马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

基因组学与应用牛物学ｗｗｗ．ｇｃｎｏａｐｐｌｂｉ０１．ｏｒｇ４６ｚＧｅｎｏｒ南ｃｓａｎｄ

ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｙＤＯＩ：１０．３９６９／ｇａｂ．０２８．０００４６０

Ｐ盯ＣＰ

ｇｅｎｅ

Ｉｐｃｒ

０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．６的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释成

ｌ¨ｇ／ｍＬ，包被ＥＬＩＳＡ板，每孔１００斗Ｌ、３７。Ｃ孵育４ｈ；

：Ｒ、用ＰＢＳＴ洗板３次，拍干，加入病汁液，每孔１００斗Ｌ，

４℃过夜：用ＰＢＳＴ洗板３次，拍干，加入１／４０００稀

释的酶标抗体，每孔１００斗Ｌ，３７℃孵育３ｈ；用ＰＢＳＴ

洗板４次，拍干，加底物，每孔１００斗Ｌ，１ｈ后观察并

读取ＯＤ蜘值。

Ｐ阿ＣＰｇｅｎｅ

Ｉｐｃｒ

２结果与分析

２．１ｐＵＣｌ９－Ｙ３００载体构建

将ＰＷ．Ｓ和Ｐ、Ⅳ．Ｌ两个片段以相反方向插入

克隆载体ｐＵＣｌ９后得到重组克隆载体ｐＵＣｌ９一Ｙ３００。

用ｇ，ｎＩ和ＳａｃＩ双酶切载体ｐＵＣｌ９一Ｙ３００，可切下

Ｐ、Ⅳ．Ｓ片段，用ＢａｍＨＩ以及勋尼Ｉ双酶切载体

ｐＵＣｌ９一Ｙ３００，可切下ＰＶＹ．Ｌ片段；用ＳａｃＩ和

ＢａｍＨＩ双酶切载体ｐＵＣｌ９一Ｙ３００，可切下Ｐｗ．Ｓ＋

ＰＶＹ．Ｌ长为６５４ｂｐ的片段，结果证明ＰＶＹ－Ｓ和

ＰＶＹ－Ｌ两个片段已成功插入到克隆载体中（图２）。

２．２植物表达载体ｐＲＯＫＹ３００的构建

将从克隆载体ｐＵＣｌ９－ＹＳＬ上切下的长６５４ｂｐ

的片段ＰＶＹ－Ｓ＋ＰＶＹ－Ｌ与植物表达载体ｐＲＯＫＩＩ连

接得到重组载体ｐＲＯＫＹ３００，经ＳａｃＩ和ＢａｍＨＩ双

酶切检测和测序，与预期结果相同（图３），表明表达

载体已成功构建。

Ｋａｎ（Ｒ）

２．３瞬时表达后植物抗病性表现

农杆菌浸润４ｄ后，用常规机械磨擦接种方法，

进行病毒接种，病毒接种１０ｄ后测试植株的抗病性ＮＯＳｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ

图１载体构建过程示意图

Ｆｉｇｕｅｒ１Ｔｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ图２克隆载体ｐＵＣｌ９一Ｙ３００酶切检测

注：ｌ：蜘ｎＩ和ＳａｃＩ双酶切ｐＵＣｌ９－Ｙ３００；２：ＢａｍＨＩ和＾，ｐｎＩ双酶切ｐＵＣｌ９－Ｙ３００；３：ＳａｃＩ和ＢａｍＨＩ双酶切ｐＵＣｌ９一Ｙ３００；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ

Ｆｉｇｕｅｒ２Ｄｏｕｂｌｅｅ１１ｚｙｍｃ８ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＵＣｌ９－Ｙ３００ｖｅｃｔｏｒ

Ｎｏｔｅ：ｌ：ｐＵＣｌ９－Ｙ３００ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｂｏｔｈ印ｎＩａｎｄＳａｃＩ；２：ｐＵＣｌ９一Ｙ３００ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｂｏｔｈＢａｍＨ

Ｉａｎｄ杨聘Ｉ；３：ｐＵＣｌ９－Ｙ３００ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｂｏｔｈＳａｃＩａｎｄＢａｍＨＩ：Ｍ：ＤＮＡ

ｍａｒｋｅｒⅢ

马铃薯Ｙ病毒ＣＰ基因ＲＮＡｉ载体构建与干涉效果测定

ＲＮ舢ｖｌ沁ｔｏｒＴａｒｇｅｔｉｎｇ舳ｄＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＥｆｆｅｃｔＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＰＶＹＣＰＧｅｎｅ４６３

图３表达载体ｐＲＯＫＹ３００酶切检测

注：ｌ：ＳａｃＩ和ＢａｍＨＩ双酶切ｐＲＯＫＹ３００；２：ｐＲＯＫＹ３００质粒电泳；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒｍ

Ｆｉｇｕｅｒ３ＤｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｓｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＲＯＫＹ３００ｖｅｃｔｏｒ

Ｎｏｔｅ：ｌ：ｐＲＯＫＹ３００ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｂｏｔｈＳａｃＩａｎｄＢａｍＨＩ：２：ｐＲＯＫＹ３００ｐｌａｓｍｉｄ；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅢ

表型如表ｌ所示。从表型看，瞬时表达后的烟草植株有７０％未观测到发病症状。

２．４ＤＡＳ．ＥＬＩＳＡ检测

病毒接种１０ｄ后开始ＤＡＳ．ＥＬＩＳ检测，以检测植株的病毒积累量情况，未观测到发病症状的植株检测值均达不到阳性标准，而感病株的均为阳性，结果表明，未观测到发病症状的植株的病毒积累量也显著低于对照组，进一步验证了所构建载体具有较好的干涉效果（表２）。

３讨论

随着人们对ＲＮＡ沉默机制研究的不断深入，基于ＲＮＡ沉默的植物抗病毒基因工程也显示出在植物病毒防治上的应用潜力，该方法具有特异、高效等优点。近年来，人们利用ＲＮＡ沉默的机制进植

表１浸润后烟草植株的抗病性表现

ＴａｂｌｅＩＲｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄｔｏｂａｃｃｏ

表２浸润后烟草植株的ＥＬＩＳＡ检测结果

Ｔａｂｌｅ２ＥＬＩＳＡｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄｔｏｂａｃｃｏ物抗病毒研究的成功例子越来越多，Ｋａｍａｃｈｉ等（２００７）选择黄瓜绿斑驳花叶病毒（ＣＧＭＭＶ）的外壳蛋白基因为沉默的靶标基因，颜培强等（２００７）选择烟草花叶病毒ｆｒＭＶ）外壳蛋白基因为沉默的靶标基因，

