SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
实验六报告：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
1.研究背景及目的
根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。
蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1]。通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率主要取决于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。
通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习
和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。
2.原理
由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间
结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二
烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。
SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电荷量约为蛋白质本身静电荷10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。
SDS-蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴在18?的数量级，保持恒定，而长轴的变化正比于蛋白质的分子量。因此SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状不同对电泳迁移率的影响。
综上，SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量有关，研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分子量对数呈线性关系，因此能够根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分
子量大小。
3.仪器与试剂
3.1仪器设备
DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）、100μl微量进样器（上海医用激光仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；
3.2主要实验器皿
烧杯（50ml ×3）、大培养皿一套、100ml量筒、玻璃漏斗；
3.3实验材料
实验四麦清蛋白脱盐样品；
3.4实验试剂
实验试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘油、巯基乙醇、异丙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、盐酸、乙酸、冰乙酸；
试剂的配制：
⑴分离胶贮备液：称取Tris 18.17克，SDS 0.4克，溶于水，用3N HCl调pH到8.8，水定容至100毫升，其中Tris为1.5M，SDS为0.4%。
⑵浓缩胶贮备液：称取Tris 6.06克，SDS 0.4克，溶于水，用3N HCl调pH到6.8，水定容至100毫升，其中Tris为0.5M，SDS为0.4%。
⑶Acr/Bis储备液：称Acr 30克，Bis 0.8克，加蒸馏水到毫升。
⑷10%过硫酸铵：过硫酸铵1克，加蒸馏水至10毫升，用时现配。
⑸TEMED：冰箱保存。
⑹Tris-HCl样品缓冲液（pH 8.0）：称Tris 6.05克，甘油50毫升，巯基乙醇25毫升，溴酚蓝0.5克，SDS 10克，溶于水，用HCl调pH为8.0，水定容至500毫升。
⑺电极缓冲液：称取Tris 3.03克，甘氨酸14.41克，SDS 1.0克，溶于水，定容至
1000毫升。
4.操作步骤
4.1电泳槽的安装
玻璃板要先用洗液浸泡，然后用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，洗净的玻璃板装入硅胶夹套中，垂直的固定在两槽中间。在固定时，要四个螺旋对角线拧紧。电泳槽装好后，用溶化的电极缓冲液配配制的2%的琼脂注入高玻板一侧电泳槽的下方，从而封堵形成夹层胶室，以防漏胶，备下一步应用。
4.2制胶
分离胶的配制（T%=12.5%）
混匀，沿高玻璃板中央定点灌胶至距离矮玻璃板2-2.5厘米处，放正，立即沉稳轻缓封水层，静置聚合；聚合后倒去水层，以滤纸条吸干残余水层，灌注浓缩胶。
浓缩胶制备:
浓缩胶灌至与矮玻璃板顶端相齐，立即插入梳子，静置聚合。浓缩胶聚合后，灌注电极缓冲液，再拔出梳子，准备上样。
4.3样品的处理
Marker：市售标准样品按要求制备
待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获得的峰值管制备的SDS-PAGE样品。
所有样品于沸水浴中加热5分钟，冷却后上样。
上样量：marker20ul，待测样品：4ul、10ul、20ul、30ul、50ul。
4.4电泳
样品加入后，准备电泳，本次实验：取稳流状态，浓缩胶15mA，分离胶25mA。本次试验的溴酚蓝前沿指示剂不能跑丢！
4.5检测
（1）染色液：0.4%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，7%乙酸
（2）脱色液：20%甲醇，7%乙酸
