过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外法)
过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外法)
简介：
Leagene 过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外法)其检测原理是血清或血浆等样品H 2O 2
在240nm 处有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过H 2O 2，使待测溶液吸光度随反应时间而减少，通过紫外分光光度计检测240nm 处吸光度，根据测定吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。紫外法又称紫外分光光度计发或紫外吸收法，该酶的检测对于研究植物代谢强度及抗旱、抗病能力有一定的价值。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、配制CAT Assay buffer 工作液：按CAT Assay buffer(2.5×)：蒸馏水=1.5：1的比例
稀释，即获得CAT Assay buffer 工作液，4℃预冷，待用。
2、配制100mM H 2O 2基液：本试剂盒提供的H 2O 2基液中的H 2O 2浓度约为1M。由于过
氧化氢不是非常稳定，使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。把浓度约为1M 的H 2O 2基液用CAT Assay buffer 工作液稀释100倍，使H 2O 2基液中的H 2O 2浓度约为10mM。3、准备样品：
1_x0001_
细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行裂解，可以采用Leagene
Western 及IP 细胞裂解液。如为植物样品或动物组织样品可按下列步骤操作。a、取植物样品0.4-0.5g 或动物组织样品，加入预冷的CAT Assay buffer 工作液2ml，研磨匀浆，转移至15ml 离心管。再用CAT Assay buffer 工作液冲洗研磨器，合并冲洗液至该离心管，补加CAT Assay buffer 工作液至10ml 刻度。
b、混匀，4℃冰箱中静置10min，转移离心管上部的清液至新的离心管中，
c、4500g 离心15min，上清液即为过氧化氢酶提取液。-70℃冻存，用于CAT 的检测。
2_x0001_
血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备，用生理盐水10
倍稀释后，可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-70℃冻存，亦可4℃短期保存，用于CAT 的检测。
编号
名称
TO1073100T Storage
试剂(A):H 2O 2基液
2×1ml 4℃试剂(B):CAT Assay buffer(2.5×)500ml
4℃避光使用说明书
1份
3_x0001_高活性样品：如果样品中含有较高活性的CAT，可以使用CAT Assay buffer工作液稀释。
4_x0001_(选做)样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的CAT含量。
4、CAT检测：按照下表设置空白管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生
气泡。如果样品中的酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测需要设置平行复测管。
空白管测定管Ⅰ测定管ⅡCAT Assay buffer工作液 1.5ml 1.5ml 1.5ml
待测样品(或提取液)0.2ml0.2ml0.2ml
蒸馏水 1.0ml 1.0ml 1.0ml
100mM H2O2基液0.3ml0.3ml0.3ml
5、加入100mM H2O2基液，每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色皿中，在240nm 下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4次，待全部测定完毕后，计算酶活力。
蒸馏水调零，读取各管吸光度值。一般应数小时内检测完毕。
计算：
CAT活性单位的定义：在25℃1min A240减少0.1的过氧化氢酶量为一个CAT酶活力单位。根据酶活性定义，计算出样品中的CAT活性。
血清、血浆、尿液中CAT活力计算公式：
血清样品CAT活力(U/ml)=(△A240×V T×N｝/(0.1×V S×t)
组织、细胞中CAT活力计算公式：
组织样品CAT活力(U/mg)=(△A240×V T×N｝/(0.1×V S×t×W)
注意事项：
1、待测样品中不能含有CAT抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、CAT Assay buffer如果出现浑浊或絮状物，应弃用。
3、完整的红细胞以及未稀释的溶血液中的过氧化氢酶置于4℃一周仍然很稳定，稀释后
的溶血液中CAT容易失活。
4、尽量避免冰冻样品造成溶血，否则过氧化氢酶活性会下降10%-15%。
5、血清样品室温下3天内活性下降64.7%，4℃下下降10.5%，-20℃保存30天活性仅
下降3.5%。因此，待测样品均应-20℃或-70℃保存。
6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
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编号名称
CA0005氨苄青霉素溶液(Ampicillin,50mg/ml)
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过氧化氢酶活力的测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除过氧化氢酶活力的测定实验报告 篇一：实验35过氧化氢酶的活性测定 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使h2o2发生累积。h2o2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除h2o2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中h2o2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。 一、过氧化氢含量的测定 【原理】 h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被h２so4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与h2o2浓度呈线性关系。 【仪器和用具】 研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×