Ｂｏｎｆｉｍ等（２００７）选择菜豆金色花叶病毒（８ＧＭＶ）ＡＣ１基因为沉默的靶标基因以及Ｔａｋｕｍｉ等（２００９）人选择以水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）的非结构蛋白基因Ｐｎｓｌ２为沉默的靶标基因分别对黄瓜绿斑驳花叶病毒（ＣＧＭＭＶ）、烟草花叶病毒（ＴＭＶ）、菜豆金色花叶病毒（ＢＧＭＶ）、水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）等重要植物病毒的抗性进行研究，得到了许多较为稳定和高效的转基因抗病毒植物株系，充分证明了ＲＮＡ沉默技术已经成为植物抗病毒基因工程研究的一个重要手段。有研究表明所选择被沉默的靶标基因在病毒复制过程中所起的作用越关键，越是在复制的早期阶段起作用，沉默效果就越明显。由此可见，如何被沉默的靶标基因将成为ＲＮＡ沉默抗病毒研究的一个重点。被沉默由于ＲＮＡ沉默的特异性，所选择的沉默靶序列保守性就显得至关重要，本研究对Ｐ、吖的几个株系的多条ＣＰ基因序列进行比对分析，选择了ＰＶＹＣＰ基因３’端一段长３００ｂｐ的保守序列，为下一步获得对不同株系ＰＶＹ具有普遍抗性的转基因植株打下了基础。将Ｐ、Ⅳ．Ｓ和Ｐ、Ⅳ．Ｌ两个片段以正向和反向分别插入植物表达载体ｐＲＯＫＩＩ的３５Ｓ启动子下游，从而．在转录后两个片段自行折叠配对形成发卡结构。该方法简单易操作，但以ＣＰ基因自身的一个片断代替了发卡结构中的内含子，是否会对抗性效果有影响还有待进一步研究。

本文通过农杆菌渗入的方法瞬时表达了ｈａ卸ｉｎＲＮＡ，在本氏烟上检测所构建载体ｐＲＯＫＹ３００的干涉效果，有７０％的供测植株在浸润后接毒，未发病，而对照组全部发病，初步验证了所构建载体的干涉效果，为下一步的研究工作打下了基础。在下一步工作中如果我们将不同病毒的保守序列融合，?构建针对不同病毒的反向重复结构载体，就可能获得具有

广谱抗性的转基因植株。

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

作者：李奇科，陶刚，邱又彬，邱礽，迟胜起，朱英，刘作易， LiQike， Tao Gang，Qiu Youbin， Qiu Reng， Chi Shengqi， Zhu ying， Liu Zuoyi

作者单位：李奇科,邱又彬,邱礽,LiQike,Qiu Youbin,Qiu Reng(贵州大学生命科学院,贵阳,550025;贵州省农业生物技术重点实验室,贵阳,550006)，陶刚,Tao Gang(贵州省农业生物技术重点实

验室,贵阳,550006;贵州省植物保护研究所,贵阳,550006)，迟胜起,Chi Shengqi(青岛农业

大学植物保护学院,青岛,266109)，朱英,Zhu ying(贵州省农业生物技术重点实验室,贵阳

,550006;贵州省生物技术研究所,贵阳,550006)，刘作易,Liu Zuoyi(贵州省农业生物技术

重点实验室,贵阳,550006)

刊名：

基因组学与应用生物学

英文刊名：GENOMICS AND APPLIED BIOLOGY

年，卷(期)：2009,28(3)

被引用次数：3次

参考文献(9条)

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引证文献(3条)

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3.邱礽.陶刚.李奇科.邱又彬.刘作易农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用[期刊论文]-分子植物育种

2009(5)

本文链接：https://www.360docs.net/doc/d09012475.html,/Periodical_jyzxyyyswx200903009.aspx

马铃薯种薯质量的田间检验操作规程

附件21 甘肃省马铃薯脱毒种薯（种苗）病毒检测及安全性评价工程中心马铃薯种薯质量的田间检验操作规程马铃薯种薯质量田间检验的目的是尽可能的将病源的数量减到最少，生产合格的种薯。马铃薯种薯质量田间检验以目测为主，比实验室操作简单，易于执行，比收获后和库房检测范围大，能够实时掌握种薯生产整体情况，对质量控制作用效果显著。影响种薯质量最重要的是病毒和细菌病害，它们在植株上引发一系列症状，应用这些症状进行质量诊断很实用也很方便，在大田种薯繁育中，检测的灵敏性要求不像检测母株时那么高，此时观察症状就成为除去感染植株最迅捷的方法。 1田检种类狭义的田间检验指的是由第三方监督检测单位进行的监督检验。广义的田间检验根据针对不同群体需要，分为以生产为目的的检测（自检）和以质量评价为目的的检测（监督检验），前者执行单位为马铃薯种薯生产单位，后者为马铃薯种薯质量监督单位，二者并重。自检与监督检验依据相同的标准“马铃薯种薯GB 18133-2012 ”，先自检后监督检验，生产单位通过自检降低田间病害比率，以达到所生产级别种薯的最低要求，然后检测或监督管理单位通过田检评价种薯生产是否达到相关标准。不同目的的田检其检测技术细节有很大差异，自检具有及时、全面、细致的特点，即在整个生长季节不问断执行全田检测，每一个有异常的植株需要对全株进行详细观察。监督检验具有客观、准确、高效的特点，即抽查检测要有代表性，在规定的时间段仅有的几次检测结果能真实反应全田基本质量状况。无论自检还是监督检测的田检员，都要在检测前详细掌握被检田块的基本信息。 1.1检测内容马铃薯对许多的病虫害非常敏感，这在所有马铃薯生长的地区都是一样。有些病虫害通过土壤传播的，也有的可以通过种薯传播。许多传播广泛的病害被视为质量病害，例如晚疫病、疮痂病、丝核菌溃疡病、黑胫病、镰刀菌病害以及一些病毒性病害。这些质量病害在种薯中只能允许非常低的感染率。除了质量病害

马铃薯

·· PLRV 病毒检出率较低，田间PLRV 病毒也是4 种病毒中检出率最低的病毒，说明在南方的气候条件下 PLRV 病毒不活跃，不会影响马铃薯生产。 1.3 存在的问题与思考从表1 中可以看出，不同省份间马铃薯病毒种类差异较大，然而这一结果不能真实地反应马铃薯病毒在我国不同地区间的分布差异。原因是很多对马铃薯病毒发生情况的调查，都是针对特定马铃薯病毒进行的检测，对其它的病毒未进行检测，调查的结果中那些未检测的病毒在该地区马铃薯上是否发生则无从判断。产生这一现象的原因主要是我国在马铃薯脱毒种薯生产标准中及一些地方标准中（表 3 ）明确要求进行病毒（类病毒）检测的对象只有 5~7 种，这几种病毒便成为人们关注的对象，因此在进行病毒种类调查中忽视了对其它病毒的调查，至使这些被忽视的病毒在我国的发生与分布情况很少报道。这一现象可能会带来一些潜在的威胁，例如可能会导致一些马铃薯上原本不很重要的病毒在人们不知不觉中大规模地被扩散蔓延。由上可知，我国很多马铃薯产区尚缺少全面、系统的马铃薯病毒调查，而掌握本地区马铃薯病毒的种类可为本地区的病毒病防治提供理论支撑。 2 脱毒种薯生产过程中病毒的检测 2.1 我国马铃薯脱毒种薯生产标准中对病毒（类病毒）检测的规定我国于 2000 年10 月10 日开始实施的中华人民共和国国家标准马铃薯脱毒种（ GB 18133-2000），一些省份也出台了相应的地方标准对马铃薯脱毒种薯生产过程中的病毒检测进行规范（表 3）。对比

