蛋白质重点
名词解释
1.同源模建：又称比较性模拟，将同源蛋白质家族中已知结构的蛋白质作为模板来模拟目标蛋白质
的结构。
2.折叠识别：又称穿针引线（threading），在无法进行同源序列比对的情况下，将目标蛋白质序列
“穿”入蛋白质数据库中已知的各种蛋白质折叠模板的骨架内，由计算机来识别目标蛋白质序列与数据库中的蛋白质折叠模板是否“匹配”。
3.从头计算：不需要模板，以自由能作为基础预测蛋白质的折叠类型。能量函数设计和最低自由能
的确定是决定从头计算方法预测准确度高低的关键。
4.结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间
上可以明显区分的三级折叠实体。结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。
5.定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤——突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长
的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。
6.第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或
折叠密码。
7.蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质
与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。
8.细菌表面展示技术：结合荧光激活细胞筛选仪或流式细胞筛选仪是非常有效的高通量筛选方法。
9.自杀性抑制剂：是底物类似物，能与酶结合发生类似底物的变化，有一个潜伏反应基团，被催化
时这个基团活化，并作用于酶的活性部位使酶失活
10.生物信息学（Bioinformatics）:是生物学、计算机科学和信息学相互渗透形成的交叉学科，在
蛋白质工程中具有广泛应用。
11.指纹图谱技术：研究蛋白质相互作用的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术；用于功能蛋白
质筛选的表面展示技术。
12.肽单位：肽键具有部分双键性质，其连接的酰胺基(-CO-NH-)处于同一平面，称为肽单位。
13.分子伴侣：是进化上十分保守的蛋白质家族，广泛存在于多种生物体内，其主要作用是与新生肽
或部分折叠的蛋白质的疏水表面结合，加速其折叠或组装成天然构象的进程，并防止其相互聚集和错误折叠。
14.定位突变：基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”，是指对已知结构的蛋白质进行少数几个
残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类
15.蛋白质分子拼接:蛋白质由结构元件组装而成，可以将不同蛋白质的特定结构元件剪裁拼接起来，
从而将不同蛋白的功能结合在一起创造出新的蛋白。
16.蛋白质空间结构：又称为蛋白质的构象,指蛋白质分子中所有原子在三维空间排列分布和肽链的
走向。
17.超二级结构：是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能
辨认的二级结构组合单位。
18.四级结构：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成特定构象的蛋白质分子叫蛋白质
的四级结构。
19.变构效应：蛋白质在表达功能的过程中构象发生变化的现象。
20.蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除使蛋白质化学(一级)结构的发生改变的过程。
21.蛋白质的复性：除去变性因素后，变性蛋白质恢复到天然构象，称为蛋白质的复性。
22.单链抗体（scFv）：抗体可变区的重链（VH）与轻链（VL）通过一段约15-25个氨基酸残基构成
的弹性短肽（Linker）相连，融合表达出来的抗体片断。
23.蛋白质工程(Protein Engineering)：是以蛋白质的结构规律与生物功能的关系为基础，利用基
因工程技术对现存蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终获得新型蛋白质的现代生物技术。
二、单选题
1.下列不属于蛋白质结构测定的技术是（ D ）
A X射线晶体衍射技术
B 核磁共振波谱技术
C 生物信息学预测蛋白质结构
D 缺失突变技术
2. 下列不属于蛋白质结晶技术的是（ D ）
A 悬滴法
B 坐滴法
C 微量扩散小室法
D 插入突变法
3. 增加蛋白质分子的热稳定性的常用方法是（ B ）
