基因工程原理讲义：噬菌体载体与柯斯载体
第七讲噬菌体载体与柯斯载体
中国科学院遗传与发育生物学研究所
2017年8月
目录
一、噬菌体的一般问题
1．何谓噬菌体
2．噬菌体效价测定与双层平板法
3．噬菌体的生命周期
4．噬菌体的溶源生命周期
5．超感染免疫
6．溶源性的诱发
7．Campbell模型
二、λ噬菌体载体
1．λ噬菌体的生物学概述
2．λ噬菌体载体的构建
(1)λ噬菌体载体构建的基本原理
(2)插入型载体
(3)替换型载体
3．λ噬菌体载体的改良
(1)Spi-正选择的λ噬菌体载体
(2)具有内删除特性的λ噬菌体载体4．λ重组体DNA分子的体外包装
(1)λ重组体DNA的转染作用
(2)λ噬菌体的体外包装
5．λ噬菌体DNA的包装限制问题
(1)包装限制的概念
(2)包装限制与λ噬菌体的克隆能力
(3)包装限制的生物学意义
6．λ重组体分子的选择方法
(1)cI基因功能选择法
(2)lacZ基因功能选择法
(3)Spi-选择法
三、柯斯质粒载体
1．柯斯质粒的定义及其构建
(1) 噬菌体的克隆能力
(2)柯斯质粒载体定义
(3)柯斯质粒pHC79的构建
(4)柯斯质粒克隆能力及其组成
2．柯斯质粒载体的特点
3．柯斯质粒载体的改良
4．柯斯克隆
(1)定义
(2)理论依据
(3)柯斯质粒包装条件
(4)柯斯克隆程序
(5)柯斯克隆的优点
5．柯斯克隆的改良
(1)柯斯克隆的局限性及其克服办法
(2)Ish-Horowicz-Burke克隆方案
(3)Bates-Swift克隆方案
基因工程原理
基因工程原理 内容提要 1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括 “切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。 3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为 三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。 4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中 使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。 5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒， 在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。 6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。粘性末端 连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。 7.基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆 片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息。 8.DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变 其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。 9.重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。 10.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大 批生物技术产业。 基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代。基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一，基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。
基因工程简答题总结
基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
基因工程原理练习题及答案
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
基因工程原理与技术思考题
Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母
Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶
《基因工程原理》期末复习思考题教案资料
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
噬菌体的分类
病原微生物名词解释与解答题 噬菌体的分类:毒性噬菌体温和噬菌体 沙门菌肠热证胃肠炎败血症病 毒复制T：吸附穿入脱壳生物合成装配与释放 乙肝颗粒：大小球形颗粒管型颗粒 梅毒分期硬性下疳全身和皮肤黏膜出现梅毒疹皮肤黏膜溃疡性坏死和内脏器官肉芽肿样变（梅毒骝） 细菌的致病性物质:毒素（外神经毒素细胞毒素肠毒素内） 霍乱弧菌致病因子：霍乱肠毒素鞭毛菌毛及其他毒力因子内毒素 细胞壁保护细菌物质交换决定抗原性与致病性染色性药物敏感性有关 真菌培养基沙保弱(G 蛋白胨） 病毒培养法细胞培养鸡胚接种动物接种 AIDS性接触血源性母婴垂直 IMVIC：I吲哚M甲基红VP C枸橼酸盐 病毒自然条件入侵机体呼吸道消化道皮肤黏膜 病毒抗原变异类型抗原漂移抗原性转变 细菌生繁条件水碳源氮源无机盐生长因子（有些）温度：37℃ pH：7.2～7.6 气体：对O2要求(专性需氧菌、微需氧菌、兼专性厌氧菌）对CO2求： 5~10% CO2 渗透压 革兰染色初染媒染脱色复染将细菌涂片标本固定，初染加结晶紫，约一分钟，水洗。滴加碘液媒染，约一分钟，水洗，形成结晶紫—碘复合物，成深紫色。用95 ％酒精脱色，30 秒钟，用水冲净酒精。用稀释复红复染1 分钟，水洗。镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 链球菌所致脓疾病：化脓性感染（淋巴管炎淋巴结炎蜂窝组织炎痈等局部皮肤和皮下组织感染）毒素性疾病（猩红热）超敏反应性疾病（风湿病急性肾小球肾炎）
狂犬病：管理传染源（捕杀野犬多犬预防接种对咬过人的猫犬隔离观察7·10发病处死取脑组织检查病毒抗原和內基小体）伤口处理和注射抗体（用3%·5%肥皂水0.1%苯扎溴铵或清水洗再用75%乙醇或碘酒注射高效价抗狂犬病毒血清于伤口周围与底部）预防接种（咬后和接触病毒危险的人及早接种疫苗） 真原核差异：无典型细胞结构核质无核膜核仁仅核糖体DNA RNA 细菌生长曲线分期定义将一定量的细菌接种于合适的培养基和T 过程有规律数目对数纵T横的曲线a迟缓期（最初准备代谢活跃V大储蓄E 中间代谢产物不繁殖1-4h 对数期（最快先短暂的加速期后对数期活细菌快增细菌形态染色性生理活性典型）稳定期（繁殖减慢死活相等活细菌保持稳定典型小改变代谢产物产生）衰退期（更慢死大于活典型大改变生理活动停滞出现衰退形菌体自溶） 内外毒素差异1（来源阳及部分阴分泌于菌体外或菌体自溶阴细胞壁裂解释放）2化学成分（蛋白质脂多糖）3稳定性（不稳定60死160 2-4h死）3抗原性（强产抗毒素经甲醛脱毒成类毒素4毒性作用强选择性毒害较弱引起发热休克DIC） 病毒感染类型隐性感染（无明显症状获得免疫力显性感染感染靶细胞大量增殖造成细胞结构域功能损伤急性感染持续性感染（慢性感染潜伏感染慢病毒感染） 微生物是存在于自然界的一群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物 消毒消除和杀灭物体上或环境中的病原微生物及其它有害因子，但不一定能杀死全部非病原微生物的方法 灭菌杀死物体上所有微生物的方法，包括杀死芽胞 无菌操作防治病原微生物进入人体或其他物品上的方法 热原质是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质，产生它的dad是阴，其细胞壁的脂多糖是热原质 正常菌群正常下人动物体表及呼吸道消化道泌尿生殖道德微生物种类数量稳定与机体平衡 致病菌少数正常菌在条件下致病 病原菌：少数微生物引起人动植物具有致病性