表3 中各地方标准与国家标准间的区别可以看出，病毒Virus 分布的省份The distribution province PVY PVX PLRV PVS PVM PV A PSTVd 黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、河南、河北、山东、山西、甘肃、云南、贵州、青海、四川、福建、重庆、广东、广西黑龙江、内蒙古、辽宁、吉林、甘肃、青海、山西、河北、湖北、福建、河南、云南、山东、广西、贵州、湖南、四川黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、山东、浙江、四川、广西、云南、贵州、青海、福建黑龙江、内蒙古、辽宁、河北、广西、湖南、四川、青海、浙江、福建、山东、贵州辽宁、黑龙江、河北、四川、青海、云南黑龙江、湖南、四川、湖北、浙江、河北、福建、广西、青海主要分布在北方马铃薯种植区定。检出的病毒种类有PVX、PVY、PLRV、PVM、 TSWV、TRV like、PMTV like 7 种，其中PVX、 PVY、PLRV 是主要毒源。王培伦等 [ 7 ] 2002 年报道，山东省马铃薯上侵染严重的有PLRV、PVY、PVX、 PVS 等病毒。王秀芬等 [ 8 ] 对大连地区马铃薯病毒进行检测，证明 PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM 均有发生，马铃薯品种复杂，种薯来源不一，品质很难保证。规范大连地区马铃薯种薯的销售可以杜绝病毒初侵染源，从而有效地控制病毒病的发生与蔓延。吴兴泉 [ 9 ] 2009 年对近年来我国有报道的马铃薯主要病毒的分布情况进行了总结（表2）。 1.2 我国西南地区与东北地区马铃薯主要病毒发生

马铃薯脱毒种薯行业发展前景分析

马铃薯脱毒种薯行业发展前景分析马铃薯是我国第五大粮食作物,营养丰富,粮菜饲兼用,加工用途多,产业链条长,增产增收潜力大。我国是一个人口大国,耕地减少和人口增加的矛盾不可逆转,大力发展马铃薯产业对确保粮食安全,促进农民增收,振兴农村区域经济具有重要的战略意义。联合国将2008年定为国际马铃薯年,引起全世界人民的普遍关注,各国政府相继出台许多优惠政策支持本国的马铃薯产业发展,使马铃薯产业发展呈现出：脱毒种薯需求逐渐增加、生产面积逐步扩大、加工能力显著提高、经济贸易份额不断增长的良好态势,前景十分广阔。我国脱毒马铃薯良种应用面积仅为种植面积的20%左右,而发达国家在90%以上。我国马铃薯种植面积将近8000万亩,年用种量需800万吨左右,是世界上最大的种薯市场。随着全国“科技兴薯”战略的大力推进,脱毒种薯需求将逐渐扩大,根据《农业部关于加快马铃薯产业发展的意见》,2012年全国实现脱毒种薯应用面积平均35%的目标,国内脱毒种薯需求量将达到450万吨。目前,我国脱毒马铃薯原原种繁供能力还很低,真正意义上的脱毒原原种(微型薯)不足3亿粒,是阻碍国内脱毒种薯产业发展的主要原因;加之各地的质量标准不统一、检测手段还落后和监督体系不健全,致使种薯质量参差不齐,已成为制约我国马铃薯产业向纵深发展最突出的问题。另外,多年来我国马铃薯育种目标是以鲜食为主,生产品种具有浓郁的温饱色彩,加工等专用品种严重缺乏,这是当前我国马铃薯种薯生产比较薄弱的标志性现状。本文从研究我国马铃薯产业发展情况入手,通过对马铃薯脱毒种薯行业分析,采用了查阅文献资料,数据分析,现场调研等研究方法对马铃薯的开发利用价值和行业发展状况进行研究分析；解析了马铃薯脱毒种薯标准,马铃薯脱毒种薯行业行业细分,马铃薯脱毒种薯行业繁育,生产、需求及马铃薯行业国家产业规划,各省区地区马铃薯脱毒种薯行业政策；运用定量分析法,图例对比,卫星影像对比等研究方法,对马铃薯加工产业情况,马铃薯脱毒种薯行业进入门槛条件,马铃薯脱毒种薯行业市场前景,马铃薯脱毒种薯行业政策支持,行业发展制约因素进行了系统的研究,论证后提出行业发展前景分析结论：马铃薯脱毒种薯行业前景很好和行业发展空间还非常大。

马铃薯脱毒苗组培快繁技术

马铃薯脱毒苗组培快繁技术 (酒泉职业技术学院秦晓萍甘肃?酒泉 730500) 摘要本论文主要从培养基的制作、脱毒苗的制取、继代培养、培养条件、瓶装苗污染控制等方面介绍了马铃薯脱毒苗快繁技术，为马铃薯快繁生产提供参考。关键词马铃薯脱毒苗快繁技术马铃薯是我国主要的粮食、蔬菜及工业原料作物，其国民经济意义十分重要，在保证粮食安全生产方面发挥了重大作用。随着农业产业结构的调整，我国马铃薯的种植面积和总产量也在不断的增加。但在连年的栽培过程中，病毒或类病毒不断的侵染和积累，从而导致马铃薯种性变劣，长势逐步减弱，产量逐年降低。马铃薯快繁是在短时间内利用组织培养技术获得大量高质量的试管苗，应用种薯脱毒技术， [1]培养无毒组培苗，在提高产量、保证品质、耐贮藏方面体现出了独特的优势。 1 培养基的制作 1.1培养基的配方利用提供的母液和材料MS+0.01mg/L NAA+3%蔗糖+0.56%的琼脂，PH为5.8，配置培养基1000ml,并均匀分装到24个培养瓶，进行灭菌。母液浓度/扩大倍数配置体积(ml) 母液吸取量(ml) 称取量(g) 大量元素 20 50 — 钙盐母液 20 50 — 磷酸盐溶液 20 50 — 铁盐 100 10 — 微量元素 100 10 — 1000 有机物 100 10 — 萘乙酸(NAA) 0.1mg/L 0.1 —