7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。 【试剂】 100μmol/Lh2o2丙酮试剂：取30%分析纯h2o257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（w/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。【方法】 1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。 待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm波长下比色。 2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视h2o2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管 3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算：植物组织中h2o2含量(μmol/gFw)= 式中c—标准曲线上查得样品中h2o2浓度（μmol）；Vt —样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积
过氧化氢酶
过氧化氢酶 过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。 触酶 过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。 来源 几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。 CAT是红血素酶，不同的来源有不同的结构。在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。 过氧化氢酶历史 作为一种物质，过氧化氢酶是在1811年被过氧化氢（H2O2）的发现者泰纳尔（Louis Jacques Thénard）首次发现。1900年，Oscar Loew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶，并发现这种酶存在于许多植物和动物中。1937年，詹姆斯·B·萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶，并在次年获得了该酶的分子量。1969年，牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。而后，1981年，其三维结构得以解析。 功能 过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质。而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。 但过氧化氢酶真正的生物学重要性并不是如此简单：研究者发现基因工程改造后的过氧化氢酶缺失的小鼠依然为正常表现型，这就表明过氧化氢酶只是在一些特定条件下才对动物是必不可少的。 一些人群体内的过氧化氢酶水平非常低，但也不显示出明显的病理反应。这很有可能是因为正常哺乳动物细胞内主要的过氧化氢清除剂是过氧化物还原酶（peroxiredoxin），而不是过氧化氢酶。
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－) R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【仪器和用具】 研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。 【试剂】 10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8； 0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定； 0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4?2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。 【方法】 1.酶液提取取小麦叶片 2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。 3.用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 4.结果计算： 酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示： 酶活(mg H2O2/gFW?min)= 式中A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）; W—样品鲜重（g）；
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号:BC0200规格:50T/48S 产品内容： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体100μL×3瓶，4℃保存。产品说明： CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H 2O 2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。 H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解H 2O 2，使反应溶液240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（功率20%或200w，超声3秒，间隔10秒。重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。
二、CAT 测定操作 1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至240nm 处，蒸馏水调零。 2、CAT 检测工作液的配置：用时在每瓶试剂二（100μL）中加入20ml 试剂一，充分混匀，作为工作液； 用不完的试剂4℃保存一周。 3、测定前将CAT 检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴10min。 4、取1mLCAT 检测工作液于1mL 石英比色皿中，再加入35μL 样本，混匀5s；室温下立即测定240nm 下的 初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2。计算ΔA=A1-A2。三、CAT 活性计算： 1、血清（浆）CAT 活力的计算： 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=678×ΔA 2、组织、细菌或细胞中CAT 活力计算：（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（V 样×Cpr）÷T=678×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（W×V 样÷V 样总）÷T=678×ΔA÷W 3、按细菌或细胞中CAT 活力计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/104cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=1.356×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.035×10-3L；ε:H 2O 2摩尔吸光系数，4.36×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.035mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min。 W：样本鲜重，g； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；