A 提高脯氨酸的含量
B 在蛋白质分子中引入二硫键
C 增加蛋白质分子的α螺旋
D 增加β折叠
4. 蛋白质工程的最终目的是( C )
A 开发新产品
B 创造新理论
C 制造具有新性能的新蛋白质结构
D 研究蛋白质的氨基酸组成
6、不属于蛋白质空间结构的基本组件的是（ C ）
A α螺旋
B β层
C 环肽链
D 结构域
7、不属于强烈倾向于形成α螺旋的氨基酸（ C ）
A Ala
B Glu
C Pro
D Met
8、蛋白质分子的完全从头设计属于（ C ）
A 小改
B 中改
C 大改
D 没改
9. 蛋白质工程的基本原理是（ C ）
A 中心法则
B 热力学第二定律
C 中心法则的逆推
D 模型对比
三、填空题
1、蛋白工程之父：ULmer
2、蛋白质工程原理：基因指导蛋白质的合成,设计和改造基因获取新蛋白质。
3、蛋白质工程设计原理基因水平，蛋白质水平
4、中心法则：Crick提出
5、第二遗传密码特性:（ 1）简并性（2）多义性（3）全局性和复杂性
11、蛋白质分子设计原理：计算机模拟，基因构建，获得突变蛋白产品，功能分析
12、蛋白质的几种修饰方法 :侧链的化学修饰、位点专一性修饰、聚乙二醇修饰
1. 维持蛋白质一级结构的作用力是（肽键）和（二硫键）。
2.目的蛋白的表达模式检测的方法有（ DNA探针检测）和（ mRNA做探针）4．常用的蛋白表达系统有（酵母表达系统）、（昆虫表达系统）和（哺乳动物表达系统）。
5、二级结构折叠：α—螺旋、β—折叠、β—转角、环肽链、无规卷曲等。
9、一级结构：肽键、二硫键（都属于共价键）
10、二级结构：氢键（主链上—C=O—和N—H之间形成）
11、三四级结构：二硫键、次级键（氢键、疏水键、离子键、范德华力、配位键）
13、变性蛋白的特征：（1）、生物活性的丧失——最主要标志
（2）、理化性质的改变：
溶解度下降，易沉淀
结晶能力丧失
渗透压力和扩散速度降低
粘度、旋光性负值上升，等电点上升
（3）、生化性质的改变
14、变性因素：
a)物理：热、紫外线照射、高压和表面张力
b)化学：有机溶剂、脲、胍、酸、碱、（脲，盐酸胍，十二烷基硫酸钠（SDS）
c)重金属阳离子、生物碱等
15、蛋白质分子设计的原则：活性设计、对专一性的设计、Scaffold设计(框架)、疏水基团与亲水基团需合理分布、最优的氨基酸侧链几何排列。
16、蛋白质功能设计包括：
a)通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能
b)结合及催化的从头设计
c)在全新蛋白质中引入结合位点
d)催化活性蛋白质的设计
e)膜蛋白及离子通道的设计、新材料的设计
17、蛋白质工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。
18、蛋白质三维结构解析方法：X-射线晶体衍射法：85.3%；核磁共振波谱：14.7%；电镜三维重构、各种光谱技术、显微技术和计算机模拟。
19、1895 伦琴“X射线”。
20、其他测定蛋白质结构的方法：现代光谱技术、三维电镜衍射技术、动力学全精研究技术
21、质谱分析(MS)的特点：高灵敏度、易操作性、准确性、快速性、很好的普适性
22、目前，国际上主要有Genbank、EMBL、DDBJ三大核酸序列数据库
23、PDB(Protein Data Bank）蛋白质结构数据库是国际上最完整的蛋白质、核酸、糖类、蛋白质-核酸复合物及病毒等生物大分子三维结构数据库。
24、DSSP (Database of Secondary Structure of Protein）是一个二级结构推导数据库，用于研究蛋白质序列与蛋白质结构的关系。
25、现代生物学技术：
a)传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹技术、酶
联免疫吸附测定（ELISA）
b)新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术
c)研究蛋白质相互作用的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术
26、根据用途的不同蛋白质芯片可分：蛋白功能芯片、蛋白检测芯片
27、蛋白质粗分级主要方法：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶
28、蛋白质细分级方法：分子筛层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、电泳、其他技术
29、蛋白质含量测定有很多方法：凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚法、考马斯亮蓝比色法、紫外吸收法
天然蛋白质分为三类：纤维状蛋白质、球状蛋白质、膜蛋白.