蔗糖 3% — 30 琼脂粉 0.56% — 5.6 1.2 培养基的配制 1.2.1仪器、用具与试剂 (1)仪器:PH试纸、电磁炉、高压灭菌锅 (2)用具:移液抢、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶、玻璃棒、洗瓶、烧杯、搪瓷缸、镊子、钥匙、称量纸、胶头滴管、抹布、卷纸、标签纸、 (3)试剂:配置MS培养基的各种母液、激素母液、琼脂、蔗糖、蒸馏水、 0.1mol/LHCL、0.1mol/LNaOH 1.2.2 培养基制作 (1)准备工作将配置好的MS培养基母液从冰箱中取出，检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。 (2)移取母液用移液管移取各种母液，在移取时冲洗移液管，移取出后加入事先准备好装有蒸馏水的烧杯中定容，然后加入熬好的培养基中。 (3)称取蔗糖、琼脂然后融化琼脂，边加热边搅拌防止糊底。直至琼脂全部融化及清撤见底，加入准备好的母液和蒸馏水。 (4)混合培养基各个成分并定容，调整PH值。用0.1mol/LNaOH或HCL液把PH 值调5.8左右后，连续调三次所测定的平均值作为最后的用量值。加后一定要搅拌均匀。 1.3 培养基的分装培养基合成后要趁热分装，1000ml的培养基要分装到24个培养瓶中每瓶约30,40ml培养基。分装时要垂直向下，不要让培养基沾到杯壁上。然后快速的盖上盖子，盖子要拧紧。 1.4灭菌操作步骤

马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展

马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展第一组：郭保密、尹韵绮、张岳摘要：马铃薯茎尖脱毒技术的应用克服了马铃薯的病毒病和类病毒病的危害，是目前解决马铃薯退化最为有效的途径。文章从马铃薯茎尖脱毒的原理、过程以及影响病毒去除的因素等方面进行了综述，以期为马铃薯茎尖脱毒技术的深入研究提供一定的理论依据。关键词：马铃薯；茎尖脱毒；病毒类型；影响因素栽培种的马铃薯（Solanum tuberosumL.,2n=48）是双子叶种子植物，属茄科（Solanceae）茄属（Solanum）的一年生草本植物，生产上绝大多数是利用块茎进行无性繁殖[1]。马铃薯栽培种起源于南美洲秘鲁以及沿安第斯山脉智利沿岸、玻利维亚等地，在五大洲140多个国家都有种植和分布。2004年国际马铃薯中心（CIP）和国际食品政策中心（IFPRI）合作研究表明，在世界范围内，到2020年对马铃薯的需求将有望增长40%，超过水稻、小麦和玉米的增长。特别是在亚洲和非洲，对马铃薯的需求将增长更快[2]。随着农业产业结构的调整，我国马铃薯的种植面积和总产量也在不断的增加，到2010年，我国马铃薯种植面积达到600万hm2，产量达到1.8亿t[3]。但在连年的栽培过程中，病毒或类病毒不断的侵染和积累，而病毒在马铃薯植株中是系统感染，能阻碍病毒增殖的药剂往往也会影响寄主植物的代谢系统，到目前为止，还没有像防治病虫害一样能有效防治植物病毒病的化学药剂。病毒的侵染及其在薯块内积累引起了马铃薯的退化，马铃薯退化后一般减产20%～30％，严重者减产80％以上[4]。随着病情逐年加重，严重者失去发芽能力，最后失去利用价值，给我国马铃薯乃至世界马铃薯生产带来十分严重的危害，使得栽培面积及产量难以进一步提高[5]。在我国主要侵染马铃薯的病毒有7种，它们是PVX、PVY、PVS、PVM、PAMV、PAV、PLRV[6]，其余侵染马铃薯的病毒是来自其它寄主植物的病毒。采用无病毒植株是解决马铃薯退化的有效途径，获得无病毒植株的途径有自然选择、物理学方法、化学药剂处理和生物学方法[7]。其中最行之有效的方法便是生物学方法中的茎尖脱毒。文章就马铃薯茎尖脱毒培养技术中各个环节的研究进展和影响因素做出综述，以期为马铃薯茎尖脱毒技术的深入研究提供参考。 1茎尖培养脱毒的原理马铃薯脱毒的方法有多种，其中以茎尖脱毒的效果最好，已成为最常用和经济有效的脱毒方法，其原理是利用病毒在植物体内分布的不均匀性，即根尖和芽尖的分生组织含病毒量少或不含病毒的特性，导致这一现象的原因可能由以下因素引起：（l）分生组织旺盛的新陈代谢活动。病毒的复制须利用寄主的代谢过程，无法与分生组织旺盛的代谢活动竞争；（2）分生组织缺乏真正的维管组织。大多数病毒在植株内通过韧皮部进行迁移，或在细胞间通过胞间连丝传输，因为细胞与细胞间的移动速度较慢，在快速分裂的组织中病毒浓度高峰被推迟；（3）高浓度的生长素。分生组织的生长素浓度通常很高，可能影响病毒的复制[8-9]。根据这些原理，Morel等人在1955年以马铃薯为材料，利用茎尖组织培养，获得了无病毒植株[10]。这个试验的成功，为马铃薯脱毒开辟了新途径。现在几乎所有马铃薯生产国都在使用这种技术，马铃薯脱毒去除了主要病毒，恢复了原品种的特征特性，有效解决了马铃薯退化的问题。 2马铃薯脱毒过程 2.1脱毒种薯生产程序采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。试管

浅析马铃薯病毒检测技术

马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。马铃薯病毒检测包括：基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法（DAS-ELISA）检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。 1马铃薯病毒的概况 1.1马铃薯X病毒（PVX）也称普通花叶病毒,是一种长520～550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。一般减产5%～10%,症状是叶片从轻型花叶到叶片有较轻的皱缩。马铃薯X病毒靠汁液传播,也是传播最广泛的一种病毒。 1.2马铃薯Y病毒（PVY）也称重花叶病毒,是马铃薯第二个重要病毒性病害,是一种长680～900nm的线状病毒,在电镜下找不到它的中心孔和外壳蛋白亚基的横纹,它比PVX更细一些、更长一些。通过感染的块茎长期存在并由蚜虫非持续性地传播,产量损失可达80%。症状随着病毒株系、马铃薯品种及环境条件变化很大。1.3马铃薯A病毒（PVA）又称轻花叶病毒,在许多方面类似于马铃薯Y病毒。在某些品种中出现时,一般比马铃薯Y病毒轻,产量损失可达40%。马铃薯A病毒引起花叶(有时很严重),同时也发生脉缩和卷曲,叶片可能出现闪光。 1.4马铃薯S病毒（PVS）也称潜隐性花叶病毒,感病块茎变小,一般减产浅析马铃薯病毒检测技术景彩艳（甘肃省定西市农产品质量安全监督管理站定西743000）摘要：随着科学技术的不断发展,马铃薯病毒检测技术在日益的完善,DAS-ELISA法已经成为马铃薯病毒检测的常规方法。容易侵染马铃薯的病毒类型主要有6种,分别是马铃薯的PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA病毒。马铃薯在生长的过程中,因受到各种不同病害的侵染,容易造成减产和退化。血清学技术是马铃薯病毒检测的主要手段。关键词：马铃薯病毒；血清学技术；双抗体夹心酶联免疫吸附法 215 --