过氧化氢酶(CAT)活性的测定
过氧化氢酶（CAT）活性的测定：紫外吸收法 一、目的与要求 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。 二、原理 过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。过氧化氢在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。三、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：小麦或其它叶片 （二）仪器设备：1. 研钵；2.紫外分光光度计；3. 离心机；4. 恒温水浴； 5. 容量瓶。 （三）试剂： 1. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH 2P0 4 8.5 ml）； 2．0.1 mol/LH2O2 (30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml) 二、实验步骤： 1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢粗提液，5℃下保存备用。 2、测定10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1-1顺序加入试剂。 25℃预热后，逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测完后，按式（1-1）计算酶活性。
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。 仪器药品 氧电极仪记录仪 电磁搅拌器超级恒温水浴 注射器、微量注射器容量瓶 反应杯亚硫酸钠 过氧化氢酶 50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0(见附表2)。 50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。 标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶 (Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液 (pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。 操作步骤 1.仪器的标定 按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
2.绘制酶活性标准曲线 (1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。 (2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。 (3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl(例如浓度为20、30、40、50U/ml等)，记录氧释放曲线。(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。 (5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。 3.样品测定 (1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。 (3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。
高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(直接法-过氧化氢酶清除法)产品技术要求meigaoyi
高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(直接法-过氧化氢酶清除法) 适用范围：用于体外定量检测人血清中高密度脂蛋白胆固醇浓度。 1.1包装规格 a) 试剂1：2×60ml，试剂2：2×20ml； b) 试剂1：4×60ml，试剂2：4×20ml； c) 试剂1：3×60ml，试剂2：3×20ml； d) 试剂1：2×45ml，试剂2：2×15ml； e）试剂1：1×45ml，试剂2：1×15ml； f）试剂1：2×16.8ml，试剂2：2×5.6ml； g）试剂1：2×300ml，试剂2：2×100ml。 1.2主要组成成分 试剂1主要组成成分 试剂2主要组成成分
2.1 外观和性状 2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。 2.1.2 试剂1应为无色或淡黄色透明溶液；试剂2应为无色或淡黄色透明溶液。 2.2 净含量 应不低于试剂瓶标示装量。 2.3 试剂空白吸光度 测定试剂空白吸光度，应＜0.05。 2.4 分析灵敏度 测试1.0mmol/L样本时，吸光度变化（△A）应大于0.04。 2.5 准确度 用参考物质（GBW09178-GBW09180）对试剂（盒）进行测试，测定值与靶值相对偏差不超过±10%。 2.6 精密度 2.6.1重复性 在重复性条件下，测试浓度正常值和高值的样本，各重复测定不少于10次，变异系数（CV）应不超过4％。 2.6.2批间差 抽取3个不同批号试剂，测试同一浓度的样品进行重复检测，每个批号试剂检测3次，批间相对极差应不大于10％。 2.7 线性 试剂盒线性在（0.05，3.90）mmol/L范围内：
试验七过氧化氢酶活力的测定
实验七过氧化氢酶活力的测定 一、实验目的 掌握过氧化氢酶活力测定的原理和方法 二、实验原理 过氧化氢酶（catalase,CAT,EC1.11.1.6）普遍存在于植物的各种组织中，其活力大小与植物的代谢强度和抗寒、抗病能力有一定的联系，故常需进行测定。 过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为： 过氧化氢酶 2H2O2-------------------------2H2O+O2 钼酸铵 H2O2+2KI+H2SO4------------------------I2+K2SO4+2H2O I2+2Na2S2O3-------------2NaI+Na2S4O6 反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。 三、仪器、试剂和材料 1、仪器：天平，研钵，容量瓶，恒温水浴，移液管，三角瓶，滴定管。 2、试剂： （1）0.01mol|L的过氧化氢溶液； （2）1.8mol|L的硫酸溶液； （3）10%钼酸铵溶液； （4）0.02mol|L硫代硫酸钠溶液； （5）1%的淀粉溶液； （6）20%的碘化钾溶液； （7）碳酸钙粉末。 四、操作步骤 1、酶液提取：称取新鲜油麦菜0.25g，剪碎置研钵中，加入0.1g碳酸钙和2mL水研磨成匀浆，用漏斗移入50mL的容量瓶，研钵用少量的水冲洗，冲洗液也一并移入容量瓶中， 然后用水定容。摇荡片刻，静置澄清后吸取20.0mL上清液至100ml容量瓶中，加水定容，摇匀后备用。 2、取三个100mL三角瓶编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10.0ml，随即在3号瓶中加入1.8mol|L硫酸5.0ml以终止酶的活力，作为空白溶液。各瓶均加入5.0mL0.01mol|L过氧化氢溶液，每加一瓶即摇匀并开始记时。5min（必须准确）后立即向1、2号瓶各加5.0mL1.8mol|L硫酸溶液。 3、各瓶分别加入1.0mL20%的碘化钾溶液和3滴钼酸铵溶液，然后依次用0.02mol|L的硫代硫酸钠滴定，滴定至溶液淡黄色后加入5滴1%的淀粉溶液，再继续滴定至蓝色消失即到终点，记下各瓶消耗的硫代硫酸钠的体积。
