印楝素对大型溞生存 生长和繁殖的毒性效应

第28卷第2期大连海洋大学学报Vol.28No.2 2013年4月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr.2013

文章编号:2095-1388(2013)02-0121-06印楝素对大型溞生存二生长和繁殖的毒性效应

刘青1,李扬1,何芳1,张清靖2,倪健3,邵森林1

(1.大连海洋大学辽宁省水生生物学重点实验室,辽宁大连116023;2.北京水产科学研究所,北京100068;3.新疆赛湖渔业

科技开发有限公司,新疆博乐833400)

摘要:通过急性二慢性毒性试验,研究了质量分数为0.32%的印楝素乳油对大型溞Daphnia magna生存二

生长和繁殖的影响三急性毒性试验结果表明:印楝素对大型溞24h和48h的半致死浓度LC50分别为39二

17μg/L,安全浓度为1.12μg/L,属于剧毒物质三慢性毒性试验结果表明:在试验浓度范围内,随着印楝

素浓度的增加,大型溞的内禀增长率(r m)二产幼次数二总繁殖量二平均世代周期(T)二净生殖率(R0)和存

活时间均呈现降低趋势;低浓度组(0.432二0.768二1.120μg/L)大型溞的r m与对照组(空白对照和丙酮

对照)差异不明显(P>0.05),当印楝素浓度升高至1.340二2.400μg/L时,大型溞的r m逐渐下降,从

0.3476d-1降至最低值0.3063d-1;而最高印楝素浓度组(2.400μg/L)大型溞的存活时间二R0二T二产幼

次数和总繁殖量均为最低,分别为13.60d二24.6961二11.4399d二2.47次二26.87个三本研究表明,高浓

度印楝素显著缩短了大型溞的存活时间,降低了净生殖率R0二平均世代时间T二产幼次数和总繁殖量三

关键词:印楝素;大型溞;毒性;内禀增长率;存活;繁殖

中图分类号:Q959.223 文献标志码:A

印楝素是印楝Azadirachta indica种仁中所含的次生代谢产物,属于四环三萜类物质,在结构上类似于昆虫的蜕皮激素三在昆虫防治上,主要通过破坏昆虫口器的化学感受器使昆虫产生拒食作用,扰乱昆虫内分泌激素的平衡,进而影响昆虫的生长发育和繁殖[1-2]三印楝素对非靶标的鱼类二鸟类二哺乳动物具有低毒二易分解二无残留等特性,是理想的植物源杀虫剂[3-4],现已在全球范围内广泛应用于农业和森林病虫害的防治[5-6]三在大量使用的过程中,印楝素会随着雨水冲刷二人工喷洒等过程进入到天然水环境[7],进而通过食物链的富集进入生物体内,并对低等水生生物产生一定的影响三因此,评价印楝素对低等水生生物的影响具有重要意义三

大型溞Daphnia magna在水生态系统中处于重要位置,具有生活周期短二繁殖快二易于培养二对毒物敏感二经济实惠二使用简便等优点,已广泛应用于各种有毒有害物质的毒性评价中[8-9]三目前关于印楝素对低等水生生物影响的报道很少,仅见Kreutzweiser[7]报道了印楝素对几种底栖动物的毒性以及联合国粮食与农业组织(FAO)报告中公布了印楝素对几种水生无脊椎动物的毒性[10],而国内关于印楝素对低等水生生物影响的研究尚未见报道三本研究中,作者以大型溞为试验动物,通过急性二慢性毒性试验,研究了质量分数为0.32%的印楝素乳油对大型溞生存二生长和繁殖的影响,旨在对印楝素的安全性评价提供基础依据三

1　材料与方法

1.1　材料

大型溞由大连海洋大学水生生物实验室提供,从人工气候箱(RTOP-500D)中挑选健康个体,用同一母体繁殖的后代进行克隆培养,连续培养达到试验所需幼溞数量三大型溞的饵料为四尾栅藻Scenedesmus quadricanda,由大连海洋大学水生生物实验室提供三