氨基修饰常用试剂：三硝基苯磺酸，烷基化试剂，磷酸吡哆醛等。
羧基修饰常用试剂：碳二亚胺法
制造突变体的方法：易错PCR DNA改组
NMR法一般只能解析相对较小的蛋白质，X-射线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。
生物信息学在蛋白质的序列分析、结构预测、功能预测、分子设计等方面具有重要应用
蛋白质的鉴定：纯度鉴定、分子量及等电点测定、氨基酸组成及顺序分析、结晶与结构分析、免疫印迹（Western-blotting）鉴定、生物活性及功能测定
提高热稳定性-----引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积
对氧化的稳定性------把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr
对重金属的稳定性--------替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu
pH稳定性-------替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换，内离子对的置换
提高酶学性质-------专一性的改变，增加转换数，改变酸碱度
Pro和Gly是α螺旋的中断者。Glu是β折叠片的中断者
简答题
1.简述鼠源性单抗的改造原则及常见类型
a)改造原则：降低其免疫原性、尽量保持其亲合力
b)常见类型：人鼠嵌合抗体、CDR移植抗体、小分子抗体
2.噬菌体抗体库技术的主要流程及优点
a)噬菌体抗体库技术：借助噬菌体展示技术，将抗体V基因与噬菌体外壳蛋白基因融合表达于
噬菌体表面，从而构建噬菌体抗体库，然后通过筛选获得特异性抗体的V区基因。
b)主要流程：
i.扩增全套抗体基因
ii.构建合适的重组噬菌体表达载体
iii.转化大肠杆菌并保存
c)优点：
i.省时省力
ii.筛选容量大
iii.直接得到抗体基因
iv.可制备人源抗体和其它难于制备的抗体
v.可原核表达
d)缺点：
i.库容受转化效率限制：一般不超过1010
ii.一些抗体分子会抑制宿主菌生长
iii.具极高亲和力的抗体与抗原结合后，难以洗脱，造成丢失
①. 受人类病原体污染的危险性最小
3.人一鼠嵌合抗体的制备
a)改造依据
i.抗体的免疫原性主要C区
b)主要流程
i.免疫动物
ii.制备杂交瘤
iii.克隆鼠源单抗的可变区基因
iv.克隆人抗体恒定区基因
v.构建包含鼠V区和人C区的重组表达载体
vi.哺乳动物细胞表达(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)
c)特点
i.可减少90%以上免疫原性
ii.具有完备的免疫功能
iii.不易被清除
d)不足
i.仍有一定免疫原性
4.简述基因工程抗体的各表达系统的优缺点
a)哺乳动物细胞表达系统：
i.优点：
①. 具有完整的转录、翻译后加工及分泌机制，抗体能被准确子合成、加工和分泌
②. 具有完全糖基化功能和完善的重折叠机制，可表达形成良好活性的抗体分子
③. 可实现抗体的分泌表达
④. 既可表达完整的抗体分子，也适合表达其它形式的小分子基因工程抗体
ii.缺点：
①. 构建周期长，操作繁琐
②. 表达量相对低，成本较高
③. 大规模生产受限
④. 具潜在致癌性和病毒核酸的污染可能
iii.常用的宿主细胞
①. 淋巴细胞：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO
②. 非淋巴细胞：常有的细胞有CHO、COS
b)大肠杆菌表达系统：
i.优点：
①. 遗传背景清楚
②. 产量高：130—150mg／L
③. 生长速度快
④. 操作简单
⑤. 成本低
⑥. 可大规模生产
ii.不足
①. 不具有糖基化功能，不适合表达完整抗体分子
②. 抗体产物多为无活性的包涵体形式
③. 存在的致热原污染可能
c)酵母表达系统：
i.优点
①. 遗传背景清楚，易操作，生产成本低，产量高1.2g/L
②. 具备较好的加工修饰功能，可得到较高活性的抗体分子
③. 消除了大肠杆菌中的致热原和哺乳动物细胞中潜在致癌性和病毒核酸的污染
ii.缺点：
①. 存在过度糖基化（50/20）影响抗体活性
②. 具备较好的加工修饰功能，可得到较高活性的抗体分子
③. 消除了大肠杆菌中的致热原和哺乳动物细胞中潜在致癌性和病毒核酸的污染
d)昆虫表达系统：常用的体系有两种：一种是以重组杆状病毒为载体；另一种是稳定转化昆虫
表达体系。
i.特点：具有必要的翻译后修饰、加工及分泌能力可表达各种形式基因工程抗体表达量高
e)转基因动物表达系统：
i.特点 1.可产生完全人源抗体
②. 表达抗体具高亲和性
③. 抗体具多样性
④. 可通过杂交瘤等制备功能性抗体
b)植物表达系统：
i.优势
①. 生产成本低
②. 可大规模种植已
③. 种子形式保存种系
5.CDR移植抗体的制备
a)改造依据
i.CDR直接形成抗原表位结合结构
b)改造分类
i.移植抗体
ii.表面残基人源化—镶面抗体
c)移植抗体
i.改造原则
1.选择FR，最大可能维持抗体的天然构象
2.将FR中可能影响抗原结合部的AA替换为亲本AA
3.合适保留CDR两侧骨架序列
4.可将抗体N末端数个AA（L）一起移植
5.须在降低免疫原性和保持亲和力权衡
ii.改造方法：
1.置换法：以人Ig为骨架，以鼠抗体CDR置换人抗体的CDR
2.定点突变法：用定点突变的方法将人V区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列
iii.制备过程：
1.制备杂交瘤
2.克隆V区基因
3.设计移植抗体V区基因序列（mCDR+hFR）
4.构建V区基因
5.与人C区基因相连
6.构建H和L链表达载体
7.哺乳动物细胞表达
6.常用的几种抗体表达系统的优缺点
a)淋巴细胞表达系统：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO
i.特点
1.本身不产生和分泌任何Ig
2.具备抗体表达的原生条件和环境
3.可产生完全活性的抗体分子
4.适合表达各种重组抗体
5.产量偏低：5μg/ml
6.稳定性不高
b)非淋巴细胞表达系统：常有的细胞有CHO、COS
i.CHO：目前最主要的基因工程抗体生产细胞，常用的属CHO工程株
1.特点：
a)遗传背景清楚
b)转染效率高
c)适用于多种载体
d)可表达各种类型的抗体
e)可长期稳定表达有功能活性抗体
f)可无血清培养和高密度发酵
g)产量可达200μg/ml
ii.COS：由SV40病毒的大T抗原转染猴肾细胞获得，可长期传代