马铃薯脱毒快繁技术研究与应用

马铃薯脱毒快繁技术研究与应用该项研究主要目的解决病毒性退化对洛阳市马铃薯生产所造成的严重产量损失及常年从外地调种所造成的人力、物力巨大浪费,建立豫西地区脱毒马铃薯种薯繁种体系,进行当地繁种,结合间作套种模式,在生产上大面积应用,实现马铃薯生产的高产高效益。该项研究的技术关键是:茎尖分生组织培养成苗、病毒检测、脱毒试管苗及微型种薯快速高效低成本生产等。该项研究的技术创新点是:针对豫西的生态条件,在豫西洛阳马铃薯主要病毒类型调查的基础上,研究了马铃薯茎尖分生组织培养成苗及快繁技术,并对常规马铃薯脱毒技术进行了低成本生产技术研究和程序简化研究,在国内首次采用培养基中加入适量的氯溴异氰尿酸,可以取代高压灭菌过程。建立了“二年三季”豫西脱毒马铃薯良种繁育体系,进行当地快繁,供应生产应用。通过三年的工作取得如下进展:1、明确了豫西马铃薯生产上主要病毒类型及各种病毒的发生频次。经过对样本进行病毒检测,结果表明植株带毒率为54.95%,五种马铃薯病毒发生频率为:PVX24.18%、PVY23.67%、PVS12.09%、PVM4.4%、PLRV9.9%。在带病毒植株中,一种病毒单独侵染的为68%,两种以上病毒复合侵染的占32%。2、进行了马铃薯茎尖分生组织培养成苗及快速扩繁的技术研究,对马铃薯脱毒种苗、种薯生产中的低成本技术及简化程序进行了研究与应用。茎尖取材最好用顶芽,切取茎尖大小0.2-0.3CM为宜。合适的培养基是 MS+0.1GA3+6-BA0.5+0.05NAA,温度25℃,光照16h/d,光强1000LX。生长培养基采用基本MS培养基,温度25℃,光照16h/d,光强2000LX。在试管苗的生产中,采用罐头瓶、固体培养基、在配制培养基时用普通食用白糖替代

马铃薯病害防治

马铃薯病害防治一、马铃薯病毒及类病毒（一）马铃薯病毒及类病毒的种类与危害马铃薯新品种推广后，随着种植年限的增加，产量逐年下降，植株变矮，薯快变小，并伴有茎叶异常现象，如花叶、叶片卷曲或皱缩等。这种现象称之为退化。引起马铃薯退化的主要原因就是病毒病，是一种传染性病毒。这种病害在田间靠昆虫(主要是蚜虫)或叶片接触而传播。它可以导致植株生理代谢紊乱、活力降低造成大量减产。严重时可减产70%--80%，甚至没有商品产量。目前全世界已发现能侵染马铃薯的病毒有18种，类病毒一种，类茵原体2种。专门寄生在马铃薯上的病毒有9种，国内发现的有7种。这7种病毒分别是马铃薯x病毒(PVX)、马铃薯Y病毒4PVY)、马铃薯S病毒（PVS)、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯奥古巴花叶病毒（PVMA）、马铃薯A病毒(PVA)、马铃喜卷叶病毒(PLRV)。此外，侵染烟草、黄瓜、番茄等的一些病毒也侵染马铃薯。下面分别介绍一下以上几类病毒引发的病症及特点。 1、马铃薯x病毒(PVx) 马铃薯x病毒也叫马铃薯潜隐病毒，由该病毒引起的病叫马铃薯普通花叶病或轻花叶病。是马铃薯病毒中分布范围最广泛的一种。一般减产l0％一25%，依马铃薯品种和病毒株系而异。与Y病毒复合侵染造成皱缩花叶时，减产幅度可达50%以上。x病毒很容易通过汁液传播，在田间可借风、机械、人的走动使植株互相接触发生传毒。根与根或芽与芽的接触也能传毒，种植前切块时切刀可以传毒。蚜虫不能传播此病毒，但一些咀嚼式口器的昆虫能传播此病毒。在发育早期感染此种病毒，病毒会很容易运转到新生块茎中，而在生育后期感染这种病毒，则很可能运转不到新生块茎中去。这种病毒在茎尖脱毒中较难脱掉。 2、马铃薯Y病毒马铃薯Y病毒也称作条斑病毒、条点病毒、沿脉变色病毒、顶端坏死病毒、重花叶病毒。其引起的病害叫做沿脉变色、垂叶条斑、重花叶或皱缩花叶。是引起马铃薯退化的主要病毒，危害范围广泛，能造成50％一80％的减产，尤其与PVx、PVA复合感染时减产幅度更大。由PVY侵染的植株轻的不表现症状，进而表现轻花叶、重花叶、粗缩和皱缩花叶。一些敏感品种叶片背面叶脉坏死形成条斑。还有些品种叶柄及茎上也出现条斑坏死。这种现象称作落叶条斑或垂叶条斑(叶片不脱落，枯死后吊在植株上)。带毒块茎长出的植株，表现矮化，叶片簇拥，变小变脆并皱缩；此种病毒主要由蚜虫传播，也可通过汁液及嫁接等途径传毒。 3、马铃薯卷叶病毒(PLRV) 马铃薯卷叶病毒引起的病害叫马铃薯卷叶病。发病后叶片向上卷曲成筒状，并变硬、革质化，用手摸发出像纸一样的声音。该病毒分布极广，是一种严重的病毒性病害。发病严重时可减产80％以上。不仅影响产量，而且还影响马铃薯品质。当年感病的植株，症状主要表现在顶部叶片上。通常叶片直立，变为白绿色，小叶沿中脉上卷，随病情发展可扩展到老叶。植株晚期侵染可能不表现任何症状，使病害的诊断变得困难。带毒种薯产生的植株表现矮小、直立，底部叶片严重卷曲并变硬、革质化。幼嫩叶子发黄，略卷。感病后块茎横切面有网状坏死。蚜虫是传播卷叶病毒的唯一媒体。其中桃蚜是最有效的传毒介体。蚜

马铃薯病毒检测试剂盒说明书 (1)

马铃薯病毒检测试剂盒说明书 (DAS-ELISA) 一、实验原理马铃薯病毒检测试剂盒是应用血清学检测技术检测马铃薯病毒，利用抗原(病毒颗粒)与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)是最为灵敏的血清学技术之一。二、进行DAS-ELISA实验所需的材料 1. ELISA试剂盒中包括的材料(附录1) 2. 1000 ml烧杯和瓶子各2个(配制洗液PBST、样品提取缓冲液) 3. 10-15ml小烧杯6个(配制酶标溶液) 4. 100ml 烧杯1个(配制底物溶液) 5. 记号笔(标记样品、酶联板) 6. 移液器(最好同时有1道和8道移液器)，吸头 7. 冰箱(4℃和-20℃) 8. 37℃温箱 9. 蒸馏水 10. 吸水纸或高级卫生纸 11. 一个厚壁试管或平底小瓶子(用来研样) 12. 小塑料袋(孵育时用来装酶标板) 三、注意事项 1. 底物有剧毒，如果您的手接触了药片或溶液，用大量的流动水彻底冲洗。 2. 在实验过程中，不能将酶联板裸露在空气中。