试验用0.32%(质量分数,下同)印楝素乳油由沈阳东大迪克化工药业有限公司生产,采用丙酮助溶三使用时先配制浓度为1000mg/L的母液,再按试验浓度逐级稀释,母液现配现用三

试验用水为曝气除氯24h以上的自来水,pH 为8.7,溶解氧为6~8mg/L,试验容器均用体积

　收稿日期:2013-02-28

　基金项目:国家大宗淡水鱼类产业技术体系项目(CAR-46-26)

　作者简介:刘青(1966-),女,副教授三E-mail:liuqing@https://www.360docs.net/doc/d84177121.html,

分数为4%的硝酸浸泡24h 后使用三1.2　方法

1.2.1　急性毒性试验　采用静态试验方法,在人工气候箱中进行三设置1个空白对照组和1个丙酮对照组(丙酮含量为18mg /L),并根据预试验结果,按等对数间距分别设置5个印楝素浓度水平:

24h 急性毒性试验中浓度设置为18二24二32二43二58μg /L,48h 急性毒性试验中浓度设置为10二13二18二24二32μg /L,每个浓度梯度设3个平行三试验容器为100mL 的烧杯,每个烧杯中放入80mL 试验溶液和20只出生6~24h 的大型溞幼溞三以受试溞心脏停止跳动为死亡标志,判断方法详见‘水生生物毒性试验方法“[11]三应用SPSS 16.0软件中的Probit 命令对死亡率进行计算,得到印楝素对大型溞的24h LC 50和48h LC 50及其相应的95%置信区间,并按照下式计算安全浓度(Sc )[12]:

Sc =48h LC 50×0.3

(24h LC 50/48h LC 50)2

三

(1)

1.2.2　慢性毒性试验　以24h 和48h 的LC 50计算得出的印楝素对大型溞安全浓度(1.12μg /L)为基础,设置5个印楝素浓度水平(0.432二0.768二1.120二1.340二2.400μg /L),同时设置空白对照

和丙酮对照组,每个浓度梯度设15个平行三试验容器为50mL 的玻璃瓶,每瓶放入40mL 试验溶液和1只出生6~24h 的幼溞三试验在人工气候箱中进行,温度为(23±1)℃,光周期为12L ∶12D,湿度为50%三每24h 更换1次试验溶液,试验期间用新鲜四尾栅藻投喂,投饵密度为2.0×105~3.0×105个/mL三同时取出新生幼溞,并记录母溞第1次产幼时间二第1次产幼数二产幼总数二总胎数和死亡数,时间持续到所有受试个体全部死亡为止,最后测量母溞的体长三大型溞的内禀增长率(r m )采用文献[13]

中的Euler 方程计算:

∑e -r m

x l x m x

=1三(2)

r m 的精确值是在粗略计算的基础上采用逐步逼近法得出三

大型溞的净生殖率(R 0)二平均世代时间(T )和周限增长率(λ)根据下式进行计算:

R 0=

∑l x m x ,

(3) T =ln R 0/r m ,(4) λ=e r m ,

(5)

其中:x 为日龄;l x 为第x 天大型溞的存活率;m x 为每只母溞在第x 天的产幼数三1.3　数据处理

试验数据用Excel 2007软件进行处理,采用

SPSS 16.0进行单因素方差分析和Duncan 多重比较三显著性水平设为0.05三

2　结果与分析

2.1　印楝素对大型溞的急性毒性

从表1可见,急性毒性试验中,大型溞的死亡率随着印楝素浓度的增加而升高三24h 急性毒性试验中,除两个较低浓度组(18μg /L 和24μg /L)外,其他3个浓度组大型溞的死亡数与对照组均有显著性差异(P <0.05);48h 急性毒性试验中,各浓度组与对照组均有显著性差异(P <0.05)三经计算得到印楝素对大型溞的24h LC 50和48h LC 50分别为39μg /L 和17μg /L,95%置信区间分别为

