 Gentamycin 276 253 卡那霉素 Kanamycin 221 215 新霉素 Neomycin

236

219

通过表1可以看出，根据细胞数量变化和叶绿素a 含量变化得到的7种抗生素的半数抑制浓度，并不完全相同，说明表示小球藻对抗生素的敏感性时，不同指

c e l l s m L -1(104)

t / d

c e l l s /m l (104)

t / d

标间存在一定的差异，但二者保持着规律上的一致性，两个不同的生长指标相互印证，从总体上可以反映抗生素对小球藻生长的影响。

3.4 小球藻培养液中异养细菌对抗生素的敏感性

根据上述实验结果可知，小球藻对低于100mg/L的氯霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素不敏感，可用于小球藻培养液中细菌敏感性测试，但氯霉素的诱变和致癌作用，会导致再生障碍性贫血、淋巴瘤和恶性肝细胞肿瘤。所以选择青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素进行实验。

使用平板分离纯化方法，根据细菌在2216 E培养基表面的生长状况、菌落形态特征，从小球藻培养液中分离到12株生长迅速的优势异养菌。命名为q01-q12。青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素对12株异养菌抑菌圈的大小分别如表2-表6所示。结果表明：实验浓度范围内，任何单一抗生素都无法完全抑制小球藻培养液中的所有细菌，15IU时，5种抗生素的作用下，抑菌圈超过20mm 的只有q2，q3，q5，q8和q10；30IU的抗生素处理组中有q6和q7的抑菌圈直径小于20mm；达到60IU时，青霉素、庆大霉素、卡那霉素的组合对12株细菌的抑菌圈直径全部达到20mm以上。5种抗生素中，链霉素的抑菌效果最差，其浓度达到120IU时仅对q7和q8菌株的有明显抑制作用（表2至表6）。

表2 小球藻共栖异养细菌对青霉素的敏感性

抗生素Antibiotic

浓度（IU）

Concentration

抑菌圈直径

diameter of zones of inhibition（mm）

≤10 11-19 ≥20

青霉素Penicillin 15 q01,q03,q04,q08,q11 q05, q06,q07,q09 q02,q10, q12 30 q03, q04, q08, q11 q01, q05, q06, q07 q02, q09, q10, q12 60 q08, q11 q01, q03,q04, q02, q05, q06, q07,

q09, q10, q12 120 q11 q03, q04, q08, q01, q02, q05, q06,

q07,q09 , q10,q12

表3 小球藻共栖异养细菌对链霉素的敏感性

抗生素Antibiotic 浓度（IU）

Concentration

抑菌圈直径

diameter of zones of inhibition（mm）

≤10 11-19 ≥20

链霉素streptomycin 15 q01, q02, q03, q04,

q05 ,q06, q09, q10, q11

q07, q08, q12

30 q01, q02, q03, q04,

q06, q09, q10, q11

q05, q07, q08, q12

60 q01, q04, q06, q09, q10,

q11

q02, q03, q05, q07, q08,

q12

120 q01, q06, q09, q10, q11 q02, q03, q04, q05, q12 q07, q08 表4小球藻共栖异养细菌对庆大霉素的敏感性

抗生素Antibiotic

浓度（IU）

Concentration

抑菌圈直径

diameter of zones of inhibition（mm）

≤10 11-19 ≥20

庆大霉素Gentamycin 15 q03,q06,q08,q09,q12 q01,q02,q04,q07,q10,

q11

q05

30 q03,q06,q08,q09,q12 q02,q04,q07,q10 q01,q05,q11 60 q08,q09,q12 q02, q03,q06,q07,q10 q01, ,q04,q05,q11 120 q08,q12 q02, q03,q06,q07,q09 q01, q04, q05,