1.特点：
a)转染的抗体DNA以游离形式存在并复制
b)外源基因表达迅速，瞬时表达仅需3-6d
c)适用于研究抗体基因的表达效果以及快速制备少量抗体检测其活性及特征
c)重组杆状病毒为载体的表达系统：常用载体为多核多角体病毒MNPV。
蛋白质组学研究方法选择及比较
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
果实蛋白质组学研究的实验方法
植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.360docs.net/doc/d36629406.html, 收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n .技术方法. 果实蛋白质组学研究的实验方法 王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1* 1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039 摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。 关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116. 果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的手段。 蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
蛋白质序列分析
蛋白质序列、性质、功能和结构分析 基于网络的蛋白质序列检索与核酸类似，从NCBI或利用SRS系统从EMBL 检索。 1、疏水性分析 ExPASy的ProtScale程序（https://www.360docs.net/doc/d36629406.html,/cgi-bin/protscale.pl）可用来计算蛋白质的疏水性图谱。输入的数据可为蛋白质序列或SWISS-PROT数据库的序列接受号。也可用BioEdit、DNAMAN等软件进行分析。 2、跨膜区分析 蛋白质跨膜区域分析的网络资源有： TMPRED：https://www.360docs.net/doc/d36629406.html,/software/TMPRED_form.html PHDhtm: http:www.embl-heidelberg.de/Services/sander/predictprotein/predictpro tein.html MEMSAT: ftp://https://www.360docs.net/doc/d36629406.html, 3、前导肽和蛋白质定位 一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。这就是信号肽假说的基础。这一假说认为，穿膜蛋白质是由mRNA编码的。在起始密码子后，有一段疏水性氨基酸序列的RNA片段，这个氨基酸序列就称为信号序列（signal sequence）。 蛋白质序列的信号肽分析可联网到http://genome.cbs.dtu.dk /services/SignalP/或其二版网址 http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/。该服务器也提供利用 e-mail进行批量蛋白质序列信号肽分析的方案 （http://genome.cbs.dtu.dk/services /SignalP/mailserver.html），e-mail 地址为signalp@ genome.cbs.dtu.dk。 蛋白质序列中含有的信号肽序列将有助于它们向细胞内特定区域的移动，如前导肽和面向特定细胞器的靶向肽。在线粒体蛋白质的跨膜运输过程中，通过线粒体膜的蛋白质在转运之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽或引肽（leader peptide）共同组成。迄今有40多种线粒体蛋白质前导肽的一级结构被阐明，它们约含有20~80个氨基酸残基，当前体蛋白跨膜时，前导肽被一种或两种多肽酶所水解转变成成熟蛋白质，同时失去继续跨膜能力。前导肽一般具有如下性质：①带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列中间；②缺失带负电荷的酸性
蛋白质结构解析的方法对比综述 (1)
蛋白质结构解析的方法对比综述 工程硕士李瑾 摘要：到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法，这两种方法各有优点和不足。 关键词：x射线衍射法 NMR法 到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和不足[1]。 首先是X射线晶体衍射法。该方法的前提是要得到蛋白质的晶体。通常是将表达目的蛋白的基因经PCR扩增后克隆到一种表达载体中，然后转入大肠杆菌中诱导表达，目的蛋白提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，得到蛋白质的原子结构[2]。 x射线晶体衍射法的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，最快当天就能得出结构，另外不受肽链大小限制，无论是多大分子量的蛋白质或者RNA、DNA，甚至是结合多种小分子的复合体，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的关键是摸索蛋白结晶的条件。该方法得到的是蛋白质分子在晶体状态下的空间结构，这种结构与蛋白质分子在生物细胞内的本来结构有较大的差别。晶体中的蛋白质分子相互间是有规律地、紧密地排列在一起的，运动性较差；而自然界的生物细胞中的蛋白质分子则是处于一种溶液状态，周围是水分子和其他的生物分子，具有很好的运动性。而且，有些蛋白质只能稳定地存在于溶液状态，无法结晶[2]。 核磁共振NMR（nuclear magnetic resonance）现象很早就被科研人员观察到了，但将这种方法用来解析蛋白质结构，却是近一二十年的事情。NMR法具体原理是对水溶液中的蛋白质样品测定一系列不同的二维核磁共振图谱，然后根据已确定的蛋白质分子的一级结构，通过对各种二维核磁共振图谱的比较和解析，在图谱上找到各个序列号氨基酸上的各种氢原子所对应的峰。有了这些被指认的峰，就可以根据这些峰在核磁共振谱图上所呈现的相互之间的关系得到它们所对应的氢原子之间的距离。