34~46μg /L 和15~20μg /L,印楝素对大型溞的安全浓度为1.12μg /L三

表1　印楝素对大型溞的急性毒性试验结果

Tab.1　Acute toxicity of azadirachtin to water fleas Daphnia magna

印楝素浓度/(μg四L -1)azadirachtin concentration

试验溞/个

number of test animal

死亡溞death number /个

24h 48h 死亡率mortality /%

24h 48h 0(空白对照)200a

a

000(丙酮对照)

200a 0a

00

1020-2.5±0.7b -12.5±3.51320-

5.0±0c

-

25.0±0

18200

a

8.0±1.4d

040.0±7.124204.0±1.4ab 17.0±1.4e 20.0±7.1

85.0±7.132207.5±2.5

bc 19.0±1.4

e

37.5±14.895.0±7.1

432012.0±1.4cd

-60.0±7.1-58

20

15.0±0d

-75.0±0

-注:同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P <0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P >0.05),下同三Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia.

2

21大连海洋大学学报 第28卷

2.2　印楝素对大型溞的慢性毒性

从表2可见:当印楝素浓度为0.432μg /L 时,大型溞的存活时间与对照组没有显著性差异(P >0.05);当浓度升高到0.768μg /L 时,对大型溞的存活时间产生明显影响(P <0.05),且浓度越高大型溞的存活时间越短三

印楝素对大型溞的繁殖有明显影响,虽然各试验组间母溞的第1次产幼数无显著性差异(P >0.05),但母溞的第1次产幼时间随印楝素浓度的变化而变化三当印楝素浓度大于或等于1.120μg /L 时,母溞的第1次产幼时间比对照组显著提

前(P <0.05)三母溞的产幼总数和产幼总胎数均随药物浓度的升高而减少,除最低浓度(0.432μg /L)组外,其他浓度组中母溞的产幼总胎数和产幼总数均比对照组显著降低(P <0.05);当印楝素浓度为2.400μg /L 时,母溞产幼溞总数仅为26.87个,远低于空白对照组(249.93个)和丙酮对照组(203.06个),产幼胎数也仅有2.47次,

远低于空白对照组(18.71次)和丙酮对照组(18.55次)三

印楝素对大型溞生长的影响不明显,只有当浓度增大到2.400μg /L 时,才对大型溞的体长产生显著影响(P <0.05)三

表2　不同浓度的印楝素对大型溞存活、生长和繁殖的影响

Tab.2　Effect of azadirachtin on growth and reproduction of water fleas Daphnia magna

印楝素浓度/(μg四L -1)

azadirachtin concentration

存活时间/d survival time

第1次产幼时间/d first brood time 第1次产幼数/个first brood number 1个母溞的产幼总数/个number of offspring per adult 1个母溞的产幼总胎数/次number of brood 溞体长/mm

body length

0(空白对照)49.73±12.74a 7.00±0.55a

9.86±1.79a 249.93±59.41a 18.71±4.70a 2.41±0.51a

0(丙酮对照)

42.11±11.70a 6.68±0.50ab 9.09±2.25a 203.06±41.47a 18.55±3.59a 2.20±0.47ab 0.43252.60±9.39a

6.71±0.47ab 9.29±1.94a 22

7.57±30.33a

18.71±2.81a

2.39±0.40a

0.76833.67±9.11b 6.61±0.51ab 8.92±2.36a 131.85±34.40b 10.85±3.29b 2.10±0.37ab 1.12025.33±6.74c 6.31±0.48b 9.08±2.81a 99.38±27.70c 7.77±2.74c 2.21±0.58ab 1.34019.53±4.03cd 6.47±0.52b 8.73±2.34a 77.80±24.01c 5.60±1.72c 2.16±0.45ab 2.400

13.60±2.90d 6.53±0.64b 8.73±2.40a

26.87±14.51d 2.47±0.83d

1.93±0.39b 从图1可见:试验初期(10d 内),各浓度组中大型溞的存活数与对照组相差不大(P >0.05);