（3）步骤电泳后，取出胶板，先在自来水中浸泡10min，以浸出部分SDS，（加热2h应该在通风橱中操作），然后用脱色液脱至条带清楚，观察记录结果。
4.6测量蛋白质样品的迁移率和未知样品的分子量
用卡尺或坐标精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移的距离，把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移的距离定位d2，根据下面的公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm= d2/ d1
以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得到一条直线。然后根据未知样品的迁移率，在半对数坐标图上查出其对应的分子量。并由所得结果分析实验四麦清蛋白的初步提取的实验的效果及后续进一步纯化的方案。
5.数据整理
溴酚蓝迁移距离d1=10.10cm
6.结果计算与讨论及分析
图1 Marker的标准曲线
结果计算：目标蛋白的迁移率Rm=0.248，代入标准曲线的公式中得到：MW(目标蛋白)=62.78 KDa。麦清蛋白的分子量为相对分子质量为60kDa左右，结果相近，说明实验结果是可信的。
讨论及分析：在电泳图谱中，Marker有6条清楚的谱带，第7条位于蛋白前沿，迁移不充分。在绘制标准曲线的时候，发现不忽略Marker1，R2为0.9583，忽略Marker1，R2为0.9869。忽略后的拟合程度更好，不知道本次实验中是否可忽略Marker1。样品采取梯度上样是为了使含量高的蛋白低上样量，含量低的蛋白高上样量，使谱带更加清晰。目标蛋白含量较高，说明该蛋
白在小麦种子休眠中起重要作用。根据电泳谱带信息，可见能够分析的谱带有10条，本次实验
一共分离得到10种蛋白，其中带较粗含量较高的有三种蛋白，说明在小麦种子休眠过程中起着
重要作用。
若要对目标蛋白进行分离纯化，可以根据目标蛋白与杂蛋白的分子量差异，分子量大小排在什么位置，进行试验设计，再上样进行一次层析。由于目标蛋白的上一条谱带迁移距离为2.4cm，与其2.5cm非常接近，层析中可以通过控制洗脱液流速，最终实现分离。
7.结论与展望
本实验以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定麦清蛋白分子量，通过目标条带相对迁移率与Marker蛋白质标准曲线的比对，计算得到目标蛋白分子量大小。实验结果从数值上而言与标准值相近，可见以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量准确度相当可观。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离样品，结果易于鉴定、比较、分析和计算，广泛应用于未知蛋白质分子量的测定，但其易受环境和人为等诸多因素的影响，有待进一步的改进和完善。
8.思考题与质疑
⑴对照比较一下活性电泳与本次变性电泳中各自的电极缓冲液的成分和离子浓度，是否相同？相关设计的可能原因会是什么？
答：不相同，比较如下：
离子浓度加大是因为在SDS-PAGE中要使蛋白质与SDS结合生成SDS-蛋白质复合物，从而使蛋白质带上强负电，因此必须在整个电泳缓冲体系中加入高浓度的SDS及保持高离子强度环境，可以适当增大电流，使电泳速度提高。甘氨酸量增多是因为甘氨酸在浓缩胶中作为尾随离子，追赶前导离子，将蛋白压缩聚集成一条狭窄的区带；蛋白质结合上SDS后，分子量变大，增多甘氨酸可以使浓缩效应加强。
⑵连续做了两次电泳，所用仪器设备和试剂等完全相同，不同的只是电泳类型和动手操作，但电泳图谱的效果却差异很大，SDS-PAGE的图谱明显更加清晰稳定，请分析其主要原因。给我
们什么启发？
答：上一次实验是活性电泳，需要保证蛋白质的活性，而活性易受各种环境因素影响，且在电泳过程中蛋白质可能发生降解、变性，导致拖尾现象严重，蛋白质的分离效果与蛋白质的分子量、分子形状以及带电量相关；本次实验为变性电泳，由于SDS的结合，将蛋白质本身带电量和形状的影响因素排除，唯一影响因素为蛋白质间分子质量差异，进一步提高了泳带的区分度和集中度，更清晰稳定，并使电泳结果可以量化。
启发：为了获得更好的实验结果，有时候需要建立在单一变量的原则上；一项技术的发展往往是多学科交叉的结果，变性电泳引入了阴离子去污剂——SDS，取得了很好的效果。
⑶请探讨一下生物研究中理论与技术的关系。
答：在生物研究中理论是技术的基础，技术是理论的应用，技术往往是一个再创造的过程。在理论的支持下不断改进仪器和技术；与此同时，通过实际情况中技术的不断实践，一方面对现有的理论研究进行完善，另一方面技术生产中所遇到的新问题将催生新的理论成果。此外，理论的发展会受技术需求的推动，也会因技术的限制而受到限制。例如电泳技术的发明，在理论的指导下，电泳技术最初是用来分离纯化，但是电流会产生热效应，散热差，对具有活性的生物大分子很不利，而且上样量少。最终电泳技术更广泛地应用于分析鉴定。技术在实践过程中进行完善，同时也丰富了理论。二者在发展过程中，相互促进，相互补充。
质疑：绘制工作曲线时，发现不忽略Marker1，R2为0.9583，忽略Marker1，R2为0.9869。忽略后的拟合程度更好，本次实验中是否可忽略Marker1？
9.实验小结
10．参考文献
[1] https://www.360docs.net/doc/d74095471.html,/view/641727.htm 百度百科聚丙烯酰胺凝胶电泳
[2] 中国农业大学生物学院.生物化学实验指导[M].中国农业大学自编教材.P42-45
聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺 1、定义 丙烯酰胺聚合物是丙烯酰胺的均聚物及其共聚物的统称。工业上凡是含有50%以上的丙烯酰胺（AM）单体结构单元的聚合物，都泛称聚丙烯酰胺。其他单体结构单元含量不足5%的通常都视为聚丙烯酰胺的均聚物。 聚丙烯酰胺，polyacrylamide（PAM），CAS RN：[9003-05-8]，结构式为： n是聚合度。n的范围很宽，数量级为102~105，相应的相对分子质量由几千到上千万。 分子量是PAM的最重要参数。按其值得大小有低分子量（<100×104）、中等分子量（100×104~1000×104）、高分子量（1000×104~1500×104）和超高分子量（>1700×104）四种。不同分子量范围的PAM有不同的使用性质和用途。 2、分类 聚丙烯酰胺按在水溶液中的电离性可分为非离子型、阴离子型、阳离子型、两性型。 非离子型聚丙烯酰胺（NPAM）的分子链上不带可电离基团，在水中不电离；阴离子型聚丙烯酰胺（APAM）的分子链上带有可电离的负电荷基团，在水中可电离成聚阴离子和小的阳离子；阳离子型聚丙烯酰胺（CPAM）的分子链上带有可电离的正电荷基团，在水中可电离成聚阳离子和小的阴离子；两性的聚丙烯酰胺（AmPAM或ZPAM）的分子链上则同时带有可电离的负电荷基团和正电荷基团，在水中能电离成聚阴离子和聚阳离子，ZPAM的电性依溶液体系的PH值和何种类型的电荷基团多寡而定。 PAM的电性称谓和所带的电荷基团解离后的电性称谓相同。 按照聚合物分子链的几何形状可把PAM分为线型、支化型和交联型。PAM分子链的形状一般是线型结构。但是在丙烯酰胺自由基聚合反应的过程中会发生链转移反应。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，
加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:
蛋白质含量测定 凯氏定氮法
食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法） 一、目的与要求 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 三、仪器与试剂 硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为L）硼酸溶液（20g/L） 氢氧化钠溶液（400g/L）L盐酸标准滴定溶液。 混合指示试剂：%甲基红乙溶液液1份，与%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。 微量定氮蒸馏装置：如图3-所示。 图3-微量凯氏定氮装置 1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）； 3、螺旋夹a； 4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）； 5、反应室； 6、反应室外层； 7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。 四、实验步骤 1、样品消化 称取样品约（±），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。 试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。 2、定氮装置的检查与洗涤
蛋白质四级结构及其检测方法
论述一、二、三、四级蛋白质结构及其检测方法？ 蛋白质定义：由一条或多条多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 一、蛋白质一级结构： （一）定义：蛋白质的一级结构又称为共价结构或化学结构，它是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。氨基酸残基主要通过肽键连接，有些蛋白质中含有二硫键。 （二）检测方法： 二硝基氟苯（DNFB）法、丹磺酰氯法、氨肽酶法、C-末端氨基酸测定（肼解法、还原法、羧肽酶法） 二、蛋白质二级结构： （一）定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键为氢键。 （二）检测方法： 构象的研究方法：X射线衍射法、核磁共振光谱法、圆二色谱CD、紫外-可见差光谱、荧光探针法、激光拉曼光谱法、红外光谱法、关联规则与遗传算法。 三、蛋白质三级结构： （一）定义：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。主要的化学键：疏水键、离子键、二硫键、氢键和配位键稳定维系三级结构的作用。 （二）检测方法： 同源建模（比较建模SWISS-MODEL）法、穿针引线方法（折叠识别方法）、从头预测法、最速下降法、牛顿法、共轭梯度法、遗传算法、分解-结合法、离散化方法、分子动力学法、混合预测方法、粒子群优化算法(PSO)。 四、蛋白质四级结构： （一）定义：有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。 （二）检测方法： 线性降维法：Swiss-Prot数据库中抽取数据集进行四级结构预测。 Quat-PRE方法：综合运用mRMR方法和SVM的wrapper方法进行四级结构预测。 最近邻居算法：从蛋白质一级序列出发，利用蛋白质序列氨基酸组成、二肽组成以及混合组成方法对蛋白质单聚体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和八聚体进行分类研究。
聚丙烯酰胺特性黏度的测定及分子量计算
聚丙烯酰胺特性黏度的测定及分子量计算 根据中国国家标准GB12005.聚丙烯酰胺的分子量用特性黏度法测定；水解度用中和法测定；残余单体的含量大于0.01%吋用气相或液相色谱法测定.大于0.5%时用溴化法测定。 (1)特性黏度的测定及分子量计算 ①测定原理：按规定条件制备浓度为0.0005-0.OOlg/mL的试样溶液，该溶液以氯化钠溶液为溶.c(NaCl)=1.00mol/L。用气承液柱式乌式毛细管黏度计分别测定溶液和溶剂的流经时间.根据测得值计算特性黏度。本方法适用于不同聚合方法制备的粉状和胶状非离子型聚丙烯酰胺和阴离子型聚内烯酰胺。 ②仪器 a、玻璃毛细管黏度计：采用GB1632规定的稀释型乌氏毛细管黏度计，如图4.73所示，阳离子聚丙烯酰胺