q10，q11 表5小球藻共栖异养细菌对卡那霉素的敏感性

抗生素Antibiotic

浓度（IU）

Concentration

抑菌圈直径

diameter of zones of inhibition（mm）

≤10 11-19 ≥20

卡那霉素Kanamycin 15 q02,

q05,q07,q09,q12

q01, q04, q06,q08,

q10,q11

q03,q08

30 q02, q05,q07,q09 q01, q04, q06,

q10,q11,q12

q03,q08,q11

续表5

60 q05,q07,q09q01,q02,q04,q06,q10,

q12

q03,q08,q06,q11

120 q05, q09q02,q04, q07, q10,q12q01,q03,q06,

q08,q11

表6小球藻共栖异养细菌对新霉素的敏感性

抗生素Antibiotic

浓度（IU）

Concentration

抑菌圈直径

diameter of zones of inhibition（mm）

≤10 11-19 ≥20

新霉素neomycin 15 q02,

q05,q07,q09,q12

q01, q04, q06,q08,

q10,q11

q03

30 q02, q05,q07,q12 q01, q06, q08,

q09,q10,q11

q03,q04

60 q05,q07,q12 q01, q02,q06,

q08,q09,q10

q03,q04,q11 120 q05 q02,q07, q08,q09,

q10,q12

q01,q03, q04, q06,

q11

3.5 小球藻无菌培养体系的建立

根据上述实验结果，取稀释过滤培养的小球藻，以青霉素、庆大霉素、卡那霉素为除菌抗生素。3种抗生素浓度均为100IU，混合加入时3种抗生素按比例添加，培养液中抗生素总浓度保持不变。

AODC法检测结果表明，单一抗生素去除小球藻培养液中的细菌效果较差，3种抗生素分别处理后，除青霉素处理后，培养液中仍有大量的细菌存在。青霉素、庆大霉素和卡那霉素依次加入，处理两次后，经平板培养和镜检，没有发现细菌的存在，达到了除菌的效果，效果较好。3种抗生素混合加入，同样的方法重复处理后，镜检和平板培养结果显示，抗生素混合加入虽然能除去小球藻培养液中的绝大多数细菌，但不能完全去除，其效果次于抗生素依次加入法。

3.6 无菌小球藻的种群增长

无菌小球藻经传代培养排除抗生素的影响后，与自然未除菌的小球藻进行了细胞密度和相对增长率的比较（图8）。从细胞密度变化规律看，自然未除菌

的小球藻第4天就进入对数生长期，第16天进入静止期，第20天达到最大细胞密度2845×104cell/ml ；无菌小球藻的生长则明显滞后，第8天进入对数生长期，第24天进入静止期，第28天细胞密度达到最大值3252×104cell/ml 。

叶绿素a 含量变化与小球藻细胞数量变化规律相似，自然带菌藻和无菌藻的最大叶绿素a 含量达到23.2μg/L ，相比自然带菌藻的17.4μg/L 有了显著增长。对自然带菌藻和除菌小球藻的总细胞数量和总叶绿素a 含量进行差异性分析，结果表明整个生长周期内，二者的差异并不显著（p 值分别为0.415和0.441）。

比较自然带菌藻和无菌藻的生长状态，可以发现自静止期开始，自然带菌藻细胞开始出现下沉，悬浮藻细胞的密度不断下降，附壁现象明显，摇动培养瓶时，培养液中有块状沉淀，不易打散，颜色深暗；培养同样时间的无菌藻依旧维持着良好的生长状态，仅有极少部分细胞下沉，摇动时细胞混合较均匀，颜色鲜绿。

图 8 无菌小球藻细胞密度和叶绿素a 含量的变化

3.7 无菌小球藻的种群增长对UV-B 辐射增强的响应变化

不同剂量UV-B 辐射胁迫下，除菌前后小球藻的生长规律发生了明显的变化（图9,图10）。低于0.8J/m 2 的UV-B 辐射促进自然带菌和除菌小球藻的生长，0.4J/m 2的UV-B 辐射对自然带菌藻的促进作用最明显；除菌小球藻则在0.2J/m 2 的UV-B 辐射处理下生长最好。同样的辐射剂量处理，UV-B 对自然带菌藻的促进作用显著大于除菌小球藻（p <0.05）。且随UV-B 辐射剂量的增加，抑制作用逐渐加强。同样的辐射剂量下自然带菌藻细胞密度和叶绿素a 含量均低于自然带菌藻。

c e l l s m L -1(104)

t / d

C h l -a 10μg m L t / d

图 9 UV-B 辐射增强对自然带菌藻和除菌小球藻细胞数量的影响

a ：自然带菌藻

b ：除菌藻

图 10 UV-B 辐射增强对自然带菌藻和除菌小球藻叶绿素a 含量的影响

a ：自然带菌藻

b ：除菌藻

根据小球藻细胞密度的变化，计算相对增长率，利用直线内插法得到UV-B 辐射对自然带菌藻和除菌小球藻的72h 半数抑制剂量分别为：2.37J/m 2和2.24 J/m 2。可以看出，自然带菌藻比除菌小球藻有较强的耐受UV-B 辐射的能力。 4 讨论

