反向遗传学技术及其在FMDV 研究中的应用

刘光清　刘在新　谢庆阁

(中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州730046)

摘　要:　反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。综述反向遗传技术研究进展,并讨论该技术在口蹄疫病毒研究中的应用。

关键词:　反向遗传学　反向遗传技术　全长cDNA 口蹄疫病毒

R everse G enetic T echnique and Its Application in FMDV R esearch

Liu Guangqing Liu Zaixin Xie Qingge

(L anz hou Veteri nary Research Instit ute CA A S ,L anz hou 730046)

Abstract :　Reverse genetics is a newly developed technique ,and has been applied widely in life science research.The recent development of Reverse genetic technique was reviewed in the paper.the technique has been applied in Foot 2and 2Mouth Disease Virus research ,and the relative progress was also reviewed.

K ey w ords :　Reverse genetics Reverse genetic technique Full 2length cDNA Foot 2and 2mouth disease virus

反向遗传学(Reverse G enetics )是相对于经典遗传学而言的,因为经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的,反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象,与之相关的各种技术统称为反向遗传学技术(Reverse G enetic Manipulation )。该技术目前已广泛应用于生命科学的各个研究领域,RNA 病毒研究的飞速发展更得益于此。以下介绍RNA 病毒的反向遗传学技术研究进展,并讨论其在FMDV 研究中的应用。

1　反向遗传学操作技术的涵义

由于RNA 病毒在复制表达过程中,不经历DNA 阶段,所以要进行RNA 病毒的分子水平上的操作,必须首先将RNA 病毒的基因组转换成cD 2NA ,即得到病毒基因组的全长cDNA 。然后克隆于合适的载体上,使之受控于强的转录启动子之下,在体外应用RNA 聚合酶转录系统,合成病毒基因组的RNA ,再用这些体外转录本转染宿主细胞,使之在宿主细胞内包装生成具有感染性的病毒粒子,从细胞培养物中回收病毒,得到感染性分子克隆。也

可以直接用含有全长cDNA 的表达载体转染细胞,在体内转录生成具有感染性的病毒RNA 。在此基础上,人们就可以根据自己的需要在DNA 水平上对RNA 病毒进行加工、修饰,从而研究病毒基因组的结构和功能,也可以研究病毒的转录、表达机制和致病机理等。上述在DNA 分子水平上对RNA 病毒进行操作,进而研究病毒的遗传规律和生物性状等的技术即是RNA 病毒的反向遗传学操作技术。

2　全长cDNA 的克隆技术

反向遗传学操作技术是在cDNA 水平上进行操作的,因此生物基因组全长cDNA 的克隆就显得至关重要。在分子生物学技术飞速发展的今天,尤其是在真核生物基因组学领域,获得全长cDNA 的技术更是日趋成熟和多样化,原核生物的基因组结构比较简单,其全长cDNA 的克隆可借鉴于真核生物,目前真核生物基因组全长cDNA 的克隆技术常用的方法有以下几种。2.1　构建全长cDNA 文库,从中筛选含有全长cD 2

NA 的克隆

目前有多种构建cDNA 文库的方法可供选择,

Ξ　基金项目:国家“973”项目资助(G 1999011901)

作者简介:刘光清(1968-),安徽砀山县人,在读博士研究生,主要从事动物病毒分子生物学等方面的研究通讯作者:谢庆阁,Tel :0931-*******,Fax :0931-*******

生物技术通报

?综述与专论? B IO TECHNOL O G Y BULL ETIN

2003年第3期

但其基本原理都是相似的。即oligo(d T)结合的纤维素、磁珠或其他固体颗粒,分离纯化的mRNA(或含有poly(A)尾巴的基因组),加入酶和反应底物直接进行cDNA单链及双链的合成,然后再将cDNA 进行修饰。削平末端加上接头,磷酸化后,使之与合适载体相连。

2.1.1　cDNA文库固相构建法　这是Thomas Roeder于1998年在前人的基础上创新的一种比较好的方法[1]。其原理如下:5′端生物素化的oligi (d T)252primer连接在链霉亲和素包被的磁珠上,将总RNA与磁珠混合后,通过磁性吸附,可进一步分离磁珠2mRNA复合物,然后以oligo(d T)和随即引物为反转录引物DNA第一链,随后再合成cDNA第二链,用T42DNA多聚酶削平末端,连上EcoRI接头并磷酸化。最后用Not I酶将cDNA从磁珠上释放下来,与载体相连接,获得高质量的cDNA文库,cD2 NA的大小分布,以oligo(d T)为引物合成的cDNA,其大小从300bp～7Kb;以随机引物合成的cDNA,其大小范围在100bp到7Kb之间。