技术要求如下： i、应使浓度为lmol/L的氯化钠水溶液在30°下的流经时间在 100-130s范围内； ii、型号为4-0.55和4-0.57，其中4表示定量球6的容积（单位mL).0.55和0.57表示毛细管内径（单位mm)。 b、恒温水浴：控温精度士0.05°C。 c、秒表：分度值0.Is。 d、分析天平:感量0.OOOlg。 e、容量瓶：容积25mL、50mL、100mL、200mL。阳离子聚丙烯酰胺厂家 f、移液管：容积5mL、10mL、50mL? g、具塞锥形瓶：容积250mL。 h、玻璃砂芯漏斗：G-2型。 i、烧杯：容积lOOmL。
j、量筒：容积50mL。 k、注射器、乳胶管洗耳球等。 ③试剂和溶液:本分析方法所用的试剂和水，均为分析纯试剂和蒸馏水。 a、氯化钠溶液：将氣化钠用蒸馏水配制成c(NaCl)=l.OOmol/L和 c(NaCl)=2.OOmol/L的溶液。 b、铬酸洗液。阳离子聚丙烯酰胺厂家 ④试样溶液的配制 a、粉状聚丙烯酰胺：在lOOmL容量瓶中称人0.05-0.lg均匀的粉状试样，准确至0.OOOlg。加人约48mL的蒸馏水，经常摇动容量瓶。待试样溶解后，用移液管准确加人50mL浓度2.00mol/L的氯化钠溶液，放在（30±0.05)°C水浴中。恒温后，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用于燥的玻璃砂芯漏斗过滤，即得试样浓度约 0.0005-0.001g/mL 且氯化钠浓度为l.OOmol/L的试样溶液，放在恒温水浴中备用。 b、胶状聚丙烯酰胺：在已准确称量的lOOmL烧杯中，称人固含量为8%-30%的胶状试样0.66-1.25g.精确至0. OOOlg。加入50mL蒸馏水.搅拌溶解后，转移入200mL容量瓶中。加人lOOmL浓度为2.00mol/L 的氯化钠溶液.放在恒温水浴中。恒温后，用蒸馏水稀释至刻度.摇匀，用千燥的玻璃砂芯漏斗过滤，即得试样浓度约为0. 0005-0.001g/mL,且氯化钠浓度1.00mol/L的试样溶液，放在恒温水浴中备用。阳离子聚丙烯酰胺厂家
蛋白质含量测定方法及其比较资料2
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定粗纤维素中蛋白质含量 1、原理 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。 2、试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 2.1 硫酸铜。 2.2 硫酸钾。 2.3 硫酸。 2.4 2%硼酸溶液。 2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 2.6 30%氢氧化钠溶液。 2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。 3、仪器 安全管导管汽水分离管样品入口塞子冷凝管吸收瓶隔热液套反应管蒸汽发生瓶 如图1所示：
图1 3、操作步骤 3.1样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。但是此法比较危险，不易在实验室演示，现在大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个（一次可以消煮16个样品）样品处理，并有通风橱进行通风，温度可以自己设定，更加安全和可操作性，因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。 一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解。 3.2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 3.3、向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。 4、计算 X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
SDS-PAGE电泳问题总结
SDS-PAGE电泳问题总结(2012-04-19 20:07:12)转载▼ 标签：杂谈分类：々☆常用技术☆々 蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？ 回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不 一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善 胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量 丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15 ％15～45 kDa 12.5％15～60 kDa 10 ％18～75 kDa 7.5％30～120kDa 5 ％60～212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政 每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区 间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家 尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。 