第一章1-6噬菌体载体2
3、λ噬菌体载体的优缺点：?优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比 质粒转化细菌的效率高。 ?缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 ?用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。 第一章 分子克隆的工具酶和载体?第八节噬菌体载体 ?一、λ噬菌体 ?（一）λ噬菌体 ?（二）λ噬菌体载体的改造 ?（三）λ噬菌体载体举例 （三）λ噬菌体载体举例?Lambda gt10 ?Lambda gt11 ?EMBL3和EMBL4Lambda gt10 概述： ?Lambda gt10是一种插入载体。 ?在噬菌体阻遏基因cI 内有单一的EcoRⅠ克隆位点。用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。 ?该载体克隆效率很高。 ?在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。?克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。 Lambda gt10map 宿主： ?建议用C600 and C600hf1作受体菌。 筛选： ?如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬 菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬 菌斑。反之，若无插入，cI基因表达，噬 菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。 ?核酸探针杂交。
Insertional cloning ?Insertional cloning into the cI gene of the lambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (high frequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI coding sequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloning vector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation. Lambda gt11 ?λgt 载体系列：是插入型载体。插入了大肠 杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，可以表达外源cDNA 而形成β-半乳糖苷酶融合蛋白。?λgt18/19 、λgt20/21和λgt 22/23 是λgt 11的衍生载体。?重组体筛选： ?未重组的噬菌体载体转入lac -宿主后，在X-gal 平板上形成淡蓝色噬斑；而外源DNA 片段插入载体后，重组噬菌体形成无色噬斑，很容易辩别。 ?常常用免疫学方法对噬班或菌落进行筛选。 Lambda gt10 map Lambda gt11 map Lambda gt11 概述： ?Lambda gt11是一个克隆和表达载体。 ?用于小的插入（7.2 kb ）片断构建cDNA 文库或基因文库。 ?在其β-半乳糖苷酶翻译终止位点上游的LacZ 基因内，有单一的EcoR Ⅰ位点。 ?如果外源DNA 的阅读框与lacZ 吻合，即可表达融合蛋白。 ?在构建cDNA 文库时，利用Oligo (dT)或随机引物合成的cDNA 经过EcoR ⅠAdaptors 或Linkers 修饰后，可以和λgt11连接起来。 宿主： ?建议用Y1089(r-) and Y1090(r-)作受体菌。筛选： ?利用特异的抗体进行筛选。 EMBL3和EMBL4 ?EMBL3/4是由λ1059衍生的λ置换型载体。?是常用的基因组克隆载体，克隆的DNA 片 段大小为9-23kb 。 ?多克隆位点分别位于一个14 kb 填充片段的两侧。 ?两载体均在填充片段内含有red 及gam 基因，可由Spi 表现型筛选重组子。 ?除多克隆位点的顺序相反外，EMBL3和EMBL4的其余特征相同。
基因工程原理(徐晋麟) 课件归纳总结要点
第一章基因工程的分子生物学基础 1、基因工程（遗传工程、基因操作、重组DNA技术等）：细胞外用各种方法产 生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。 基因工程诞生的理论基础：①DNA双螺旋模型；②基因是可以转移的；③操作子模型的建立；④遗传密码子的破译。 基因工程的技术基础：①工具酶（DNA连接酶、内切酶、反转录酶）；②PCR 技术；③载体技术；基因转移技术。 2、DNA复制：①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键连接（G-C、 A-T）形成稳定DNA双链分子；②DNA合成的起始需要引物提供3，羟基，DNA聚合酶按照5→3方向合成DNA。 3、限制性内切酶： I类酶II类酶III类酶 酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分 离 二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列 切割位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识 别位点在识别位点下游24-26bp 限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争 限制作用需要需要不需要 限制酶剪切： 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端