[3]可以想象，正是因为蛋白质分子具有空间结构，在序列上相差甚远的两个氨基酸有可能在空间距离上是很近的，它们所含的氢原子所对应的NMR峰之间就会有相关信号出现[4] 。通常，如果两个氢原子之间距离小于0.5纳米的话，它们之间就会有相关信号出现。一个由几十个氨基酸残基组成的蛋白质分子可以得到几百个甚至几千个这样与距离有关的信号，按照信号的强弱把它们转换成对应的氢原子之间的距离，然后运用计算机程序根据所得到的距离条件模拟出该蛋白质分子的空间结构。该结构既要满足从核磁共振图谱上得到的所有距离条件，还要满足化学上有关原子与原子结合的一些基本限制条件，如原子间的化学键长、键角和原子半径等[4]。 NMR解析蛋白结构常规步骤如下：首先通过基因工程的方法，得到提纯的目的蛋白，在蛋白质稳定的条件下，将未聚合，而且折叠良好的蛋白样品（通常是1mM－3mM，500ul，PH6－7的PBS）装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后由写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、13N、13C原子，等电磁波发射完毕，再收集受激发的原子所放出的“能量”，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构[5] [6]。 用NMR研究蛋白质结构的方法，可以在溶液状态进行研究，得到的是蛋白质分子在溶液中的结构，这更接近于蛋白质在生物细胞中的自然状态[7]。此外，通过改变溶液的性质，还可以模拟出生物细胞内的各种生理条件，即蛋白质分子所处的各种环境，以观察这些周围环境的变化对蛋白质分子空间结构的影响。在溶液环境中，蛋白质分子具有与自然环境中类
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目录 关于Advansta 关于Advansta 样品制备 Afyon 电泳与染色 AdvanStain Scarlet Visio 蛋白质转印 FLASHBlot Transfer Buffer AdvanStain Ponceau 检测 WesternBright ECL & Spray WesternBright Quantum WesternBright Sirius WesternBright MCF & MCF-IR ELISABright 其它 WesternBright ChemiPen Afyon TM Afyon SDS-PAGE样品制备试剂盒能够快速高效地浓缩蛋白质样品，去除缓冲液中可能干扰电泳的成分。只需不到10 min，样品即可用于SDS-PAGE或免疫印迹。Afyon的操作手册非常简单，可以作为最常用的蛋白质 电泳样品制备的工具。? 快速去除干扰电泳的缓冲液成分 (GuHCl, urea, Ammonium sulfate, etc)? 不到10 min，蛋白质样品即可上样? 安全，无毒性，无需DMSO ? 比超滤或透析等方法更加快捷 ? 兼容下游的SDS-PAGE和Western Blot 特点 Afyon 与Western Blotting能够很好地兼容。上图所示为两组Western Blotting实验，样本为A431细胞的抽提物。图a检测GAPDH，图b检测SRC，泳道2为A431细胞的抽提物，泳道3为稀释的细胞抽提物，泳道4为将稀释抽提物用Afyon浓缩后的样品。Western Blot采用荧光标记的二抗进行检测。可见，a和b中的泳道3均无信号，泳道2和4均可以检测 到靶蛋白的信号，信号强度用数字标出。 美国Advansta公司成立于2005年，总部位于加利福尼亚州，是专业的生命科学试剂制造商，致力于研发高效易用的蛋白质分析试剂。 Advansta的公司使命是：成为全球领先的蛋白质分析试剂的研发者与制造商。 其研发团队具有相当扎实的化学分析与蛋白质分析的应用背景，公司的旗舰产品之一为Western Blotting实验配套的相关试剂，其中 WesternBright化学发光底物产品线仅2014年一年就有超过200篇的文献引用量，并获得越来越多的全球使用者的青睐，被评为市场上最灵敏的化学发光底物。 订购信息高效样本制备试剂盒 货号描述 规格R-03018-B10Non-reducing protein sample loading buffer (2X) 1 mL K-02101-010Afyon SDS-PAGE Sample Preparation Kit 10 rxns K-02101-025 Afyon SDS-PAGE Sample Preparation kit 25 rxns 12233455677899101010 样品制 备
蛋白质结构分析原理及工具-文献综述
蛋白质结构分析原理及工具 （南京农业大学生命科学学院生命基地111班） 摘要：本文主要从相似性检测、一级结构、二级结构、三维结构、跨膜域等方面从原理到方法再到工具，系统地介绍了蛋白质结构分析的常用方法。文章侧重于工具的列举，并没有对原理和方法做详细的介绍。文章还列举了蛋白质分析中常用的数据库。 关键词：蛋白质；结构预测；跨膜域；保守结构域 1 蛋白质相似性检测 蛋白质数据库。由一个物种分化而来的不同序列倾向于有相似的结构和功能。物种分化后形成的同源序列称直系同源，它们通常具有相似的功能；由基因复制而来的序列称为旁系同源，它们通常有不同的功能[1]。因此，推测全新蛋白质功能的第一步是将它的序列与进化上相关的已知结构和功能的蛋白质序列比较。表一列出了常用的蛋白质序列数据库和它们的特点。 表一常用蛋白质数据库 网址可能有更新 氨基酸替代模型。进化过程中，一种氨基酸残基会有向另一种氨基酸残基变化的倾向。氨基酸替代模型可用来估计氨基酸替换的速率。目前常用的替代模型有Point Accepted Mutation (PAM)矩阵、BLOck SUbstitution Matrix (BLOSUM)矩阵[2]、JTT模型[3]。 序列相似性搜索工具。序列相似性搜索又分为成对序列相似性搜索和多序列相似性搜索。成对序列相似性搜索通过搜索序列数据库从而找到与查询序列相似的序列。分为局部联配和全局联配。常用的局部联配工具有BLAST和SSEARCH，它们使用了Smith-Waterman 算法。全局联配工具有FASTA和GGSEARCH，基于Needleman-Wunsch算法。多序列相似性搜索常用于构建系统发育树，这里不阐述。表二列举了常用的成对序列相似性比对搜索工具
蛋白质组学复习资料