随着试验时间的延长,大型溞的存活数随着印楝素浓度的升高有明显变化三最低浓度组(0.432μg /L)大型溞的存活数随时间下降的变化趋势与对照组始终相差不明显(P >0.05),而最高浓度组(2.400μg /L)溞的存活数随试验时间的延长明显急剧下降三即印楝素浓度越高,大型溞的存活数随时间下降越快

三

图1　各组大型溞的存活数随时间的变化

Fig.1　Changes in survivorship of Daphnia magna in

different experimental groups over time

从表3可见:除高浓度组(2.400μg /L)大

型溞的内禀增长率(r m )和周限增长率(λ)较低外,其他各药物浓度组大型溞的r m 和λ与对照组变化不大;印楝素浓度对大型溞的平均世代时间(T )和净生殖率(R 0)影响十分明显,均随着印楝素浓度的增加而降低三当印楝素浓度为0.432μg /L 时,大型溞的T 和R 0分别为28.7239d 和

226.4897,与对照组大型溞的T 和R 0的比值分别为1.004和0.9223;但当浓度增加到2.400μg /L 时,大型溞的T 和R 0分别为11.4399d 和24.6961,与对照组大型溞的T 和R 0的比值却分别降为0.4000和0.1006三

3　讨论

3.1　印楝素对水生生物的毒性

水生生物毒性试验是预测化学物质进入水生态系统后可能产生效应的方法之一,参考一些国家的

分级标准中国将毒物分为剧毒二高毒二中等毒二低毒和微毒5个级别[12]三对溞类而言,当48h LC 50<0.1mg /L 时属于剧毒物质三本试验中0.32%印楝

3

21第2期 刘青,等:印楝素对大型溞生存二生长和繁殖的毒性效应

表3　不同浓度的印楝素对大型溞生命周期的影响

Tab.3　Effect of different concentrations of azadirachtin on life cycle of water fleas Daphnia magna

印楝素浓度/(μg四L -1)

concentration

内禀增长率r m /d -1

intrinsic increase rate

周限增长率λfinite increase rate

平均世代时间T /d mean generation time

净生殖率R 0

net reproduction rate

0(空白对照)0.35261.422828.5971245.56570(丙酮对照)

0.35371.423428.6021237.97410.4320.36121.435128.7239226.48970.7680.35851.431219.5811128.70101.1200.36291.437516.668096.43731.3400.34761.415714.752975.64062.400

0.3063

1.3584

11.4399

24.6961

素乳油对大型溞的24h LC 50和48h LC 50值分别为

0.039mg /L 和0.017mg /L,按毒物分级标准,0.32%印楝素乳油对大型溞属于剧毒物质三印楝素对水生生物的影响报道不多见,吴伟等[3]研究了印楝素对斑马鱼Danio rerio 的急性毒性,得出印楝素对斑马鱼的48h LC 50和96h LC 50分别为41.9mg /L 和23.3mg /L,属中低毒农药三如把Mar?

gosan-O 混入水中,鳟的96h LC 50为88mg /L,翻车鱼的96h LC 50为37mg /L [14],表明Margosan-O 对鱼类低毒三Kreutzweiser [7]报道了印楝素对Hyda?

tophylax argus 等几种底栖生物无明显急性毒性三联合国粮食与农业组织(FAO)[10]的报告显示,印楝素对几种低等水生生物的影响也较小,对藻类栅藻Scenedesmus subspicatus 的72h EC 50为530mg /L,对大型溞Daphnia magna 的48h EC 50为23.63mg /L三

陈小军等[15]研究表明,印楝素对水生生物无明显毒性或毒性较小三而本试验中得到的大型溞毒性试验数据与FAO 公布的数据相差很大,导致这种结果的差异有多方面的原因,可能与使用的助溶剂和药物的产地二季节二剂型二试验环境条件及受试生物的不同品系等有关三