2.1.2　oligo2capping法　针对5′端具有帽子结构的mRNA,可以采取用细菌碱性磷酸酶(BAP)去除无5′端m G保护的部分降解的不完整的mRNA末端的游离磷酸基团,然后再用烟草酸性磷酸酶(TAP)去除5′的m G结构,仅保留一个5′2p,合成一段r2oligo,用T4RNA连接酶连接到mRNA去除了m G以及二磷酸基团的5′2p上,继而利用修饰的oligo(d T)做反转录,并进行PCR反应,最后克隆到合适的载体上,以建立cDNA文库[2]。

2.1.3　CAPture法　这是Ederly于1995年报道的一种比较有效的建立全长cDNA文库的方法[3]。其原理是利用帽子结合蛋白(CBP)专门结合mRNA的帽子结构,使得含有完整帽子结构的mRNA被富集,以之为模板进行反转录,然后用RnaseA消化mRNA/cDNA杂种链,结果没有被CBP结合的“部分降解”的不完整的mRNA,以及虽然结合了CBP,但并不完整的mRNA都被降解掉。只有完整的mRNA又有全长cDNA第一链结合保护的那些mR2 NA得到保护,进一步纯化富集后建立cDNA文库,其中含有全长cDNA克隆的比例很高。但是,该方法需要大量mRNA。2.1.4　Cap trapper法　Carninci等[4]发明了这种方法,其原理是用过碘酸盐标记mRNA的帽子结构,反转录合成第一链cDNA后,用Rnase I除去RNA2 DNA杂合连中的单链部分,这样非全长的RNA2 DNA杂合链就不含有生物素,然后用免疫磁珠法筛选出全长cDNA,建立cDNA文库。其中95%的克隆为全长cDNA。该种方法得率和产量较前几种方法增加10～50倍,并且由于不需要做PCR反应,可减少理论上的偏移和冗余性。

2.2　快速cDNA末端扩增方法(RACE)

RACE是采用PCR技术,由已知的cDNA序列来扩增出完整的cDNA的3′和5′末端的快速方法,又被称为单边PCR和锚定PCR。现在已有现成的试剂盒供研究者选择使用,不同的RACE试剂盒可能会采用不同的策略,但是其基本原理都是一致的。在得到目的基因的5′和3′末端特异性cDNA以后,可以从两个相互重叠顺序的5′和3′RACE产物中获得全长cDNA,或者可以分析5′和3′端顺序,合成相应引物以扩增出全长cDNA。

2.3　利用穿梭载体获得全长cDNA

这是Kato等[5]在oligo2capping技术的基础上加以改进而发明的一种载体引物法。其最大特点是省略了PCR和亚克隆等步骤。而且用这种方法得到的全长cDNA既能在体外表达,又能在哺乳动物细胞中表达。该方法的要点是构建一种穿梭载体,然后将此载体作成引物直接连在mRNA的3′末端,做反转录生成cDNA,用所引入的限制性酶切位点消化后,使之自连,得到全长的cDNA。

3　感染性分子克隆的构建

在克隆到RNA病毒的全长cDNA分子之后,可以通过合适的方法转染宿主细胞以回收具有感染性的病毒粒子,大体上有两种途径可达此目的。

3.1　将全长cDNA克隆到含有强启动子的质粒载体上,在体外用RNA聚合酶转录系统进行体外转录得到感染性转录本(RNA),再用转录产物感染宿主细胞,回收感染性病毒粒子。这种方法中启动子的选择是很重要的,因为它将影响到体外转录本的产量和完整性。人们经常使用的启动子有:T7,T3, Sp6等强的启动子。在使用启动子的策略上,既可以把全长cDNA序列克隆到含有这些启动子的载体

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中,又可以在合成cDNA时将启动子的核心序列与cDNA的5′端引物嵌合在一起,使得合成的全长cD2 NA序列中含有启动子序列,然后再克隆到载体中。

3.2　直接用含有cDNA的质粒(也必须具有强的启动子如CMV启动子)导入宿主体内,利用宿主的RNA聚合酶及转录系统在体内发生转录生成具有感染性的病毒RNA,进而装配成病毒粒子。与体外转录相比该方法具有一定的优越性。因为所获得的RNA是在体内产生的,对环境的依赖性降低了。另外在体内产生的病毒RNA更接近于宿主细胞的mRNA,可使病毒基因组的表达不依赖于病毒的过程,尤其适用于研究那些不能在细胞内复制的突变病毒RNA编码蛋白的功能和定位。Van G ennip HG 等[6]为了提高CSFV的反向遗传产物的感染性,他们建立了一种稳定的猪肾细胞系,它能表达T7RNA 聚合酶(SK6.T7),在用线性全长c DNA转染细胞后,与体外转录RNA相比,病毒的滴度可以提高200倍,即使用环型c DNA转染细胞,也能把病毒的滴度提高20倍。而且,用这种方法得到的病毒与传统方法得到的病毒并没有什么区别。他们由此得出结论SK6T7细胞系可以作为一种有用的工具来回收CSFV的突变体,对将来的工作极有价值。