蛋白质组学复习资料 一、名词解释 1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。 5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增：PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA 拆开； 2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 8、基因组文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。 9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA 文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。 10、基因芯片 基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。 是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。 将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。 12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。 13、Gene：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 14.genome：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 15.Protein：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 16.exon：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 17.蛋白质组学研究的两条途径：一条是类似基因组学的研究，即力图"查清"人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学研究；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的任何有意义的因素，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。 18.组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。 应该认识到，全基因组研究的发端和升温，是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的。而蛋白质组迄今还不具备相应的技术基础，且大规模的高通量DNA研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简
蛋白分析
Gi：40644130 allene oxide cyclase 【Niootiana tabacum】 丙二烯氧化环化酶(allene oxide cyclase, AOC) Gi：140083805 cytosolic class II small heatshock protein HSP17.5 【Rosa hybrid cultivar】 Gi：289487897 Lasoorbate peroxidasa 【Bruguiera gymnorhiza】 比如是核糖体16S, 18S，或ITS等DNA序列，一般在Blast n 中搜索，到底是用megablast，discontiguous megablast还是blastn要根据你的序列与数据库序列的相似性，一般首先用blastn，它对相似性要求较低，可发现大量相似序列，如果进一步要求，再选择megablast 等。但是注意blastn搜索数据库对核酸序列相似性要求较高，如果序列保守性不高，比如新的RNA病毒的基因组序列，可能很难得到结果，这时需要用blastp 或Blast x等。 如果是编码蛋白的基因序列，可先将其翻译成蛋白（注意，一条序列理论上有六种编码可能）然后分别去blastp搜索蛋白数据库，当然，你也可直接将其在Blast x中搜索，Blast x会自动将六种编码可能分别翻译后搜索蛋白数据库。 Blastp/PSI-Blast/PHI-BLAST都是蛋白序列与蛋白序列之间的Blast比对。 1，Blastp: 标准的蛋白序列与蛋白序列之间的比对 Standard protein BLAST is designed for protein searches. Blastp用于确定查询的氨基酸序列在蛋白数据库中找到相似的序列。跟其它的Blast程序一样，目的是要找到相似的区域。 2，PSI-BLAST : 敏感度更高的蛋白序列与蛋白序列之间的比对 PSI-BLAST is designed for more sensitive protein-protein similarity searches. Position-Specific Iterated (PSI)-BLAST，是一种更加高灵敏的Blastp程序，对于发现远亲物种的相似蛋白或某个蛋白家族的新成员非常有效。当你使用标准的Blastp比对失败时，或比对的结果仅仅是一些假基因或推测的基因序列时（"hypothetical protein" or "similar to..."），你可以选择PSI-BLAST重新试试。 3，PHI-BLAST : 模式发现迭代BLAST PHI-BLAST can do a restricted protein pattern search. PHI-BLAST, 模式发现迭代BLAST, 用蛋白查询来搜索蛋白数据库的一个程序。仅仅找出那些查询序列中含有的特殊模式的对齐。 PHI的语法详细介绍看这里：https://www.360docs.net/doc/d36629406.html,/blast/html/PHIsyntax.html The syntax for patterns in PHI-BLAST follows the conventions of PROSITE. When using the stand-alone program, it is permissible to have multiple patterns in a file separated by a blank line between patterns. When using the Web-page only one pattern is allowed per query.