印楝素不溶于水,本试验中用丙酮作助溶剂,丙酮为微毒或无毒物质[16],符合毒性试验要求三FAO 的数据没有助溶剂类型,对此作者不好判定三印楝素是印楝种仁中所含的次生代谢产物,为柠檬素类化合物[1-2]三试验证实,不同地区的印楝种仁中印楝素含量差别很大,印度二缅甸和泰国的印楝素含量较高,而夏季气温高的苏丹二索马里二马里和尼泊尔等国家的印楝素含量较低[17]三

除了不同的地理种源外,不同季节收获的印楝种仁中,印楝素的含量也有较大差别三印楝素杀虫剂中的主要活性成分有印楝素A 和印楝素B,通常印楝素B 的含量为印楝素A 的1/3~1/2[18]三Sidhu 等[19]认为,印楝素A 是雨季所结果实种子中的主

要代谢物,在雨季含量较高,而干季胁迫明显有利于印楝素B 的合成,在干季所结果实种子中两者含量的比例几乎相等三可见,收获季节不同,是影响印楝素A 和B 含量的主要因素三

印楝素A 和B 的稳定性和致毒作用也各不同三二者在甲醇二甲醇+水及直接热贮中均易降解,且印楝素A 降解率高于印楝素B,即印楝素B 的稳定性高于印楝素A [20]三在活体拒食和生长发育抑制试验中,印楝素A 的活性显著高于印楝素B,但对细胞核的影响中,印楝素B 的影响显著高于印楝素A,经印楝素B 处理后的细胞核破损率更大,破损程度也更严重[18]三

印楝素含量及其稳定性除受遗传因素控制外也

会因受环境因素的影响而发生变化三印楝素对光敏感,暴露在光下会逐渐失去活性;温度对印楝素的稳定性也有影响,通常需在低于20℃的温度下贮藏,高温会加速印楝素的降解;印楝素在中性条件下比较稳定,但在碱性和强酸溶液中不稳定[17]三

由此可见,作为植物源药物的印楝素,其产

地二出产季节和保存方式等都是影响药性的重要因素,会直接导致各试验结果的差异三

此外,药物的不同剂型对药效也有很大影响三印楝素有多种剂型,目前在美国登记的印楝杀虫剂产品有:Neem oil 15种二Neem oil rtu 14种二Neem oil tgai 1种二Trilogy xl 4种和Trilogy xl rtu 4种三中国批准登记的印楝素杀虫剂主要有40%二32.8%二

20%二12%和10%印楝原药及0.3%二0.32%二

0.5%二0.7%二0.8%二0.9%二1.0%和2.0%的印楝素单剂等[15]三Abou -Tarboush 等[21]以印楝杀虫剂Neemix-4.5处理SWR /J 鼠,其研究结果与之前纯印楝素对鼠的影响结果不一致三张欣等[22]研究发现,脂溶性的乳剂类除草剂丁草胺比粉剂的毒性大得多三本试验中使用的印楝素属于脂溶性,这也可能加大了印楝素对大型溞的毒性三当然,不同

421大连海洋大学学报 第28卷

溶剂二不同产地二不同剂型的印楝素对大型溞的毒性需要进一步试验证实三

3.2　印楝素对大型溞内禀增长率和繁殖的影响

一种生物的内禀增长能力决定了该种生物的生育力二寿命和发育速率,是种群增殖能力的一个重要综合指标,可以灵敏地反映出环境对一种群的影响[13]三本试验中,低浓度组(0.432二0.768二1.120μg/L)大型溞的内禀增长率与对照组(空白对照和丙酮对照)差别不大,甚至略有提高,这与一些研究结果相似三如Chu等[23]研究表明,5μg/L和50μg/L的S-烯虫酯促进了多刺裸腹溞的