结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（①5’突出的黏性末端；②3’突出的黏性末端。） ③平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段 具有平末端。 产生黏性末端的酶： a、同尾酶：一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核 酸内切限制酶。 b、同裂酶：有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列， 这类酶称为同裂酶。 4、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶 ①E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端） 利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物。 ②T4 DNA连接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类。 在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶。 5、核酸的分离纯化：通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶 液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。 细菌DNA的提取：细菌培养物的生长和收集→细胞提取物的制备→从细胞提取物中纯化DNA→DNA取样的浓缩→DNA浓度的测量（A260/A280=1.8）。凝胶电泳：（弱碱性条件）根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 吴乃虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 一、单链噬菌体的一般生物学 1．单链噬菌体的优越性 2．M13噬菌体的生物学特性 二、M13克隆体系 1．M13克隆体系 2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理 3．M13载体系列的发展 4．M13载体系列的优点 三、噬菌体展示载体 1．噬菌体展示载体的构建原理 2．噬菌体展示载体 3．噬菌体表面展示文库 4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例 四、噬菌粒载体
1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒 3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体 一、单链噬菌体一般生物学 大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。 1．单链DNA phage的优越性 A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。 B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。 C．不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。 D．可容易地测出外源DNA的插入取向。 E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)： *1用作双脱氧链终止法进行DNA测序
*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针 *3利用寡核苷酸进行定点突变 2．M13 phage的生物学特性 A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如： ①基因组组织形式相同； ②病毒颗粒大小、形状相近； ③DNA同源性高达98%以上。 B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。 C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要 衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ 蛋白进E.coli细胞内， ↓ 感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用 下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过结构 进行几轮复制。
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
噬菌体载体word版
第三章噬菌体载体 一、填空题 1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。 2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。 3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。它有一个复制起点，进行—-------—向复制。λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。 4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。 5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。 7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。 8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。 9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—， (3)———————————。 10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。 11．M13单链噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即(1)—————(2)—------------—(3)—-------------—。 12．野生型的M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：——------------------和——-----------------。 13．以丸噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA的长度是不同的，前者为—----— kb，后者为————kb。
λ噬菌体载体
λ噬菌体载体 λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。 是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。 一．λ噬菌体的分子生物学概述 （1）λ噬菌体基因组的结构 在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos 位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。 在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。