下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了 SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降 低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。 做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的 加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久， 否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很 简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不 如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。
凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其消化
凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其消化、蒸馏 以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法，是国际上通用的标准方法，操作简单，测定结果重复性和重现性都很好，广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定氮法。其测定原理相同，主要区别在于常量法的样品及试剂用量较微量法多。而微量法则具有实验规模小，实验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量法要差一些。凯氏定氮法整个测定过程分为消解、蒸馏、滴定三步。凯式定氮法包括消化炉和蒸馏装置，它们的结合能够让实验尽可能的简单。 要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度，认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项，就显得尤为重要。 实验过程操作 1、主要试剂的配制 40%氢氧化钠：化学纯400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。 2%硼酸：分析纯20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。
0.05mol/L盐酸：分析纯4.2ml盐酸定容至1000ml，通过无水碳酸钠标定。 混合指示剂：把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚绿溶液5份和溶于95%乙醇的0.l% 甲基红溶液1份混合而成. 2、实验过程注意事项 (1)样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g;半固体试样一般取样范围为 2.00g~5.00g;液体样品取样10.0mL~25.0mL(约相当氮30mg~40mg)。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 (2)样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低，或者用滤纸包裹好一起投入消化，滤纸影响通过空白扣除。消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。 (3)消化时，不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品
聚丙烯酰胺PAM
PAM申华原料规格： 申华化学工业有限公司 原料规格表M40-RAD-01 RAW MATERIAL SPECIFICATION 1、原料名称（Material） 原料编号（Code No.）M-4030 版别：1.0 原料名称（Material）聚丙烯酰胺(部分水解)〖Polyacrylamide (PAM)〗 2、规格项目（Specifications） 规格项目（Specifications）指标（Limits）测试方法（Test Method） Appearance White Grain Total Solid / % ≥90 Solubilization Speed / hr ≤1.5 Anion Content / % 20-30 即水解度 Free Monomer / % ≤0.05 3、分子式（Formula） ?[?CH2?CH?]m?[?CH2?CH?]n? ∣∣ C＝O C＝O ∣∣ NH2O Na 4、分子量（Molecular Weight）：3000,000-13000,000 聚丙烯酰胺(cpolyacrylamids)简称PAM，是一种线型高分子聚合物，是水溶性高分子化合物中应用最为广泛的品种之一，聚丙烯酰胺和它的衍生物可以用作有效的絮凝剂，增稠剂，纸张增强剂，以及液体的减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、煤矿、矿冶、地质、轻纺，建筑等工业部门。 一、市售产品规格及主要技术指标 技术指标名称PAM 阴离子PAM 非离子PAM 阳离子PAM 复合离子 外观白色或微黄色粉末 粒径，mm < 2 固含量(%) ≥ 88 溶速(mim) ≤ 1.5 不溶物(%) ≤ 2 分子量(万) 500-2400 300-600 300-800 800-1500 水解度(%) 13-30 5-15 离子度5-50 10-20 注：根据用户要求，分子量控制在表格所定指标的范围内根据市场价格面议 加强混凝作用 ⑴聚合氯化铝（PAC）聚合氯化铝又名碱式氯化铝或羟基氯化铝。它是以铝灰或含铝矿物作为原料，采用酸溶或碱溶法加工制成。其分子式为[Al2(OH)nCl6-n]m ，其中m为聚合度，单体为铝的羟基配合物Al2(OH)nCl6-n ，通常n=1~5，m≤10。聚合氯化铝溶于水后，即
