浸泡对玉米SOD和醇溶蛋白提取的影响
浸泡对玉米SOD和醇溶蛋白提取的影响
赵华张英华
（天津科技大学生物工程学院，天津市工业微生物重点实验室，天津300222）
摘要：浸泡对玉米SOD和醇溶蛋白提取有很大影响。实验确定浸泡液采用pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液。将100g玉米中加入200mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，在40℃下浸泡玉米籽粒36 h 后淋干，进行胚芽与胚乳分离、破碎。然后从胚芽中提取SOD，SOD酶活最高达到37155U/100g玉米，是未浸泡玉米胚芽的15.8倍；将破碎的胚乳与6倍量的75%（v）酒精混合，60℃下浸提2h，获得醇溶蛋白。一次浸提其醇溶蛋白的提取率为78.94%，比对照提高了20.91%，浸提二次其提取率达为93.3%。最后，将提取SOD和醇溶蛋白的玉米残渣进行酒精发酵，同时与采用干法粉碎和湿法粉碎的玉米粉进行对比，其淀粉出酒率分别为53.50%、53.56%和53.51%。
关键词：玉米浸泡提取SOD 醇溶蛋白酒精发酵
Effect of steeping on extraction of SOD and zein from corn
Zhao Hua Zhang Yinghua
(College of Bioengineering, Tianjin University of Science & Technology; The key lab of industrial
microbiology in Tianjin, Tianjin 300222)
Abstract There was a large influence of steeping on extraction of SOD and zein from corn. The pH 7.8 phosphate buffer was deemed to the best buffer through experiments. Corn of 100g was steeped with 200mL 0.05mol/L phosphate buffer at 40℃for 36h. Embryo and endosperm were separated after steeping. SOD was extracted from embryo smashed, and total SOD activities were 37155U/100g corn，which was 15.8-fold more than one from embryo of corn not steeped. Then, zein was extracted from endosperm smashed using 75% ethanol solvent with the solvent-to-corn ratio of 6:1 at 60℃for 2h. The yield of zein was 78.94%, which enhanced by 20.91% compared to control. When extracted twice, the yield of zein arrived to 93.30%. Furthermore, the ethanol fermentation with corn、corn steeped and corn residues after extracting SOD and zein was carried out, which the conversion ratio of starch to 95%(v) ethanol reached 53.56%，53.50% and 53.51%, respectively.
Key words corn steeping extraction SOD zein ethanol fermentation
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收稿日期：