4.1 真菌的排除与检测

微藻培养液有时会带有真菌，但由于细菌的快速繁殖抑制了真菌的大量生长，少量无选择性的培养和镜检使其不太容易被发现[21]。经抗细菌抗生素处理后，带有真菌的微藻，由于其培养液内细菌种类和数量急剧减少，对真菌的抑制力大大降低，使得其迅速繁殖，此时的微藻培养液经微生物培养基的培养很容易检测到真菌，镜检甚至肉眼观察也可以发现它们的存在。由于微藻与真菌同属于真核

C h l -a (10-3u g m l -1)

t / d

C e l l s m L -1(104)

生物，对真菌有明显抑制效果的抗生素往往对微藻同样有抑制作用[20]。所以，微藻中一旦污染了真菌，排除工作非常困难，目前最常用也是最有效的方法就是排除细菌前采用挑取微藻单克隆个体，逐级扩大培养，得到微藻的无真菌培养体系，但这种方法仅限于能够在固体培养基上生长的微藻。本实验中小球藻能在固体培养基（约0.7%的琼脂）上正常生长，因此除菌前通过涂平板和划线纯化的方式挑取无霉菌小球藻单克隆个体。培养过程中对小球藻培养液进行了镜检和培养检测没有发现真菌的存在，得到了无真菌的小球藻藻株。

4.2 小球藻对抗生素的敏感性

小球藻对各个浓度的G418都很敏感，可能原因是Npt II (Neomycin phosphor transferase II)基因产物能够通过酶促磷酸化使氨基葡糖苷类抗生素失活[22],从而解除抗生素的毒性。由Npt II基因编码的新霉素磷酸转移酶所对应的G418在多种植物中都表现出较低的本底，对微藻生长的影响较大。

氯霉素对海洋微藻的影响，可能是因为氯霉素分子中含有氯及硝基，它可与原核细胞核蛋白体50s亚基结合，干扰细胞内核糖体的蛋白质合成,抑制细胞生长并最终导致死亡；而真核生物核蛋白体为70s亚基[23]，因此氯霉素可以作为抑菌剂用于抑制原核生物的生长。已有的研究表明，小球藻对氯霉素的敏感性结果并不统一。Uriarte等[24]的研究显示小球藻对氯霉素非常敏感；而陈颖等[25]、Sahul Hammeed A S 等[26]则认为小球藻对氯霉素胁迫并不敏感。说明微藻对抗生素的敏感性受多方面的因素影响，抗生素溶液所使用的溶剂、使用抗生素浓度、微藻不同的生长阶段、实验条件的差异以及体系中的藻-菌相互作用等，均可能影响最终的试验结果。

10-100 mg·L-1的浓度范围内，青霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素和卡那霉素与对照组相比差异不明显，低浓度青霉素、链霉素、庆大霉素对小球藻生长还有促进作用，其原因一方面可能是低浓度的抗生素通过促进细胞内核酸和蛋白质的合成来促进叶绿素a的合成，出现生长刺激效应[27]；另一方面通过降低细胞中叶绿素酶的活性来延缓叶绿素的降解，从而提高细胞叶绿素a的含量。由于抗生素的这些作用，因而它能延缓微藻的衰老，增加光合能力和延长光合时间，提高有机物质的产量[28]。

4.3 小球藻培养液中异养细菌对抗生素的敏感性

理想的除菌用抗生素应具备两个特征[29]：即抑(杀)菌活性强和差异毒力大。抗生素抗菌谱的差异以及各微藻培养液中细菌群落组成特征的不同，决定了不可

能存在一种可将所有微藻中细菌杀灭的抗生素，因此为了提高除菌效果，降低耐药菌株出现的机率以及避免抗生素的浪费和污染，应对除菌抗生素进行筛选。首先将待除菌藻液中的细菌涂平板、划线、纯化后对每株细菌进行测试，得到每种抗生素的用量和抑菌种类，确定使用不同抗生素组合，达到完全除去小球藻培养液中细菌的目的。本实验按照上述方法，筛选得到了可以清除全部细菌的青霉素、庆大霉素和卡那霉素的组合。

实验中发现细菌对链霉素不敏感，从机理上看，链霉素作用于核糖体30S亚基, 导致基因密码的错读,引起mRNA翻译起始的抑制及异常校读。大量研究表明编码S12核糖体蛋白的rpsL基因及编码16SrRNA的rrs基因的突变都会使核糖体靶位点改变,使得细菌对链霉素产生显著水平的耐药。S12蛋白是30S亚基中的一个组分,主要控制链霉素与30S亚基的结合,它可以稳定由16SrRNA所形成的高度保守的假节结构, RpsL中氨基酸的置换将会影响16SrRNA的高级结构,导致对链霉素的耐药,而16SrRNA结构的改变又破坏了16SrRNA与链霉素的相互作用,也导致耐药。