（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。 （3）λ噬菌体DNA的整合与删除 λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。 （4）λ噬菌体DNA的转录与转译 在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。 二．λ噬菌体载体的构建及其主要类型 （1）构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。 按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型： 一种是插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点(如图)。 另一种是替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。
基因工程原理复习重点
1. 基因家族（Gene family） 又叫多基因家族（Multigene family），系指同一生物体中，从同一祖先基因经过复制、突变而来的一组具有相似的核苷酸序列结构、相似产物、相似功能的基因群体。从广义上讲，同一基因家族的各个成员也可看作是重复基因。但两者相比，基因家族不同成员之间的序列差异毕竟要比重复序列的大一些，也就是说序列一致性程度还是较低一些。 2. 基因簇（Gene cluster） 系指原核生物基因组中，由不同的或相关的一组相邻基因组成的一种特殊的排列组合方式。 3.基因家族与基因簇二者的区别 属于同一多基因家族的各个成员，可以存在于不同的染色体上，也可以是存在于同一条染色体上。同一基因家族成员的判断标准：a．多重性；b．紧密的连锁性；c. 核苷酸序列同源性； d. 相关的表型与功能。 基因簇的特点： a．同一基因簇的不同成员，在遗传上往往是紧密连锁的； b．同一基因簇的不同成员，可以是同属于同一个操纵子的不同结构基因，也可以是属于不同操纵子的不同结构基因。 c．同一基因簇的不同成员，可以是来自同一基因家族的不同成员，也可以是来自不同基因家族的不同成员。 4. 基因图（Gene map）：是描述染色体或DNA大分子上，不同基因的排列顺序及其间隔距离的一种线性图。 5. 基因作图（Gene mapping）：按照遗传学的方法或者是物理学的方法绘制基因图的过程，叫做基因作图。基因作图有时也叫做基因定位。它涉及如下两个具体的内容： a.其一是确定被研究的目的基因与细胞染色体之间的关系，也就是说将目的基因定位在某条特定的染色体分子上。 b.其二是测定目的基因与所在染色体的其它基因之间的间隔距离，以及它们之间的线性排列顺序，亦即是确定目的基因在染色体上的位置。 基因图包括遗传图和物理图两种。两者之间的本质差别在于前者表示的是以重组率为单位的基因间的相对距离，而后者表示的是以碱基对（bp）为单位的基因间的实际距离。 6.基因增加(Gene addition)：与基因扩增概念不同，它是通过将一种或一群外源基因导入受体细胞，从而使受体细胞中基因种类增加，用以观察并研究其功能作用的一种基因工程策略。 7.基因扩增(Gene amplification):特指基因拷贝数增加的过程，包括如下5种不同情况： ①在体外，应用PCR技术和适当的引物，可使特定基因的拷贝数得到成功的扩增。②克隆，将基因插入到高拷贝数的质粒分子上，于是在体内情况下该基因的拷贝数也变的相应富裕起来。 ③一些外界环境的压力因素可以使真核细胞产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因发生明显扩增。例如，高剂量的氨甲喋呤可导致二氨叶酸还原酶基因发生扩增。④程序基因扩增。包括全基因组扩增和选择性扩增两种模式。前者是指通过增加细胞基因组的拷贝数，而使特定基因的拷贝数得以增加；后者是指因特定发育需要而偶尔增加对其产物需求量高的基因的拷贝数。例如，非洲爪蟾在发育过程中rRNA基因的扩增。⑤进化扩增，在生物进化过程中发生基因加倍和扩增，结果使相关的基因在基因组上聚集成簇。
基因工程原理
基因工程原理 1、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？（20分） 重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转 化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养， 获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 2、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或 小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？ （2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？ （20分） (1)其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低， 及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 (2)出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。 3、获得一个功能未知的基因克隆后，怎样研究该基因的功能？请提出具体的 研究方案。（20分） 基因功能的研究思路主要包括: 1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱; 2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP 等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白)
第四节 单链丝状噬菌体载体
第四节单链丝状噬菌体载体 一、M13 噬菌体的生物学 1．M13 噬菌体的组成和结构 M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为 V00604）。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ 和基因Ⅲ 以及基因Ⅱ 和基因Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ 和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因Ⅱ 至基因Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。 M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的α螺旋蛋白。顶端由 5 个基因Ⅶ 和 5 个基因Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因Ⅲ 蛋白和5 个基因Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。 2．M13 噬菌体的增殖 吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。