作者简介：赵华（1963—），男，天津市人，教授，硕士生导师。主要研究方向为现代酿造技术和生物分离工程。天津科技大学生物工程学院，300222。Tel：022-********；Email：hzhaotj@https://www.360docs.net/doc/d56116417.html,。
随着石油资源的紧缺，燃料酒精的开发越来越受到人们的重视[1]。燃料酒精主要以谷物、薯类、糖蜜及木质纤维素为主要原料，经微生物发酵制得[2]。在中国，生产燃料酒精
的主要原料是玉米，到2004年燃料酒精生产能力已达到200万吨左右[3]。燃料酒精生产成本大部分来源于原料玉米，约占总成本的70%以上[4]。因此，为了降低燃料酒精生产成本，在提高酒精发酵效率的同时，必须对玉米原料进行充分的综合利用。近年来，开发具有高附加值的副产品并对玉米生物量进行综合利用，被认为是降低燃料酒精生产成本的有效途径[5]。目前，以传统酒精发酵工艺为基础，已成功开发出玉米油[6]、玉米醇溶蛋白[7]、SOD[8]、谷蛋白[9]等高附加值产品。
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）是广泛存在于动物、植物和微生物中的一种酸性蛋白酶，能催化细胞内超氧化物阴离子（O2.-）的歧化反应，使O2.-转化为H2O2和O2[10]，在医药、保健品、化妆品和食品等许多领域有广泛的应用[11]。SOD主要存在于玉米胚芽中，胚芽中含有90%以上的SOD[12]。醇溶蛋白主要存在于玉米胚乳中，可溶于60%～95 %的乙醇水溶液中，具有良好的耐水、阻氧和易成膜性[13]，被广泛用于食品、造纸、印刷、纺织以及医药卫生等方面，尤其是作为果蔬食品的保鲜膜、可食性包装、生物可降解塑料和黏合剂[14]。将磷酸盐缓冲液浸泡过的玉米进行胚芽和胚乳分离，胚芽提取SOD，胚乳提取玉米醇溶蛋白，再将提取后的残渣用于酒精发酵，能有效提高玉米综合利用率，为降低玉米燃料酒精生产成本提供了一条有效途径。本文对玉米SOD和醇溶蛋白提取有较大影响的浸泡条件进行了研究，并考察了浸泡对玉米原料酒精发酵的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1玉米：购于天津市场。
1.1.2 pH 7.8磷酸缓冲溶液
磷酸二氢钠，磷酸氢二钠分别配成0.05mol/L使用时按1:10.8比例混合均匀。
1.2 玉米醇溶蛋白提取方法
用pH 7.8的磷酸缓冲液在40℃浸泡玉米籽粒36h，淋干后分离胚芽与胚乳。用粉碎机将胚乳粉碎，称取50g~100g的胚乳粉，按液料比6:1的比例加入已经预热到60℃的体积分数为75%的乙醇溶液，在60℃的水浴摇床中振荡浸提2h，待醇溶蛋白充分溶解后，离心取上清液，即得玉米醇溶蛋白提取液。
1.3 玉米胚乳中醇溶蛋白含量的测定[15]
玉米中醇溶蛋白的含量约占胚乳中总蛋白量的47%[16]。
1.4 玉米SOD粗酶制剂制备
称取100 g玉米，用pH 7.8的磷酸缓冲液浸泡，淋干后分离胚芽与胚乳，胚芽中加入相同的缓冲液破碎，浸提、离心得上清液，即为SOD提取液；然后在SOD提取液中加入硫酸铵至40%饱和浓度，离心除去杂蛋白，再添加硫酸铵至90%饱和浓度进行盐析，离心后将沉淀冷冻干燥，即得到SOD粗酶制剂。
1.5 玉米酒精发酵试验
准确称取50.00g 玉米粉，置于500mL 三角瓶中，按照1:4加入70℃自来水200mL ，然后加入0.1mL 液化酶，沸水浴30min ，0.1MPa 下蒸煮1h 后冷却到60℃～62℃，按150μ/g 原料加入糖化酶，60℃水浴糖化1h 。糖化醪冷却到30℃，加入5mL 干酵母活化液和2mL 活化蛋白酶上清液，加发酵栓，置30℃培养箱中培养12h 后再转至35℃培养箱中发酵72h 。
1.6 分析方法
1.6.1 玉米醇溶蛋白总量的测定
凯氏定氮法[17]。
1.6.2 玉米醇溶蛋白的提取率
醇溶蛋白提取率= mg)
(玉米胚乳中醇溶蛋白量mL)(mg/mL)(提取液体积提取液中醇溶蛋白浓度
? 1.6.3 玉米淀粉含量测定
斐林试剂滴定法[18]。
1.6.4 SOD 酶活性的测定
改良的邻苯三酚自氧化法[19]。以SOD 标准样作酶活标准曲线，测定OD 325nm 的值，得到样品SOD 活力(u/mL)。SOD 比活力(u/mg)=SOD 活力(u/mL)÷蛋白质含量（mg/mL ）。
1.6.5 原料出酒率的测定
95％（V ）酒精原料出酒率（％）＝P D ??9581144.0×W