植物过氧化物酶检测试剂盒(愈创木酚比色法)
植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法) 简介： 过氧化物酶(peroxisome ，POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。 Leagene 植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法)检测原理是以愈创木酚(又称2-甲氧基酚)作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的过氧化物酶活性，尤其适用于检测水果中过氧化物酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 研钵或匀浆器 3、 离心管或试管 4、 低温离心机 5、 水浴锅或恒温箱 6、 比色杯 7、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①植物样品：取2g 植物组织或水果中层果肉加入4ml 预冷的POD Lysis buffer 研磨或匀 编号 名称 TE0425 50T Storage 试剂(A): POD Lysis buffer 250ml 4℃ 试剂(B): POD Assay buffer 100ml 4℃ 避光 试剂(C): POD 氧化剂 4ml RT 使用说明书 1份
浆离心，留取上清液，冻存，用于过氧化物酶的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于过氧化物酶的检测。 ③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用POD Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于过氧化物酶的检测。 ④高活性样品：如果样品中含有较高活性的过氧化物酶，可以使用POD Lysis buffer进行恰当的稀释。 2、配制POD Assay buffer工作液：取适量POD氧化剂和POD Assay buffer，POD氧 化剂：POD Assay buffer按一定比例混合，即为POD Assay buffer工作液，即配即用，不宜久置。 3、加样：按照下表设置对照管、测定管，注意：对照管、测定管中为同一待测样品，但对 照管中为提前加热煮沸的样品。溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的POD活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行管，求平均值。 加入物(ml) 对照管测定管 待测样品0.05 0.05 POD Lysis buffer 1.45 1.45 POD Assay buffer工作液 1 1 4、POD检测：立即以分光光度计，比色杯光径1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的 吸光度(A测定0)。准确孵育后，立即加入POD终止液终止反应(备选方案)，以分光光度计，比色杯光径1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的吸光度(A测定1)。注意：加入POD终止液终止反应不是必须步骤，可准确孵育后直接以分光光度计，比色杯光径 1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的吸光度(A测定1)。 计算： POD活性单位的定义：在该实验条件下，每1min吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位。 组织样本POD(U)={(A测定1-A测定0)×V T}/(W×V S×0.01×t) 式中：A测定1=孵育3min后测定管的吸光度值 A测定0=加入POD Assay buffer工作液后立即测定的测定管吸光度值 W=组织样本的重量(g) V T=提取酶液的总体积(ml) V S=测定时所用酶液体积(ml)
过氧化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性测定 高锰酸钾滴定法 (李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理 过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 22 R(Fe OH 3+－) R(Fe2+ 2 2) 2 +2 H O 2＋O2 因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。 在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。 5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 植物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备 冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管 (三)试剂 (1)10% H2SO4 (2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液 (3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制 成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定 (4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用 0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定 (5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
测量酶方法