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
蛋白质相对分子质量的测定(SDS法)
蛋白质相对分子质量的测定 (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法) 一、实验原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 二、仪器及器材 垂直电泳槽及附件、直流稳压稳流电泳仪、移液器等。 三、试剂 1、凝胶贮备液：称取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），蒸馏水溶解后定容至100mL，滤纸过滤贮存。 2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺（AP），用时现配。 4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。 5、电极缓冲液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.3，加蒸馏水至1 000ml。 6、样品溶解（缓冲）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.0，再加0.1g溴酚蓝、2.5mL巯基乙醇，定容至100mL。 7、下层胶（分离胶）缓冲液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至8.8，加蒸馏水至100ml。 8、上层胶（浓缩胶）缓冲液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至6.8，加蒸馏水至100ml。 9、固定液：25%异丙醇，10%乙酸。 10、染色液：0.125g考马斯亮蓝R-250加固定液250ml。 11、脱色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。
SDS-PAGE凝胶电泳
蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 一目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二原理 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量 三试剂和器材 试剂：1低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液） 3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用 4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml 5 10%(w/v)SDS 6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配） 7 四甲基乙二胺（TEMED） 8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。 9 2×样品稀释液：SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 四操作步骤 1分离胶制备： 凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2 水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7 10% SDS ml 0.3 10% 过硫酸铵ml 0.1 TEMED (μL) 20 将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
实验六报告： SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1] 。 通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成 带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅 使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率 主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带 来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电 荷量约为蛋白质本身静电荷 10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷
聚丙烯酰胺
阴离子聚丙烯酰胺（PAMA）根据不同用途和用户对产品性能的要求可选用不同分子量使用，可用作：1、工业废水处理；2、饮用水处理；3、淀粉厂及酒精厂的流失淀粉及洒槽的回收；4、三次采油的驱油剂；5、调剖堵水剂；6、造纸助剂阳离子聚丙烯酰胺（PAMC）是由乙烯基阳离子单体和丙烯酰胺共聚而成，是一种线型高分子聚合物，可用于：1、污泥脱水；2、生活污水和有机废水的处理；3、自来水厂的高效絮凝剂；4、造纸增强剂；5、油田化学助剂 非离子聚丙烯酰胺（PAMN）是由丙烯酰胺均聚而成，纯度高，离子化成度低，性能好，用途广。可用作：1、各种改性聚丙烯酰胺的基础原料；2、纺织工业助剂； 3、污水处理剂； 4、堤坝、地基、隧道等堵水的化学灌浆剂； 5、固沙剂； 6、土壤改良剂； 7、油田调剖堵水剂； 8、建筑业、建筑胶水，内墙涂料等方面。 两性离子聚丙烯酰胺（PAMCA）是由乙烯酰胺和乙烯基阳离子单体丙烯酰胺单 体水解共聚而成、经红外光谱分析，该产品链结上不但有丙烯酰胺水解后的“羧基阴电荷，而且还有乙烯基阳电荷。”因此，构成了分子链上既有阳电荷，又有阴电荷的两性离子不规则聚合物。可用作：1、调剖堵水剂；2、最新型水处理剂；3、污泥脱水剂；4、造纸化学助剂