100×100% 式中 D —试样在20℃时的酒精度，％（V ）；
0.81144— 95％（V ）酒精（20℃）的比重；
W —原料重量，g 。
P —淀粉含量，%。
2 结果与讨论
2.1 缓冲液对浸泡液pH 值的影响
浸泡对玉米胚芽提取SOD 和胚乳提取醇溶蛋白有很大影响。玉米SOD 在pH 值为7.0-7.8中性偏碱的溶液中较稳定，为了充分将SOD 从玉米中抽提出来，同时又保持SOD 的活性，必须保持浸泡液pH 值的相对稳定。常用的缓冲盐溶液有磷酸盐溶液、硼酸盐溶液、柠檬酸盐溶液等，考虑到磷是酵母生长的有利因子，因此选用pH 值7.8的磷酸盐缓冲溶液作为浸泡液。实验考察了缓冲液浓度、缓冲液添加量和温度对浸泡液pH 值的影响。
2.1.1 磷酸盐缓冲液浓度对浸泡液pH 的影响
将100g 玉米分别浸泡在200mL 0.05mol/L 、0.1mol/L 、0.15mol/L 和0.2mol/L 的磷酸盐缓冲液中，在40℃下浸泡一定时间后用pH 计测定提取液pH 值，结果见图1。
图1磷酸盐缓冲液浓度对pH值的影响
Fig.1 Effect of the concentrate of phosphate buffer solution on pH 由图1知, 随着浸泡时间的延长，浸泡液的pH值呈下降趋势。开始时，pH值下降速度缓慢，浸泡36 h后，pH值下降速度较快。浸泡36 h，pH值为由7.8降至7.0，延长至60h 时，pH值降至6.0。浸泡液呈酸性，不利于SOD的抽提。采用不同浓度的磷酸盐缓冲液浸泡液时，pH变化趋势基本一致。而高浓度磷酸盐缓冲液对玉米SOD的诱导有一定的抑制作用[20]，因此，确定磷酸盐缓冲液的最佳浓度为0.05mol/L。
2.1.2缓冲液添加量对浸泡液pH的影响
将100g玉米分别浸泡在不同体积的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中，在40℃下浸泡一定时间后用pH计测定浸泡液pH值，结果见图2。
图2 磷酸盐缓冲液添加量条件对pH值的影响
Fig.2 Effect of the addition of phosphate buffer solution on pH
由图2知, 随着浸泡时间的延长，浸泡液的pH值呈下降趋势，在36 h时，pH值由7.8降至7.0。浸泡36 h后，pH值下降速度较快，浸泡液成酸性。添加不同液料比的缓冲液进行浸泡时，pH变化趋势基本一致。缓冲液添加量小时，玉米浸泡不充分，不利于诱导SOD 的生成，SOD酶活较低；缓冲液添加量大时，玉米中淀粉渗透到浸泡液中的量增大，因此缓冲液的添加量不宜过大，确定最佳液料比为2：1。
2.1.3温度对浸泡液pH的影响
将100g玉米浸泡200mL 0.05mol/L pH值7.8的磷酸盐缓冲溶液中，分别在20℃、30℃、40℃、50℃下浸泡一定时间后用pH计测定浸泡液pH值，结果见图3。
图3 温度对浸泡液pH值的影响
Fig.3 Effect of temperature on pH
由图3知，随着浸泡时间的延长和浸泡温度的增加，浸泡液的pH值逐渐降低。浸泡开始时，pH值下降缓慢，36h前，pH值由7.8降至7.0，延长至60h时，pH值降至6.0。在不同的温度下浸泡，其pH值变化的趋势基本一致，随着温度的升高，pH值不断下降。为了使浸泡液保持在中偏碱性，浸泡时间不宜超过36h，浸泡温度不宜过高。
2.2 浸泡对玉米SOD提取的影响
将100g玉米浸泡200mL 0.05mol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液中，分别在20℃、30℃、40℃、50℃下浸泡一定时间后，进行胚芽和胚乳分离。用胚芽提取SOD，其酶活见图4。
图4 浸泡对玉米SOD提取的影响
Fig.4 Effect of steeping on extraction of SOD from corn
由图4知，随着浸泡时间的延长和浸泡温度的增加，SOD酶活逐渐增加，在40℃下浸泡36h酶活达到最大，为37155U/100g玉米。但浸泡时间超过36h, 则酶活快速下降。通过