种群增长三杨冬青等[24]也发现,低浓度(0.1μg/L和1.0μg/L)的β-六六六对多刺裸腹溞的种群增长也有明显的促进作用三黄国兰等[25]发现, 4.0二2.0二1.0mg/L的DBP对大型溞繁殖有抑制作用,而0.5mg/L的DBP显著提高了大型溞的净生殖率三以上研究均表明,在被低浓度药物刺激后,溞类等生物受到轻度逆境胁迫,可促使其瞬时增长率增大,以此来抵御外部不良的环境条件三本试验中随着印楝素浓度升高至2.400μg/L,大型溞内禀增长率逐渐下降为最低值0.3063d-1三Fernndez等[26]与Ferrando等[27]研究认为,种群内禀增长率的降低是杀虫剂对溞类的慢性毒性所致三本试验中,与对照组相比,高浓度组(1.340二2.400μg/L)大型溞的初次产幼时间早,产幼总数和产幼次数少,存活时间短,大型溞的内禀增长率二净生殖率和世代时间均减少三有研究表明,100二1000μg/L的β-六六六能显著缩短多刺裸腹溞的世代时间,且1000μg/L的β-六六六还能显著减小多刺裸腹溞出生时的生命期望值和净生殖率[24]三Chuah等[28]研究也表明,0.002mg/L的硫丹能显著降低多刺裸腹溞的平均寿命二首次生殖年龄和种群内禀增长率三高浓度二亚致死剂量的杀虫剂使浮游动物母体中毒加深,影响了母体的机能二生存和繁殖,即对浮游动物的种群增长产生抑制作用[29-30],这已是不争的事实三

有研究报道,在药物作用或生存环境改变的条件下,枝角类能改变生殖方式,产生休眠卵[31-33]三本试验中,随着印楝素浓度的增加,产生休眠卵的个体及每个个体产休眠卵的数量也增加,并且是在没有雄性个体的情况下由雌体直接产生三这种情况在蚤状溞种群中出现过,即在没有雄体时也能进行有性生殖,雌体直接产生卵鞍,并在未受精的情况下孵出幼溞[34-35]三本试验中,除0.432μg/L浓度组外,其他浓度组的大型溞均有几次在生殖高峰后产生休眠卵,这可能与印楝素的药性以及没有迅速移除幼溞二试验水体较小有关,造成母溞一段时间处于劣质的环境中而产生了休眠卵三

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The toxicity of azadirachtin to survival,growth and reproduction

of water fleas Daphnia magna

LIU Qing1,LI Yang1,HE Fang1,ZHANG Qing?jing2,NI Jian3,SHAO Sen?lin1

　(1.Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian116023,China;2.Beijing Fisheries Research Institute,

Beijing100068,China;3.Xinjiang Saihu Fishery Technology Development Co.,Ltd.,Bole833400,China)

Abstract:The toxic effects of0.32%azadirachtin EC on survival,growth and reproduction of water fleas Daphnia magna were studied by acute and chronic toxicity tests.The acute toxicity test showed that azadirachtin as a highly toxic substance had the24h LC50of39μg/L,48h LC50of17μg/L and the safety concentration of1.12μg/L for the water fleas.The Chronic toxicity test revealed that the water fleas showed decrease in intrinsic rate of population increase(r m),number of clutches per female,total offspring per female,generation time(T),net reproductive rate(R0),and survival time with the increasing azadirachtin concentration.There was no significant difference in the r m in the water fleas between the control group and low concentration groups(0.432,0.768and1.120μg/L) (P>0.05).The r m was decreased from0.3476d-1at insecticide concentration of1.340to0.3063d-1at insecti?cide concentration of2.400μg/L.The minimal number of clutches per female(2.47times)and total offspring per female(26.87ind.),the minimal survival time(13.60d),the minimal R0(24.6961),and T(11.4399d) were observed at the maximal concentration of2.400μg/L.In conclusion,the findings show that high concentra?tions of azadirachtin leads to short survival time,and T,and to reduce in R0number of clutches per female and to?tal offspring per female significantly.

Key words:azadirachtin;Daphnia magna;toxicity;intrinsic rate of population increase;survival;reproduction 621大连海洋大学学报 第28卷