3. 各种试剂都添加了NaN3，实验过程中，一定要带手套操作，不能用手直接接触。 4. IgG-AP保存于4℃。四、试验步骤 1.配制溶液 1.1洗液：取出1包PBS缓冲液，溶于1000mL蒸馏水中，然后加入0.5mL Tween20，混合均匀，即为洗液(PBST)。 1.2 样品提取缓冲液：定溶至1000ml，加入0. 5ml Tween20，即为样品提取缓冲液。 1.3阳性对照：将冻干叶片放入取样袋中，加入1ml提取缓冲液，充分研磨，然后4000rpm，离心3min，将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。 1.4阴性对照：将冻干叶片放入取样袋中，加入1ml提取缓冲液，充分研磨，然后4000rpm，离心3min，将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。 2.制样 2.1 将样品(0.1～0.15g)放于塑料袋中，用记号笔标记好。检测叶片时，应选择有症状的，或从植株的顶部、中部和底部各取一片叶子合在一起。 2.2向样品袋中加入1.0～1.5mL提取缓冲液(样品重量：样品提取缓冲液=1：10)，将样品充分研磨。 2.3 将样品袋中的溶液挤到1.5ml的离心管中，4000rpm离心3min，取上清液备用。 2.4将已经包被好酶标板取出，用记号笔在酶标板上标记病毒名称。 2.5向每孔中加入100 uL样品上清液。注意：每个样品用一个Tip头(不能重复使用)。 2.6设置阴性对照孔，加入100 uL阴性对照溶液。 2.7 设置阳性对照孔，加入100 uL阳性对照溶液。

正确认识马铃薯脱毒种薯

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/d09012475.html, 正确认识马铃薯脱毒种薯作者：唐保文来源：《吉林农业·下半月》2013年第08期摘要：本文主要阐述了为什么要进行马铃薯脱毒，如何充分认识马铃薯病毒病给生产带来的危害及要正确认识脱毒马铃薯的增产潜力。关键词：认识；马铃薯；脱毒种薯中图分类号： S532 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2013）-16-43-1 脱毒马铃薯是现代生物技术的产物。目前，马铃薯脱毒种薯越来越被广泛地应用到生产中，并为马铃薯种植者所重视，在马铃薯产业发展中发挥着重要作用。脱毒种薯的推广和应用已经成为马铃薯生产的发展趋势，但还有很大一部分种植者对马铃薯脱毒种薯的优势和潜力的认识及脱毒种薯的应用方面存在误区。针对生产实践中存在的误区，种植者必须从思想观念上正确认识脱毒马铃薯，在马铃薯生产中正确应用脱毒马铃薯，这样才能充分发挥马铃薯脱毒种薯的增产增效优势，从而保障马铃薯的种植效益。 1 正确认识对马铃薯进行脱毒的原因马铃薯是以无性繁殖为主的作物，因为用来繁殖后代的种薯是水分多而且营养丰富的新鲜块茎，因此比其他谷类作物更容易受到病原的侵袭。在马铃薯生产过程中有许多病原侵染的机会，如种薯切块、催芽、播种、田间生长发育、收获、运输和贮藏等。马铃薯生产的这些特点，使其成为易于被各种真菌、细菌、病毒及其类似病原体以及各种害虫侵染的作物。真菌类和细菌类能够通过化学方法防治而解决，危害只在当代表现，病原菌不能积累造成品种退化；而病毒病目前在世界上还没有发现有较成功的化学方法来进行防治，病毒可以通过种薯无性繁殖过程逐代增殖、积累，从而导致品种退化。种植退化的种薯，在田间表现出种植变矮，枝叶丛生，生长势衰退，叶片皱缩，出现花叶、卷叶等现象，地下块茎出现变小、变形，薯皮龟裂等现象，使产量大幅度降低，同时商品性状变差，种植效益降低。马铃薯退化是马铃薯生产上长期普遍存在的问题。如果采用已经退化了的薯块做种，即使给予优良的水肥条件和先进的栽培技术，也不能获得高产。所以，防治马铃薯退化是实现高产的关键措施之一。黑龙江省是马铃薯生产大省，但由于病毒病引起的品种退化问题很长时间限制了黑龙江省各马铃薯生产区的发展，影响着种植者的种植效益，因此进行马铃薯的有效脱毒，并在马铃薯生产中广泛推广使用脱毒种薯，是发展黑龙江省马铃薯生产的关键，同时也是提高马铃薯种植效益的重要手段。 2 正确认识马铃薯病毒病给生产带来的危害

马铃薯病毒病防治方案

马铃薯病毒病防治方案一、症状分析马铃薯病毒病田间表现症状复杂多样，常见的症状类型可归纳如下： (1)花叶型。叶面出现淡绿、黄绿和浓绿相间的斑驳花叶（有轻花叶、重花叶、皱缩花叶和黄斑花叶之分），叶片基本不变小，或变小、皱缩，植株矮化。 (2)卷叶型。叶缘向上卷曲，甚至呈圆筒状，色淡，变硬革质化，有时叶背出现紫红色。 (3)坏死型（或称条斑型）。叶脉、叶柄、茎枝出现褐色坏死斑或连合成条斑，甚至叶片萎垂、枯死或脱落。 (4)丛枝及束顶型。分枝纤细而多，缩节丛生或束顶，叶小花少，明显矮缩。二、发病特点毒源主要来自种薯和野生寄主上，带毒种薯为最主要的初侵染源，种薯调运可将病毒作远距离传播。病薯和病种子(个别)长出的植株一般都有病。在植株生长期间，病毒通过昆虫或汁液等传播，引起再侵染。高温特别是土温高(>25℃)，既有利于传毒蚜虫的繁殖和传毒活动，又会降低薯块的生活力，从而削弱了对病毒的抵抗力，往往容易感病，引起种薯退化。品种间抗病性有差异。三、传播途径以上几种病毒都可通过蚜虫及汁液摩擦传毒。田间管理条件差，蚜虫发生量大发病重。此外，25℃以上高温会降低寄主对病毒的抵抗力，也有利于传毒媒介蚜虫的繁殖、迁飞或传病，从而利于该病扩展，加重受害程度，故一般冷凉山区栽植的马铃薯发病轻。品种抗病性及栽培措施都会影响本病的发生程度。四、农业防治（1）建立无病留种基地(品种基地应建立在冷凉地区，繁殖无病毒或未退化的良种)。（2）采用无毒种薯，各地要建立无毒种薯繁育基地，原种田应设在高纬度或高海拔地区，并通过各种检测方法汰除病薯，推广茎尖组织脱毒，生产田还可通过二季作或夏播获得种薯。（3）一季作地区实行夏播，使块茎在冷凉季节形成，增强对病毒的抵抗力；二季作地区春季用早熟品种，地膜覆盖栽培，早播早收，秋季适当晚播、早收，可减轻发病。（4）改进栽培措施。包括留种田远离茄科菜地;及早拔除病株;实行精耕细作，高垄栽培，及时培土;避免偏施过施氮肥，增施磷钾肥;注意申耕除草;控制秋水，严防大水漫灌。五、使用产品：《奥力克-蔬菜病毒专用》——控制、《病毒2号》——预防