聚丙烯酰胺简称PAM，亦称三号凝聚剂，分子式为，是线状水溶性高分子聚合物，分子量在 300-1800万之间，外观为白色粉末状或无色粘稠胶体状，无臭、中性、溶于水，温度超过120℃时易分解。 聚丙烯酰胺分子中具有阳性基因（－CONH2)，能于分散于溶液中的悬浮粒子吸咐和架桥，有着极强的絮凝作用，因此广泛用于水处理及电力、采矿、选煤、石棉制品、石油化工、造纸、纺织、制糖、医药、环保等。 名称分子量(万) 离子度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 阳离子聚丙烯酰胺 CPAM 300-1200 10-50 1-14 ≥90 0.05 白色干粉 名称分子量(万) 水解度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 阴离子聚丙烯酰胺 APAM 300-1800 10-50 7-14 ≥90 0.05-0.15 白色颗粒粉末 名称分子量(万) 离子度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 非离子聚丙烯酰胺 NPAM 200-600 ≤3 1-8 ≥90 ≤0.05 白色颗粒粉末 名称分子量(万) 阳离子度% 阴离子度% PH 固含量% 外观 两性离子聚丙烯酰胺 NPAM 1000-6000 5-50 8-25 1-14 ≥90 白色粉末 1．阴离子：结构式〔 CH2 CH 〕n CONH2 非离子：结构式：[—CH—CH2—CH—CH2—]n CONH2 CONH2 阳离子：结构式：[—CH—CH2—CH—CH2]n CONH2 CONHCH2N（CH3）2 2．物理特性；本产品为胶体和粉剂。胶体产品为无色透明、无毒性、无腐蚀。粉剂为白色粒状或细粉末状固体，两者均能溶于水。吸水速度随衍生物离子特性的区别而不同。但几乎不溶于一般溶剂（苯、甲苯、乙醇、乙醚、丙酮、酯类等），仅在乙二醇、甘油、冰醋酸、甲酰胺、乳酸、丙烯酸等溶剂中能溶解1%左右。不同品种，不同分子量的产品有不同的性质。 3．用途：主要用于采油、制糖、洗煤、选矿、造纸、涂料、湿法冶金，纺织、石料切割、化工、农药、医药以及污水处理等等。胶体及粉剂聚丙烯酰胺可根据用户提供的产品质量要求生产含量、分子量、水解度各异的产品。 PAM絮凝剂由于应用范围十分广泛，而各种应用对其所要求的性能各不相同，为满足各类用途的需要，世界各国研制了非常复杂的品种和规格，现已形成了
聚丙烯酰胺
阴离子聚丙烯酰胺(PAM) 已阅：1897 2010-3-13 聚丙烯酰胺是一种线性的高分子聚合物，分子式为 (CH2CHCONH2）n, 简称PAM.它易溶于水,几乎不溶于苯、酯类和 丙酮等一般的有机溶剂，其水溶液几近透明的粘稠液体，属非危险 品；固体PAM热稳定性好，加热到100℃稳定性良好，但在150℃ 以上时会分解。聚丙烯酰胺及其衍生物可以用作有效的絮凝剂、增 稠剂、纸张增强剂和减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、 煤炭、地质和建筑等行业。 主要优点：絮凝性：PAM能使悬浮物体通过电中和，架桥吸附作用起絮凝作用。粘和性：能通过机械的、物理的、化学的作用起粘和作用。降租性：PAM能有效地降低流体的磨擦阻力，可降租50-60%。增稠性：PAM在中性和酸性条件下有增稠作用。 主要产品：驱油用新型聚丙烯酰胺项目指标 产品用途： 水解度%≤25 驱油剂:在三次采油时,在单一的水驱中加入聚丙烯酰胺能使水增粘,从而增加原油产量,降低含水率,提高驱油效率.固含量%≥89 残留单体含量%≤0.1 不容物含量%≤0.2 滤过比%≤2.0容解时间≤2小时表面粘度≥11.0mpa.s分子量(百万)17-25 . 阴离子聚丙烯酰胺: 本产品为水溶性高分子聚合物。不溶于大多数有机溶剂，具有良好的絮凝性，可以降低液体之间的摩擦阻力。 应用范围: 1、主要用于污泥脱水，降低污泥含水率。 2、可用于工业废水、生活污水的处理。 3、用于造纸工业，可提高纸张的干湿强度，提高细小纤维及填料的保留率。 质量指标：
1、外观：白色细砂状粉末或无色透明胶体。 2、离子度：0～100% 3、分子量：800万～1500万。 使用方法及注意事项: 1、产品配成0.1%浓度的水溶液，以不含盐的中性水为宜。 2、溶解时，将本产品均匀撒入搅拌的水中，适当加温(<60℃)可加速溶解。 3、通过小试，确定本产品的最佳用量。 4、固体产品用聚丙稀编织袋包装，内衬塑料袋，每袋25公斤;胶状体用纤维桶包装，内衬塑料袋，每桶50公斤或200公斤。 5、本产品有吸湿性，要密封存放在阴凉干燥处，温度要低于35℃。 6、固体产品避免撒在地上，以防产品吸潮后使地变滑。 阳离子聚丙烯酰胺(PAM) 已阅：1651 2010-3-11 聚丙烯酰胺是一种线性的高分子聚合物，分子式为 (CH2CHCONH2）n, 简称PAM.它易溶于水,几乎不溶于苯、酯类和 丙酮等一般的有机溶剂，其水溶液几近透明的粘稠液体，属非危险 品；固体PAM热稳定性好，加热到100℃稳定性良好，但在150℃ 以上时会分解。聚丙烯酰胺及其衍生物可以用作有效的絮凝剂、增稠剂、纸张增强剂和减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、煤炭、地质和建筑等行业。 主要优点：絮凝性：PAM能使悬浮物体通过电中和，架桥吸附作用起絮凝作用。粘和性：能通过机械的、物理的、化学的作用起粘和作用。降租性：PAM能有效地降低流体的磨擦阻力，可降租50-60%。增稠性：PAM在中性和酸性条件下有增稠作用。