4　反向遗传学操作技术在RNA病毒研究中的应用

目前,反向遗传技术在RNA病毒的研究中已经得到广泛的应用并取得了很大的成就。对于正链RNA病毒来说,该技术是最先得到成功使用的,已经获得了脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、烟草花叶病毒、芜菁黄色花叶病毒、登革病毒等的感染性分子克隆。相对而言,负链RNA病毒的反向遗传学操作技术就显得比较滞后。因为负链RNA病毒裸露的基因组或由其cDNA 转录而来的RNA没有感染性。尽管如此,人们仍然设法得到了一些负链RNA病毒的感染性分子克隆,例如狂犬病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒、水疱性口膜炎病毒、人副流感病毒等。其采用的策略主要有两种:其一是1989年Luytjel等[7]报道的方法,他们在体外转录体中插入来源于流感病毒基因组的调控序列。在体外利用转录本和纯化的病毒核蛋白以及聚合蛋白获得具有生物活性的核糖核酸蛋白复合物(RN P),在辅助病毒的参与下,转录本在导入细胞后得到复制和表达并包装成为病毒粒子。其二是利用表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒、表达RNA复制和转录所需要的病毒蛋白的质粒以及含有病毒cD2 NA的质粒共同转染细胞,这样也可以得到感染性的病毒。

获得感染性分子克隆后,研究者根据其研究的目的,可采取不同的策略在DNA分子水平上进行操作。总的来说体外操作的方法有基因敲除、基因缺失、基因插入、基因置换、以及构建嵌和病毒等。反向遗传技术可以用于基因的克隆测序与定位[8]。还可以用于研究DNA的同源重组,例如Sonoda E 等[9]用该项技术在D T40细胞中研究了脊椎动物体细胞内DNA的同源重组。此外,还可以在DNA的分子水平上构建嵌合病毒以研究病毒基因组的基因功能,例如,Dobbe J C等[10]在马动脉炎病毒感染性cDNA克隆的基础上,应用基因工程技术将其主要糖基化蛋白(GP5)和膜蛋白(M)用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)或鼠乳酸脱氢酶病毒(LDV)的囊膜蛋白替代,研究了GP5和M蛋白转运到高尔基复合体上的过程及其在病毒装配中的作用,另外还确定了GP5蛋白在受体识别中的作用。在体外对HAV cDNA采取基因突变的策略,可能产生具有新的表型的病毒。小RNA病毒的全长感染性cDNA 克隆已经成功构建并用于研究决定病毒至病性的分析,例如在小RNA病毒cDNA中2A、3A编码区,或者3′端非编码区进行插入突变的操作,结果产生的病毒粒子不能在宿主细胞中生长和增殖,而且对温度敏感。1988年SVDV的感染性cDNA克隆成功构建,为了鉴定猪水疱病毒基因组中决定毒力的基因,Kanno T等[11]在此基础上,从强毒株和弱毒株的cDNA克隆制备了一系列重组病毒和定点突变病毒,最后证明基因组中决定毒力的基因在以下两个位点或其中的一个,一个是2842位核苷酸,编码VP1的132aa,另一个是3355位,编码2A20位氨基酸。为了确定两个位点在决定毒力方面的相对重要性,分别在弱毒株和强毒株的这两个位点进行突变,并在猪体上验证。研究表明这两个位点都是决定毒力的位点,但是2A220则是起主要决定的位点。总之,反向遗传学操作技术是一门很重要的学科,它的产生与发展必将

2003年第3期刘光清等:反向遗传学技术及其在FMDV研究中的应用

有力的推动生命科学的发展。

5　反向遗传技术在口蹄疫病毒研究中的应用

口蹄疫病毒(Foot2and2Mouth Disease Virus, FMDV)是一种单股正链RNA病毒,它主要引起偶蹄动物发生口蹄疫,这是一种比较古老而顽固的传染病,其流行范围之广,控制难度之大,以及对畜牧业之影响却是其他动物传染病所无法类比的。而且至今人类尚不能拿到一个切实可行的方法来控制消灭它,因此国际兽疫局将其列为A类传染病之首。究其原因主要是人们对该病的致病机理、病毒毒力变异的机制、抗原的漂移性以及该病持续性感染发生的原因等诸多问题尚不太清楚。因此一直拿不到一种安全有效的新型疫苗来控制口蹄疫,反向遗传学的兴起,对FMDV的研究起了极大的推动作用,目前人们不仅已成功获得了FMDV的感染性分子克隆,而且应用于口蹄疫研究的各个领域并取得了令人瞩目的成就。