马铃薯的脱毒技术

马铃薯的脱毒技术【摘要】本文遵从马铃薯在我国种植面积广泛包含内蒙古，甘肃，山西，天津等省，以及我国人民的偏爱，同时也出于自己家乡的种植实况，希望对马良书的脱毒技术的深入技术的学习，可以给自己的家乡带来一些实质的技术。特此对马铃薯的需求，退化，脱毒技术进行研究。【关键词】马铃薯退化脱毒马铃薯是我国四大粮食作为之一，目前在我国的栽培面积大约有500多万公顷，已经成为世界上栽培面积最大的国家，但在其繁殖过程中退化问题比较严重，症状是叶片卷缩，产量降低，实验研究表明，病毒浸染是其退化的根源。由于土豆在食品，工业，医药，化工等行业是重要的原料。比如我们常喝的酸奶里面的就加入了土豆变形淀粉作为增稠剂，冰激凌中70%都是土豆粉。在饲料工业中，甲鱼，鳗鱼饲料是漂浮在水中供鱼食用的，而饲料中土豆精淀粉就是最后的黏结剂。包括在造纸业中，土豆淀粉将纤维组织粘结在一起。就连石油钻井也离不开土豆，因为土豆的预糊化淀粉具有抗高温和耐高温和高压的特性，可以做钻井中的稠度稳定剂，能有效的控制泥浆水分的滤失。由此看来马铃薯有很大的发展前景，我们今天就把研究方向放在马铃薯的脱毒技术。我们先通过了解马铃薯的退化和病毒来源来进行“对症下药”。 1.种薯退化原因及病毒传播的途径 1.1种薯退化马铃薯整个生育期均易感染多种病毒病．在我国马铃薯产区危害马铃薯的主要病毒和类病毒有：马铃薯x病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯A病毒(PV A)、马铃薯s病毒(PVS)，还有一种类病毒一马铃薯纺锤块茎类病毒(PSWd)。其中PVY、PLRV、PVX是危害马铃薯最严重的病毒。田间表现使植株矮小。叶片翻卷、花叶、皱缩。马铃薯品种种性退化，品质变劣，甚至失去种用价值，使马铃薯种薯退化。 1.2 种薯退化的危害马铃薯病毒对植株的危害主要是阻碍叶片中叶绿素的合成，破坏叶绿体结构，改变叶型，影响叶片的光合作用和其他功能，导致植株生理代谢紊乱、活性降低，表现出花叶型、卷叶型和皱叶型症状，造成大面积的减产和直接经济损失，其程度最低在10％以上，最高可达90％。在生产中，马铃薯病毒病经常是由多种病毒混合侵染而造成严重减产，如PvY与PVX复合侵染可减产80％左右。据估计，全世界每年马铃薯生产由病毒造成的减产至少为20％，我国种薯退化所引起的产量损失在30％以上。马铃薯种薯的退化问题在我国普遍存在，一般海拔高、地理纬度高、气候冷凉地区或高寒区程度轻而慢，品种的优良种性保持的年限长，故生长上应用的年限也长；而低纬度、低海拔、气温高的平川地区则退化快，且严重，一个好的品种只能种植2—3年，有的甚至仅能种植1年。马铃薯病毒病犹如癌症，一旦感病就终身带毒，无法由药剂防治，必定会造成严重的产量损失和品质降低，经济效益低下，使生产无法进行。解决种薯退化不仅是世

基因工程载体

基因工程课程论文：基因工程载体的探索学号：A09120248 姓名：金文杰班级：生技1203 任课教师：任桂萍

基因工程载体的探索摘要基因工程是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。基因工程载体是基因工程所必需的工具，是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有质粒DNA、病毒DNA、λ噬菌体的衍生物三种主要类型。植物、动物、微生物所用的质粒可能不同，在不同条件下所需的质粒也不同，所选用的质粒按需要选用。在基因操作过程中使用载体有两个用途：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。较常见的几种载体有：质粒pUC19、M13、科斯载体等。关键词：载体、质粒、λ噬菌体、病毒DNA 一、理想载体要求：对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求；能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制，这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点，且每种酶的切位点最好只有一个；容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作；有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。二、常见质粒 1、质粒pUC19最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β-内酰胺环，从而被坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTG(isopropyl-thiogalactoside异丙基-硫代半乳糖苷)和Xgal(5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)时，lacZ ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为α-互补，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色；在lacZ '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lacZ '编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。根据用途可以对质粒进行改造，例如：根据鼠李糖乳杆菌D- ldhD-乳酸脱氢酶基因序列, 设计扩增同源臂 D1和 D2的引物,扩增同源臂D1的引物为 Lr-d1-H和 Lr-d1-X,扩增同源臂 D2的引物为Lr-d2-E和Lr-d2-A。分析载体pU C19-CM和D-ldh基因的序列,分别在引物Lr-d1-H和Lr-d1-X的5’端添加H ind 和Xho酶切位点;在引物 Lr-d2-E和Lr-d2-A 的5端添加 EcoR和Apa酶切位点。利用这2对引物扩增得到的同源臂分别插入到载体pUC19-CMHind和Xho酶切位点、EcoR和Apa酶切位点中,得到自杀质粒 pUC19-CM-D测序确定序列插入的正确性利用引物 Pkd3-cm-1和 Pkd3-cm-2从质粒pKD3上扩增到氯霉素抗性基因CM, 大小为1200bp。质粒 pUC19和基因CM分别经Pst和Sac内切酶处理后连接, 转入大肠杆菌 JM 109中,PCR酶切鉴定及测序结果表明基因 CM 正确插入到质粒 pU C19中, 载体 pU C19-CM 构建成功。由同源臂 D1引物 Lr-d1-H和Lr- d1-X扩增长约为180bp左右的基因片段,由同源臂 D2的引物Lr-d2-E和L r-d2-A 扩增出了约237 bp的基因片段。将2个同源臂片段和 pUC19-CM 载体经酶切处理连接后, 转化至大肠杆菌 JM 109中,PCR酶切鉴

马铃薯 (2)