测定不同时间浸泡液的pH值可知，随着时间延长，浸泡液中酸的含量逐渐增加，浸泡液的pH值也逐渐下降，不利于诱导SOD的浸提，SOD酶活较低，故玉米浸泡时间不宜超过36h。若浸泡温度超过40℃，提取SOD酶活也较低。其原因可能是高温不利于酶的诱导。另外，温度超过40℃后，浸泡液pH值下降较快，使SOD稳定性降低，造成酶活下降。综合上述，用于提取SOD时，玉米的最佳浸泡时间为36h，浸泡温度为40℃。
2.3 浸泡对玉米醇溶蛋白提取的影响
2.3.1 浸泡对玉米原料中蛋白质含量的影响
将100g玉米浸泡在200mL 0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，分别在20℃、30℃、40℃、50℃下浸泡一段时间后测定蛋白质含量，结果见图5。
图5 浸泡对玉米中蛋白质含量的影响
Fig.5 Effect of steeping on content of corn protein
由图5知，随着浸泡时间的延长，玉米中蛋白质含量逐渐减少。不浸泡时，蛋白质含量为8.80%，浸泡36h时，含量为8.64%，36h后，损失速度加快。随着温度的升高，蛋白质含量也会不断降低。因此，玉米的浸泡时间不宜过长，浸泡温度也不宜过高。
2.3.2 浸泡对玉米醇溶蛋白提取率的影响
将100g玉米浸泡200mL 0.05mol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液中，分别在20℃、30℃、40℃、50℃下浸泡一定时间后测定醇溶蛋白提取率，结果见图6。
图6 浸泡对玉米醇溶蛋白提取的影响
Fig.6 Effect of steeping on extraction of zein from corn
由图6知，不浸泡时，醇溶蛋白的提取率为62.43%，浸泡后提取率明显上升。40℃下浸泡36h时，提取率为78.94%。浸泡36h后，醇溶蛋白的提取率提高不明显，因此确定浸泡时间为36h。另外，随着浸泡温度的提高，提取率也增加，但浸泡温度过高，易造成醇溶蛋白变性，而且给操作带来诸多不便，因此确定浸泡温度为40℃。
2.3.3浸提次数对玉米醇溶蛋白提取的影响
将浸泡过的胚乳、未浸泡过的胚乳各100g，按照液料比6:1的比例加入已经预热到60℃体积分数为75%的乙醇溶液，在60℃的水浴摇床中以125 rpm的转速浸提2h，分别考察不同提取次数对玉米醇溶蛋白提取率的影响，结果见图7。
图7 提取次数对玉米醇溶蛋白提取率的影响
Fig.7 Effect of numbers on extraction of zein from corn
由图7知，随着提取次数的增加，醇溶蛋白的提取率也增加。浸泡过的胚乳第一次提取率为78.94%，而提取两次后其提取率达到93.35%。未浸泡的胚乳第一次提取率只有62.43%，两次提取的提取率为84.75%。由此可知，浸泡有利于玉米醇溶蛋白的溶出，提高玉米醇溶蛋白的提取率。
2.4 SOD、玉米醇溶蛋白提取对酒精发酵的影响
分别采用干玉米、提取后残渣及浸泡玉米进行酒精发酵，其淀粉出酒率和原料出酒率见图8。
图8 浸泡对酒精发酵的影响
Fig.8 Effect of steeping on ethanol fermentation
由图8可看出，采用干玉米、提取后残渣及浸泡玉米进行酒精发酵，淀粉出酒率分别为53.56％、53.51%、53.50%，三者相差不大。说明用浸泡过的玉米胚乳提醇溶蛋白和胚芽提取SOD后，残渣进行酒精发酵不会影响其淀粉出酒率。但干玉米、提取后残渣及浸泡玉米的原料出酒率分别为35.53%、33.82%、35.19%。玉米经浸泡提取SOD和醇溶蛋白后，其原料出酒率有一定的下降，可能是在浸泡和SOD与醇溶蛋白提取过程中会造成部分淀粉损失所致。
3 结论
3.1 浸泡对玉米SOD和醇溶蛋白提取有很大影响，其浸泡的最佳工艺条件为：添加玉米质量2倍的0.05mol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液，在40℃下浸泡36h。
3.2 在最佳浸泡条件下，从胚芽中提取SOD的酶活为37155U/100g玉米，是对照的15.8倍；从破碎胚乳中提取玉米醇溶蛋白时，一次浸提其醇溶蛋白的提取率为78.94%，比对照提高了20.91%，浸提二次其提取率达为93.3%。
3.3 用提取SOD和醇溶蛋白后的玉米残渣进行酒精发酵，不会影响其淀粉出酒率，但原料出酒率略有下降。
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