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。 （三）试剂 :1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至 100ml(现用现配)； 3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml， (避光保存)； 4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml； 5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml(避光保 存)。 三、实验步骤 1. 酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。 3. SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。 四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定 【实验原理】 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。 【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中] 【方法步骤】 （1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。 （2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。 表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表 4.结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 POD 总活性[u/g(FW)]= 式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。其中 △470=ACK-AE 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK ——照光对照管的吸光度。 AE ——样品管的吸光度。 Vt ——样品液总体积，mL 。 FW t V . V A T ? ? ? ? 1 470 01 0 ?
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书 微量法
过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC0205规格：100T/96S 产品内容： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体125μL×1瓶，4℃保存。产品说明： CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H 2O 2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。 H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解H 2O 2，使反应溶液240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔（UV 板）、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备 收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。二、测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零。 2、CAT 检测工作液的配制：用时在试剂二中加入25mL 试剂一，充分混匀，作为工作液。 3、测定前将CAT 检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min 以上。 4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL 样本和190μL 工作液，立即混匀并计时，记录240nm 下初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2。计算ΔA＝A1-A2。三、CAT 活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清（浆）CAT 活力的计算: 单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mL)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=459×ΔA 2、组织、细菌或细胞中CAT 活力计算：（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样)÷T=459×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g 组织每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。 CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T=459×ΔA÷W （3）按细菌或细胞数量计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT(U/104cell)＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×500）÷T =0.917×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：H 2O 2摩尔消光系数，4.36×104 L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。b.用96孔板测定的计算公式如下1、血清（浆）CAT 活力的计算:
过氧化氢酶
过氧化氢酶在不同条件下的分解 1、摘要 通过本次实验来探究在各类植物中所含的过氧化氢酶。在试验中通过过氧化氢与四种不同的蔬菜然后用排水集氧气法观察实验现象。实验结果发现马铃薯的效果最好，每一种蔬菜都有不同含量的过氧化氢酶，而这些蔬菜取材都非常的方便，这也就为以后做实验的效率变得更加高。 关键词：过氧化氢酶蔬菜氧气 Summary: Through this experiment to explore the various types of plants containing catalase. In the experiment, four kinds of vegetables were treated by hydrogen peroxide, and then the experimental phenomena were observed by the method of draining oxygen. The experimental results showed that the best effect of potato, each kind of vegetables have different content of catalase, and these vegetables are very convenient, which will be more efficient in the future to do the experiment. Key world: CAT Vegetable Oxygen 1.2 实验背景 1.2.1 什么是过氧化氢酶？ 过氧化氢酶（CAT），是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。① 1.2.2测定植物过氧化氢酶的生物学意义是? 过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内,属于活性氧清除剂,可分解机体代谢过程中产生的活性氧如过氧化氢,超氧阴离子等,这些物质可对机体尤其是质膜产生毒害作用,测定这种酶的活力可以评价机体受活性氧毒害程度.过氧化氢酶的活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系,可以根据这种酶的活性水平判断植物是否受到氧化损伤（比较某种因素或者复合因素作用下与正常状态下的酶活水平）。② 2、材料与方法 2.1实验对象 马铃薯、菠菜、苹果、青菜 2.2实验器材 锥形瓶、试管、塑料水槽、电子天平、称量纸、导管、量筒、剪刀、研钵、