二、收获及贮藏 (一)收获当植株大部分茎叶枯黄时，块茎很容易与匍甸茎分离，周皮变硬而厚，块茎干物质含量达到最高限度，为食用块茎的最适收获期。种用块茎应提前5一7天收获，以避免低温霜冻危害提高种性。 (二)贮藏 1．块茎在贮藏期间的生理生化变化刚收获的块茎，呼吸作用旺盛，在5—15℃下所产生的热量可达30—50kJ／t·h，如果温度增高或块茎受伤感病等情况下，呼吸强度更高。在贮藏期间块茎水分散发，经过贮藏，块茎约损失重量6.5％一11％左右。新收的块茎，糖分含量很低，休眠结束时显著增高，萌发时由于自身消耗，糖分含量又下降。块茎内淀粉含量在10—15℃下较稳定，10℃以下淀粉含量开始下降，糖分含量逐渐增加，如在0℃下长期贮藏，会引起糖分大量积累使块茎变甜，降低食用品质。 ●微变对人体危害不大。 2．贮藏的基本条件和方法贮藏地点或贮藏窖，要具有通风、防水湿，防冻和防病虫传播的条件。贮藏前将块茎分级和摊晾7—15天，进行“预贮”，使伤口愈合，薯皮紧实，降低呼吸强度。伤口愈合的适宜温度为15—20℃，相对湿度为90％左右。预贮后，剔除愈合不良的伤薯、病薯、畸形薯等，即可进行贮藏。贮藏期间最适宜的温度为1—4℃，最高不得超过7℃。相对湿度以85％一95％为宜。不能见光，以免积累龙葵素。贮藏方法有架藏法、窖藏法两种。 ●吃极少量龙葵素对人体不一定有明显的害处，但是如果一次吃进200毫克龙葵素（约吃30g已变青、发芽的土豆）经过15分钟至3小时就可发病。最早出现的症状是口腔及咽喉部瘙痒，上腹部疼痛，并有恶心、呕吐、腹泻等症状，症状较轻者，

经过1～2小时会通过自身的解毒功能而自愈，如果吃进300～400毫克或更多的龙葵素，则症状会很重，表现为体温升高和反复呕吐而致失水，以及瞳孔放大、怕光、耳鸣、抽搐、呼吸困难、血压下降，极少数人可因呼吸麻痹而死亡。㈢马铃薯的“退化”与病毒病害马铃薯‘退化”，早在16世纪，马铃薯由南美洲引到欧洲时，人们就发现了一种通过种薯世代相传的特殊病态。1676年，英国人安迪松称这种现象为“退化”。从此，围绕所谓退化原因，经过近300年的研究、争论和探讨，终于搞清了所谓“退化”的原因，是由于病毒感染引起的病毒病害。病毒病害一般减产20％一30％，重者减产50％以上。在高纬度、高海拔地区比低纬度、低海拔地区较轻。病毒病害的种类及发病原因种类：马铃薯的病毒病害种类多种，我国常见的有卷叶病是由卷叶病毒(PLRV)引起，花叶病是由马铃薯X病毒(PVX)或马铃薯A病毒(PVA)引起，条斑花叶病是由马铃薯Y病毒(PVY)引起；皱缩花叶病是由马铃薯X病毒和Y病毒复合侵染引起，束顶病是由纺锤块茎类病毒(PSTV)引起。这些病毒通过机械磨擦，蚜虫、叶蝉和土壤线虫等媒介传播侵染。有的是一种病毒单一侵染，有的是两种或多种病毒复合侵染。病毒侵染植株地上部后，逐渐向块茎移动，并在块茎中潜伏和积累，通过无性世代传给后代。原因：温度对传毒媒介(蚜虫等)有明显的影响，据调查，冷凉高海拔地区蚜虫少，而温暖低海拔地区则多；高温能使马铃薯自身的抗病性减弱，高温有利于病毒迅速侵染和复制，加重了发病程度，变温对病毒有抑制作用。此外，栽培和贮藏过程中的其它条件，也影响植株生长和病毒侵染为害程度。在相同条件下，由于品种的抗病耐病能力不同，有感病轻重之别。

马铃薯病毒病

马铃薯病毒病 Potato Viral Diseases 马铃薯病毒病是马铃薯的主要病害。在我国大部分地区发生均十分严重，一般使马铃薯减产20%~50%，严重的达80%以上。过去错误地把这种现象称作种性“退化”。其实，退化现象由病毒引起，温度只是病毒病发生条件之一。感染病毒的马铃薯通过块茎无性繁殖进行世代积累和传递，致使块茎种性变劣，产量不断下降，甚至失去利用价值，不能留种再生产。根据症状表现常常将马铃薯病毒病分为马铃薯花叶病和马铃薯卷叶病两大类。马铃薯花叶病毒病（Potato mosaic virus ,PMV）是由多种病毒单独或复合侵染的一类病害。普遍分布于世界马铃薯种植区，在我国也广为分布，但由于高温降低植株对花叶病毒病的抵抗力，因此以南方发生较为严重。不同病毒单独侵染或复合侵染在不同品种上可引起不同的症状和产量损失。马铃薯卷叶病是一种马铃薯种性退化的主要病害，也是最早发现的马铃薯病毒病，在我国广泛分布，尤其是东北、西北等北方地区，其造成马铃薯产量损失一般为30%~40%，严重时可达80%~90%。马铃薯纺锤块茎病由类病毒（PSTV）引起。1967年，由Dienner和Raymer发现并证实。据报道，马铃薯纺锤块茎病在美国、加拿大、前苏联的马铃薯种植区均有发生；在南非，该类病毒也引起番茄病害。轻型株多于重型株，其比例约为10:1。轻型病株引起严重损失为15%~25%；重型株引起严重症状，造成产量损失可达65%。症状不同病毒单独或复合侵染在不同品种上可引起不同症状。普通花叶病：植株感病后，生长正常，叶片平展，但叶脉间轻花叶，表现为叶肉色泽深浅不一。叶片易见黄绿相间的轻花叶。在某些品种上，高温和低温下都可隐症，受害的块茎不表现症状。但随着马铃薯品种、环境条件及病毒株系的不同而有一定的差异，毒性强的株系也可引起皱缩、条纹、坏死等。重花叶病发病初期，顶部叶片产生斑驳花叶或枯斑，以后叶片两面都可形成明显的黑色坏死斑，并可由叶脉坏死蔓延到叶柄、主茎，形成褐色条斑，使叶片坏死干枯，植株萎蔫。不同品种反应不同，如植株矮小，节间缩短，叶片呈普通花叶状，叶、茎变脆。带毒种薯长出的植株可严重矮化皱缩或出现条纹花叶状，也可隐症。病株薯块变小。皱缩花叶病：病株矮化，叶片小而严重皱缩，花叶症严重，叶尖向下弯曲，叶脉和叶柄及茎上有黑褐色坏死斑，病组织变脆。为害严重时，叶片严重皱缩，自下而上枯死，顶部叶片可见斑驳。病株的薯块较小，亦可有坏死斑。卷叶病：典型的症状是叶缘向上弯曲，病重时成圆筒状。初期表现在植株顶部的幼嫩叶片上，先是褪绿，继而沿中脉向上卷曲，扩展到老叶。叶片小，厚而脆，叶脉硬，叶色淡，叶背面可呈红色或紫红色。病株不同程度的矮化，因韧皮部被破坏，在茎的横切面可见黑点，茎基部和节部更为明显。块茎组织表现导管区的网状坏死斑纹。纺锤块茎病：受害植株分枝少而直立，叶片上举，小而脆，常卷曲。靠近茎部，节间缩短，现蕾时明显看出植株生长迟缓，叶色浅，有时发黄，重病株矮化。块茎变小变长，两端

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