蛋白质分析应用
蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质 背景介绍： 蛋白质是生命现象中最基本的物质基础，具有调节生理功能，充当药物分子、维生素、矿物质与微量元素的载体等功能。食用乳及乳制品是人体摄入蛋白质的重要途径之一。但一些不法分子为了获取经济利益，向乳制品中添加含氮量高的无机物质(如三聚氰胺、尿素、硝酸铵等)以提高蛋白质的含量，严重影响乳制品的质量和人们的身体健康。凯氏定氮法是我国用于蛋白质测定的常规检测方法，它是通过样品消解将样品中所有氮元素转化为氨，通过H2SO4或HCL标准溶液进行滴定，实现样品中蛋白质的测定，完成一个样品的整个分析过程至少需要2 h。从其原理可知，样品消解后所有氮元素均转化为氨，故该法无法区分蛋白质氮与非蛋白质氮。杜马斯燃烧法是国际上常用于蛋白质含量测定的方法。样品燃烧后生成的氮氧化物在钨上还原为分子氮，分子氮由二氧化碳载气运送到TCD热导检测器，氮含量引发一种电子测量信号，经过标准物质独立校正被测样品中氮含量，然后转换为蛋白质的含量。从原理上看，如不对样品进行预处理，该方法与凯氏定氮法同样也无法区分蛋白质氮和非蛋白质氮。 蛋白质快速检测仪原理和结构： 将某些有机试剂适量加入到含有蛋白质的溶液中时，有机试剂与蛋白质相互作用生成不溶性化合物(这些有机试剂可称为蛋白质试剂)，离心分离不溶性化合物，未与蛋白质反应的有机试剂仍存在溶液中。通过定量加入的有机试剂，借助蛋白质快速检测仪检测有机试剂吸光度的变化，可测定出样品中蛋白质的含量。因为溶液吸光度与有机试剂的浓度成正比，当蛋白质存在时，溶液中有机试剂浓度降低，其溶液吸光度也降低，降低程度与蛋白质浓度相关。 结果与讨论： 考察了不同温度对蛋白质含量测定的影响。在温度17～40℃范围内，温度对GDYN一200S蛋白质快速检测仪测定样品中蛋白质(标准值3．07％)无影响。考察了蛋白质试剂与蛋白质反应时间对测定结果的影响，结果表明，在室温条件下，搅拌l min样品中的蛋白质可与蛋白质试剂发生特异性反应；同时考察蛋白质试剂反应后上清液的稳定性，在2 h内测定的A和B两牛奶样品的蛋白质含量保持不变。整个蛋白质测定过程仅需5～10 min，与凯氏定氮法2～3 h相比，检测时间显著缩短。考察了GDYN一200S 蛋白质快速检测仪对样品测定结果的重复性。对A、B两牛奶样品蛋白质含量重复测定11次，其测定结果的精密度分别为O．9％和O．5％，表明GDYN一200S蛋白质快速检测仪测定结果具有良好的精密度。从蛋白质检测仪原理可知，检测信号为蛋白质试剂反应前后吸光度变化值。向蛋白质试剂中添加一定量的三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等非蛋白氮物质，以验证非蛋白氮是否干扰蛋白质的测定，结果如表3所示。通过紫外一可见分光光度计扫描可知，三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等添加物在483 nm处均无吸收，当加入蛋白质试剂时，未见不溶性化合物生成，蛋白质试剂溶液吸光度也未发生变化，表明三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等未与蛋白质试剂反应，不影响蛋白质的测定。将研制的GDYN 一200S蛋白质快速检测仪应用到新鲜乳、市售纯牛奶、牛奶饮料(核桃、燕麦、红枣)、奶粉(包括牛初乳粉)、豆浆粉、豆奶粉和鸡蛋等500个样品中蛋白质的定量测定，并与凯氏定氮法进行比较，同时测定了3种奶粉中蛋白质标准物质，部分结果见表5所示。从检测数据可知，与凯氏定氮法测定结果(依据国家标准方法[1’7]分别测定样品中的总氮和非蛋白氮，二者差减后计算出样品中真实的蛋白质含量)与标准物质相比，其相对误差均小于5％。从实验结果可知，蛋白质试剂可快速定量与样品中蛋白质发生反应(1 min)，且能稳定2 h，单一产品全程检测周期仅需5～10 rain；因蛋白质试剂仅与蛋白质氮特异性反应，避免了三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸铵等非蛋白氮的干扰；同时该仪器和方法操作简单，避免了传统检测方法消解、蒸馏和滴定等复杂步骤，适用于实际样品中的蛋白质定量检测。 参考文献：蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质冯旭东安卫东丁毅于爱民刘静等
蛋白质组学检测及分析方案
iTRAQ检测及数据分析
目录 一、项目简介 (3) 二、实验方案 (3) 2.1样品准备 (3) 2.2实验流程 (3) 2.3实验结果 (4) 三、分析方案 (4) 3.1原始数据预处理及均一化 (4) 3.2差异蛋白筛选 (4) 3.3层次聚类分析 (5) 3.4差异蛋白G ENE O NTOLOGY分析 (6) 3.5差异基因P ATHWAY分析 (6) 3.6差异蛋白N ETWORK分析 (7) 四、费用概算 (7) 五、时间概算 (7)
iTRAQ检测及数据分析方案 一、项目简介 样品情况： 对比情况：针对实验产出的原始数据进行生物信息学处理。组间相互对比筛选差异蛋白，并对差异蛋白进行后续生物信息学数据分析。具体内容见如下方案： 二、实验方案 2.1 样品准备 如果送样为溶液，则溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及吐温 20、40等系列的去污剂。盐浓度小于50mM。 样品可以直接寄送未处理的组织，组织样品需要>100Mg,如蛋白已经提取，则需要蛋白量>200ug。 2.2 实验流程 同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术是一种新的、功能强大的可同时对八种样品进行绝对和相对定量研究的方法。作为一种新的蛋白质绝对和相对定量技术，具有很好的精确性和重复性，并且弥补了DIGE及ICAT的不足。它可以结合非凝胶串联质谱技术，对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对定量研究。