(整理)过氧化氢酶与过氧化物酶
过氧化氢酶与过氧化物酶 朱忠勇(南京军区福州总医院, 福州350025) 过氧化氢酶和过氧化物酶, 是两种广泛存在于 动植物体内、含血红素(铁卟啉) 辅基的氧化还原酶。由于它们作用的底物都有过氧化氢, 所以在一些医 学检验杂志或教科书上, 往往将它们混淆, 甚至对其 作用机理作不恰当的解释。 1过氧化氢酶 过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase) 又称触酶(Catalase) , 其系统名称(Systemat ic name) 是: H2O 2: H2O 2氧化还原酶(H2O 2 ÷H2O 2 O xido redu2 catase) , 国际酶学委员会的编号为EC 11111116, 其 催化反应式如下: H2O 2+ H2O 2 触酶 2H2O + O 2 在这个反应中, 底物只有一种——过氧化氢。实 际上是一分子的H2O 2作为氢(电子) 的供体, 被氧 化成O 2; 而另一分子H2O 2被还原为H2O。 2过氧化物酶 过氧化物酶(Peroxidase) 也有人简称过氧化酶, 其系统名称是: 供体: 过氧化氢氧化还原酶(Dono r: H2 O 2O xido reductase) , 编号为EC 11111117。其催化反应式为: 供体+ H2O 2 过氧化物酶 氧化的供体+ H2O 或更简明地表达为 RH2+ H2O 2 过氧化物酶 R + 2H2O (供体) (氧化的供体) 在这个反应中, 底物有两个; 一个是H2O 2, 另一个 为一种氢(电子) 的供体(Dono r)。在医学检验中, 多 用胺类(如联苯胺, 二氨基联苯胺, 联邻甲苯胺等) 作为供体(也可以用酚) , 因为这些物质脱氢后往往 会呈现颜色。 由上述两种反应可以清楚地看出, 两种酶的区 别是十分明显的。触酶只有一种底物, 生成的是水和氧气。而过氧化物酶则要两种底物, 其反应的实质是: 酶催化供体脱氢(氧化) , 同时催化脱下的氢使 H2O 2还原为H2O。在这个反应中, 如果只有H2O 2, 没有供体, 反应不能进行。在整个反应过程中不产生氧
过氧化氢酶活力的测定
实验三过氧化氢酶活性得测定 一、实验目得: 了解过氧化氢酶得作用,掌握碘量法测定过氧化氢酶活性得原理与方法; 二、实验原理: 过氧化氢酶就是一类色素蛋白,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水与分子氧,在此过程中起传递电子得作用,过氧化氢既就是氧化剂又就是还原剂。 R(Fe＋2)2＋H2O2---R(Fe+3OH)2 R(Fe+3OH)2+ H2O2 ----R(Fe＋2)2+2H2O+O2 并合上式:H2O2 ----2H2O+O2 据此,可根据消耗H2O2得消耗量或O2得生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量得过氧化氢溶液,经酶促反应后,加入过量得KI溶液生成得I2用标准得Na2S2O3滴定,根据N a2SO3消耗得体积计算H2O2得消耗量。 三、实验材料、仪器与试剂: 1、实验材料:小白菜 2、仪器:恒温水浴锅、研钵、容量瓶、刻度吸管、100mL三角瓶 3、试剂: (1)0、05mol/L H2O2 (2)2mol/LH2SO4 (3)0、1mol/L Na2S2O3 (4)1%淀粉溶液(5)10%(NH4)6Mo7O24 (6)pH7、8得磷酸缓冲液(7)20% KI (8)CaCO3 四、实验步骤: (1)酶液提取: 称取2.5g白菜叶,加少量CaCO3,2mLpH7、8得缓冲液少量,研成匀浆,移入100ml 容量瓶,用上述缓冲液冲洗研钵数次转入容量瓶中定容,静置10分钟,过滤。取滤液10mL于另一100mL得容量瓶中稀释定容待测(根据酶活高低而定)。 (2)酶促反应: 取锥形瓶4个,编好号各加入10ml酶液之后,立即向两个瓶中加入2mol/L H2SO45mL,终止酶活性,作空白对照。向另外两瓶各加H2O25mL,摇匀,在加入H2O2得那一刻起,记录时间,5分钟后迅速向实验瓶中加入2mol/LH2SO45mL,终止酶活性。向三角瓶中加1mL 20% KI与3滴(NH4)6Mo7O24,摇匀后迅速用标准Na2S2O3溶液进行滴定至淡黄色,加入1mL1%淀粉指试剂,蓝色恰好消失,记录消耗得Na2S2O3得体积V0,V;
鸡肝中过氧化氢酶提取,和大肠杆菌质粒提取详解
大肠杆菌中质粒的小量提取及核酸电泳 摘要：采用碱裂解法将大肠杆菌中的质粒DNA分子进行分离和纯化，将分离纯化后的质粒DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外成像仪中观察DNA条带，以测定所得到的质粒DNA片段的分子量大小。结果表明，成功从大肠杆菌中提取出质粒DNA分子，其分子量大小约为2000bp。 关键词：质粒DNA分子；碱裂解法；分子量；电泳 引言 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在碱性电泳缓冲液中带负电荷，所以在外加电场作用下会向正极迁移。将提取到的DNA 分子提取液中加入核酸染色剂，经过琼脂糖凝胶电泳后，利用紫外灯照射即可观察到所提取的DNA条带，第一泳道加入合适的Marker 与之进行比对，即可较为准确地估测出所提取出的质粒DNA分子量。 1 材料与方法 1.1 实验材料 (1) 含质粒Psd-T19的大肠杆菌 (2) 试剂：细菌质粒小量提取试剂盒、琼脂糖，电泳缓冲液（TAE），核酸电泳上样缓冲液（6×），标准分子量的DNA等。 1.2 实验仪器 微量移液器、试管、微波炉、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、天平。 1.3 质粒的提取（小量试剂盒提取） (1) 首先取1.5ml混匀的菌液于1.5ml离心管中，台式离心机中12000r/m离心1min，弃上清液得到大肠杆菌菌体； (2) 按照试剂盒提取的步骤提取出大肠杆菌质粒DNA。
1.4 核酸电泳 (1) 制备1%琼脂糖凝胶，并添加GoldVied I核酸染料； (2) 加样：在离心管中混合DNA样品2-3ul和1ul上样缓冲液。采用梯度上样，上样量分别为2ul、4ul、6ul、8ul和5ulDNA分子量标记； (3) 电泳：120V，40min； (4) 观察：将电泳后的凝胶放置于透射紫外光下进行观察，对照分子量标记判断DNA样品的分子量大小。 2 实验结果与分析 大肠杆菌在37℃恒温摇床中220r/min培养24h，离心收集菌液收集菌液，之后按照试剂盒的操作步骤进行质粒提取纯化，最后进行核酸电泳，电泳图如图1-1所示。其中1,2,3,4分别代表质粒的上样量分别为2μL，4μL，6μL，,8μL，M代表5μL标准品。 DNA分子的分子量、分子构型的差异和所带电荷多少，都会影响电场中其迁移速率，另外琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH 和电泳时的温度等也影响迁移率，从而使DNA分子在凝胶中出现不同的区带。如图1-1所示，从大肠杆菌中提取的质粒DNA分子的分子量大小为2000bp，梯度上样的对比结果表明最适上样量为6ul。 图1-1 1％核酸电泳图