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网箱养殖患病草鱼鉴别与感染
草鱼Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎｉｄｅｌｌｕｓ属鲤形目鲤科，是中国重要的淡水养殖鱼类，它与鲢、鳙和青鱼一起，构成了中国著名的四大家鱼．草鱼是草食性鱼类，已经有１７００多年的养殖历史［１］．由于草鱼养殖具有周期短、肉味鲜美、经济效益高等特点，目前草鱼已经成为乌江网箱养殖量最大的鱼类品种．然而，随着乌江流域的工农业发展和人口增长，每年都有大量的工业和生活污水流入乌江，使乌江水质变差尤其在枯水季节，鱼病发生频繁，给草鱼养殖造成了很大的经济损失．因此，其病害的防治显得十分迫切．目前，ｒＲＮＡ和ｒＤＮＡ作为分子指标广泛应用于细菌遗传特征和分子差异研究［２］．大量已知细菌的ｒＲＮＡ基因数据已被测定并输入了国际基因数据库，成为细菌鉴定和分类的参照系统［３］．本研究以患病草鱼为材料，对分离所得菌株采用１６ＳｒＲＮＡ基因序列测定，将测序结果输入国际基因数据库，通过同源性比对鉴定致病菌．然后用致病菌接种健康草鱼，进一步验证其致病性，从而为草鱼的病害防治提供病原依据．１材料与方法１．１试验材料患病草鱼标本５尾于２００８年４月采自乌江上游主要支流中的偏岩河养殖场，采集时标本材料个体病征相似．其中２尾草鱼病症为烂鳃、烂尾、烂鳍，体表发红；３尾草鱼病症为烂鳃、烂鳍，体表、肠发红，肠道出血．１．２细菌的分离用无菌棉签分别沾取患病草鱼体表患处、鳃部、肠内溶物、体内血液、肝脏表面和肝脏内部，并分别涂布于营养琼脂培养基平板上．将接种后的平板倒置于２７℃恒温培养箱中培养１２ｈ．长出菌落后取出平板，将平板中不同的菌落分别转接到空白营养琼脂培养基平板中，转接后的平板倒置于２７℃恒温箱中培养１２ｈ．重复此步骤几轮，直至一个平板中只长有一种菌落［４］．将纯化后的平板取出，对细菌的厚薄、大小、表面、边缘、隆起形状和颜色等进行观察记录．１．３基因组ＤＮＡ的提取和１６ＳｒＲＮＡ基因的扩增、测序及数据处理参见李顺等［４］的方法．１．４细菌的回复感染１．４．１细菌的培养将分离到的细菌接种于营养琼脂培养基平板上，置于２７℃隔水式恒温箱中培养，直至长出菌落．１．４．２细菌悬液的制备取已长出菌落的平板，在超净工作台上用灭菌生理盐水洗下菌苔于试剂瓶中制成细菌悬液，保存于冰箱中４℃．回复感染前，将细菌悬液用灭菌生理盐水分别以０，５，１０，１００和１０００倍梯度稀释．１．４．３细菌悬液体积分数测定用平板菌落计数法测定细菌悬浮液中活菌数目．各梯度菌液体
积分数细菌密度约为１×１０１０，２×１０９，１×１０９，１×１０８，１×１０７个／ｍＬ．１．４．４感染草鱼用于回复感染的健康草鱼取于乌江偏岩河养殖场网箱中，体长１５～２０ｃｍ，体质量８０～１５０ｇ，每组１０尾．用不同体积分数的菌液以肌肉注射１ｍＬ／尾和浸泡两种方式感染试验鱼两种方式都用以上几种梯度的菌液感染，对照组注射相同剂量的生理盐水．将以上试验鱼置于３ｍ×３ｍ的水泥鱼池中水深７０ｃｍ，连续充氧，连续观察１５ｄ．２结果与分析２．１菌落外部形态和革兰氏染色结果将纯化后的平板取出，对细菌菌落进行形态观察，再革兰氏染色［５］后观察．通过比较外部形态和革兰氏染色结果，从５尾患病草鱼中共得到７株不同菌株表１．２．２１６ＳｒＲＮＡ基因的扩增结果对分离到的７个菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因进行ＰＣＲ扩增，均扩增出一条约６００ｂｐ的片段图１．２．３１６ＳｒＲＮＡ测序结果Ｉ菌株的测序结果５８０ｂｐ，不包括引物序列见表２其余菌株的测序结果略．２．４菌株的鉴定对１６ＳｒＲＮＡ基因部分序列正、反方向测序的结果进行拼接，拼接后的测序结果输入到ＮＣＢＩ网站．利用ＢＬＡＳＴ工具，对序列进行同源性比对分析，所得结果见表３．２．５回复感染将初步鉴定的以上细菌分别接种到健康草鱼，发现注射感染后致病体积分数在１×１０８～１×１０９个／ｍＬ之间．４．浸泡感染组和对照组在回复感染后的１５ｄ内均无明显症状．３讨论随着现代生物技术的飞速发展，１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析技术在微生物分子检测及分类鉴定中得到了广泛的应用．以１６ＳｒＲＮＡ基因为目的基因的现代分子生物学技术能精确地揭示微生物种类及遗传的多样性，从而使１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析成了微生物分类鉴定的主要依据，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及多样性的评估等领域，是一种客观和可信度较高的分类和鉴定方法［６］．本研究用微生物学常用的细菌分离纯化方法从患病草鱼中分离出７株菌株，分别扩增出了１６ＳｒＲＮＡ基因约６００ｂｐ的片段．一般认为，１６ＳｒＤＮＡ序列同源性大于９９％，可以认为属于同一种；同源性大于９５％而小于９８％，可以认为是同一个属的不同种；同源性在９３％～９５％之间，可以认为属于不同的属［７］．通过对１６ＳｒＲＮＡ基因序列进行同源性比对分析，初步鉴定Ⅰ为沙雷氏菌，ＩＩ为腐生葡萄球菌，ＩＩＩ为荧光假单孢菌，ＩＶ为产碱普罗威登斯菌，Ｖ为嗜水气单孢菌，ＶＩ为杀鲑气单孢菌，