2.3 实验结果 我们的实验结果将由专业软件Protein Pilot 3.0 (ABI,USA) 进行展示： 鉴定到的该蛋白质的肽断相关信息 同一个group的蛋白质 上图选中绿色的肽断的质谱图信息 所选定蛋白质（上表绿色）的肽断信息 质谱图定量信息 三、分析方案 3.1 原始数据预处理及均一化 首先对原始检测数据进行预处理和均一化处理。使得数据达到后期统计学分析要求。 3.2 差异蛋白筛选 利用统计学方法筛选差异表达的蛋白。一般认为高丰度蛋白鉴定出多个肽段，低丰度蛋
蛋白质组学及其主要技术
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
(整理)蛋白质组学实验方法
2、蛋白质分离的双向电泳过程 2．1溶液配制 常用水化上样缓冲液 （Ⅰ） 尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水定容至100ml （Ⅱ） 尿素 7M 4.2g 硫脲 2M 1.52g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水定容至100ml (Ⅲ) 尿素 5M 3.0g 硫脲 2M 1.52g SB3-10 2% 0.2g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水定容至100ml 分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液母液 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.05M pH8.8 3.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl) 甘油 20％ 20ml
MilliQ水定容至100ml 分装成10管，-20℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液Ⅰ 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。 胶条平衡缓冲液Ⅱ 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混匀，用时现配。 低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖 0.5％ 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml(10%SDS) 溴酚蓝 0.001％ 100μl(1% 溴酚蓝) MilliQ水定容至100ml 加热溶解至澄清，室温保存。 30％聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙稀酰胺 4g MilliQ水 500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。 1.5mol/L Tris碱pH8.8 Tris碱 90.75g MilliQ水 400ml 用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml, 4℃冰箱保存。 10% SDS SDS 10g
蛋白质生信分析
蛋白质生物信息分析 基本性质分析: https://www.360docs.net/doc/d36629406.html,/protparam/ 参考文献:Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExP ASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607 翻译后修饰： 信号肽预测http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/ 残基磷酸化预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ 跨膜结构预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/ http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS 亚细胞定位：http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ http://psort.hgc.jp/ 1一级结构分析：https://www.360docs.net/doc/d36629406.html,/protscale/ 1二级结构分析：http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html Significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments., Cabios (1995) 11, 681-684 Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March V ol. 25, No 3 [291]:147-150 1二级结构预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/ CPHmodels-3.0 - Remote homology modeling using structure guided sequence profiles Nielsen M., Lundegaard C., Lund O., Petersen TN Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, doi:10.1093/nar/gkq535 View the abstract. CPHmodels 2.0: X3M a Computer Program to Extract 3D Models. O. Lund, M. Nielsen, C. Lundegaard, P. Worning