5.1　应用基因突变研究基因功能

为了研究FMDV R G D序列在病毒感染过程中的作用,Leippert M等[12]在基因组的全长cDNA分子中,设计了13个点突变,分别位于R G D序列内部及其附近区段。在体外转录生成cRNA后,转染BH K221细胞,结果发现在R G D序列内部发生点突变的cRNA转染细胞后,不能产生感染性的病毒粒子,在R G D附近区段发生突变的cRNA则能产生感染性病毒。为了进一步证明这些没有感染性的病毒只是由于在细胞吸附位点上有缺陷,他们又将在R G D序列内部发生点突变的cRNA与表达有野生型P1蛋白的cRNA共转染细胞,结果产生有感染性的病毒粒子,因而也证明了FMDV R G D序列在病毒吸附过程中具有重组作用。

5.2　构建嵌合病毒研究基因变异与毒力之间的关

系

Sa2carvalho D等[13]构建了一种嵌合病毒,即把两个不同血清型的O1株编码核衣壳蛋白的cDNA 序列插入A12株的感染性cDNA分子中,构建成一种新型的杂种病毒,它能表现出原来亲本的基因型,通过不断增加核衣壳蛋白基因的长度比例,研究并分析嵌合病毒在细胞中的生长情况及其毒力的变化,发现FMDV基因组上带正电荷的2134和3056位氨基酸是吸附肝素所必需的,在体外通过与肝素结合选择出的O型FMDV毒株,在自然宿主中却致弱了。Almeida Mr等[14]构建了一种缺失了前导蛋白酶序列的嵌合病毒,含有A12株的基因组序列及O1株的核衣壳蛋白编码序列,这种杂种病毒毒力较弱,但在猪体中仍能检测到毒性,接着又构建了另外一种嵌合病毒,它则缺失了R G D编码序列,在猪体中没有毒性,但是接种猪后,并不能产生足够的免疫力以对抗野毒的感染。

5.3　研究新型FMD疫苗上的应用

Beard.C等[15]构建了一种DNA疫苗含有FMDV的全基因组序列,但是缺失掉了病毒吸附细胞位点的编码序列。用这种DNA疫苗免疫猪,结果产生了较强的免疫反应,产生的中和性抗体水平也较高,能部分保护动物遭受高毒力FMDV的侵袭。Ward.G等[16]在构建成感染性cDNA分子的基础上,也通过缺失的手段,移去V P1蛋白的细胞吸附位点序列,构建了一种重组质粒,用它转染敏感细胞,有V P1蛋白的产生,接种猪,猪不表现任何临床症状,但是能产生中和性抗体,用强毒攻击免疫动物,结果20%的猪得到保护。Chinsangaram J等[17]利用基因工程技术,在FMDV A12株感染性分子克隆的基础上,构建了一种缺失了前导蛋白酶编码序列的病毒,将该病毒分别作为活疫苗和化学灭活苗接种动物,并观察其效应。结果表明,作为活苗接种动物以后,动物不表现临床症状,没有散毒的危险,能刺激机体产生中和性抗体,并为动物提供部分保护。化学灭活苗接种动物也能产生高水平的中和性抗体,能保护动物免受野毒的侵袭。

5.4　研究宿主因素对FMDV复制的影响

研究表明L蛋白酶是FMDV的一个毒力因子,它通过切割e IF4G,抑制IFN2α/βmRNA的翻译过程,降低IFN2α/β蛋白的产量,进而导致野毒在宿主细胞内迅速增殖。而缺陷L蛋白酶的FMDV在细胞上生长得很差,因为宿主细胞中有IFN2α/β的正常生长反应存在。用大肠杆菌表达的猪IFN2α/β能够有效地抑制FMDV的复制,这种抑制作用是发生在蛋白的翻译水平,并具有双链RNA依赖性的蛋白

(下转第11页)

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(上接第4页)

激酶活性(P KR )。Chinsangaram J 等[18]为了验证

这一推测,用P KR 的抑制剂22氨基嘌呤处理猪和牛细胞,与没有处理过的细胞相比,病毒的产量提高了8.8～11.2倍;另外用FMDV 感染通过基因敲除鼠得到的缺失Rnase L -/-或P KR -/-的胚胎干细胞,证明P KR 具有抑制FMDV 复制的作用。

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12003年第3期

高燕会等:基于逆转座子的植物分子标记技术及其应用