4.4 小球藻无菌培养体系的建立

利用抗生素的选择性毒力和选择性作用原理[30]，适宜的抗生素可以在不伤害藻细胞生长的前提下，有选择性的抑制或杀死细菌。本实验所选3种抑菌抗生素，青霉素主要抑制革兰氏阳性菌，庆大霉素和卡那霉素主要抑制革兰氏阴性菌。因此它们的共同作用可以将小球藻培养液中的细菌完全除去。但由于实验条件的复杂性，一些不可预知的因素会影响抗生素的处理效果。如小球藻培养液的组成成分可能会影响抗生素的效力，藻培养液中未被杀死的细菌可能会处于一种暂时不可培养的“钝化”状态等[31]。因此，除菌过程中应进行无菌检验并且要保证检验结果没有残留抗生素的影响。由于藻液中存在着一些不可培养的细菌，一般除了培养检测外，还应该结合镜检或分子生物学方法，不同的检验方法得到的实验结果相互印证，确保实验结果的准确性。

本实验中采用3种不同的抗生素处理方法，对小球藻培养液中的细菌去除效果进行比较，单一抗生素无法除去小球藻培养液中的全部细菌，与细菌对抗生素敏感性测试结果一致，证实了不同细菌对不同抗生素的敏感性不同；实验浓度范围内，抗生素依次加入效果好于混合加入，可能是抗生素间存在着拮抗作用，抵消了抗生素的效力，研究报道，氯霉素和庆大霉素之间具拮抗作用，但本实验所选3种抗生素之间的作用未见报道，但相互间作用的可能性依然不能排除；另一

方面的原因可能是混合加入的抗生素中单一抗生素的浓度较依次加入的抗生素低，使抑菌效果下降。

物理纯化方法和化学纯化方法各具特点, 又都存在其局限性, 单一的纯化方法很难获得理想结果[29]。本实验首先利用稀释过滤法降低小球藻培养液的异养菌数量，然后在小球藻对数期添加抗生素处理，以较低的抗生素浓度得到除菌小球藻，既达到了除菌的目的，又降低了污染环境的可能性。可为微藻的无菌化培养技术提供借鉴。另外，抗生素处理的时机也是影响除菌效果的因素之一，对数期的小球藻本身能够分泌某些抑菌物质，选择这个时期加入抗生素，可以减少抗生素的用量，起到事半功倍的效果。

4.5 无菌小球藻的种群增长

研究发现[32-34]，一方面，细菌在特定条件下可以分泌化学物质，这些化学物质通过作用于微藻的生理过程如阻断呼吸链, 抑制细胞壁合成等, 抑制藻细胞生长甚至杀灭藻细胞，使自己处于竞争的优势地位；另一方面，某些微藻共栖异养细菌能够转化微藻的代谢产物，同时提供微藻生长所需要的无机元素和CO2等，促进微藻生长[35]。

林伟的研究表明[18]，微藻除菌后，在对数生长期，二者生长速率基本一致，达到稳定期后藻细胞最大密度也相仿。在自然带菌藻细胞开始下沉，悬浮藻细胞的密度不断下降时，除菌藻依旧维持着良好的生长状态。

本实验的研究结果表明，自然带菌藻与除菌藻的相对增长率差异并不明显，但藻细胞密度和生长规律有显著不同，与自然带菌藻相比，除菌藻进入对数生长期需要更长的时间（分别为4天和8天），在对数期和静止期保持的时间也不同（16天和20天），在自然带菌藻细胞密度开始下降时，除菌藻处于旺盛的生长阶段，最后二者达到的最大细胞密度分别为：2845×104cell/ml和3252×104cell/ml，林伟认为在微藻共栖细菌群落中可能存在着促使藻细胞老化的细菌，本研究的结果证实了这一现象的存在，同时除菌藻与自然带菌藻的差异也表明藻培养液中除了促使藻细胞老化的细菌外，还应该存在促进细胞增殖的异养细菌。这些细菌共存于小球藻培养体系中，在微藻生长的不同阶段，不同类群的细菌占据的优势地位不同导致微藻生长过程出现不同的状态变化[5, 15]。

4.6 无菌小球藻的种群增长对UV-B辐射增强的响应变化

无菌状态下微藻对增强的UV-B辐射的响应变化的研究目前尚不多见，从实验结果看，0.2J/m2-0.8J/m2的UV-B辐射对自然带菌藻和除菌藻的生长有促进作