Chelex 100法提取脱落细胞检材DNA的实时定量研究
?技术交流?
刑事技术2009年第5期
Chelex 2100法提取脱落细胞检材DNA 的实时定量研究
杨 电1,2,刘 超2,徐曲毅2,胡慧英2 (11南方医科大学基因工程研究所,广州 510515;2.广东省广州市刑事科学技术研
究所,510030)
摘要: 目的 研究脱落细胞检材DNA 检验的简便有效的提取方法。方法 对76份包括帽子、眼镜、牙刷、剃须刀、梳子、口香糖、羊水在内的7种脱落细胞检材采用Chelex 2100法提取DNA ,在AB I7500型荧光定量PCR 仪上进行定量,同时用Identifiler 复合扩增系统扩增,在ABI3130遗传分析仪上进行STR 分型。结果 从帽子(头套)中获得的脱落细胞DNA 平均含量为8131ng ,眼镜擦拭物上获得的脱落细胞DNA 平均含量为6120ng ,牙刷上获得的脱落细胞DNA 平均含量为49140ng ,剃须刀擦拭物上获得的脱落细胞DNA 平均含量为6192ng 、梳子擦拭物上获得的的脱落细胞DNA 平均含量为10168ng ,口香糖的脱落细胞DNA 平均含量为16130ng ,羊水的脱落细胞DNA 平均含量为320ng 。以上76份检材性别及10个以上STR 位点分型成功率为7518%。结论 从帽子、眼镜、牙刷、剃须刀、梳子、口香糖、羊水等检材提取的脱落细胞可用Chelex 2100法提取DNA 作STR 分型。
关键词: 脱落细胞;Chelex 2100法;DNA 定量;复合STR 扩增
中图分类号:DF79512 文献标识码:A 文章编号:100823650(2009)0520030202
基金项目:公安部应用创新计划资助项目(2005YYCX57136);广东省重点科技项目(2005B33701008)
作者简介:杨电(1969—
),女,广东大埔人,副主任法医师,在职硕士研究生,从事法医DNA 检验与研究工作。
Tel :020*********
Real time quantificational st udy of DNA ext racted by Chelex 2100from epit helial cells samples YAN G Dian ,L IU Chao ,XU Qu 2yi ,et al.(S outhern Medical Universit y ,Guangz hou 510515China )
ABSTRACT :Objective To seek simple and effective method of DNA extraction f rom epithelial cells samples.Methods 76
DNA samples of epithelial cells extracted by Chelex 2100method were quantitated by ABI 7500Real Time System and typed with Identifiler system in ABI 3130G enetic Analyzer.R esults The average DNA contents of different epithelial cells samples were put as the following respectively :headgear (8131ng ),glass (6120ng ),toothbrush (49140ng ),shaver (6192ng ),comb (10168ng ),chewing gum (16130ng ),amniotic fluid (320ng )。These samples that Amelogenin and above 10STR loci were typing successf ully were 7518%.Conclusion
The epithelial cells samples DNA extracted by Chelex 2100method can be typed successf ully.
KEY WOR DS :
epithelial cells ;Chelex 2100method ;DNA quantitation ;multiplex STR Amplification 脱落细胞检材的DNA 检验在实际检案工作中具有非常重要的意义。近年来,已有许多对脱落细胞检材进行DNA 检验的报道,但较少有报道对这类检材进行DNA 定量并结合STR 分型效果进行分析研究[1～3]。作者对日常案件中遇到的76份包括帽子(头套)、眼镜、牙刷、剃须刀、梳子、口香糖、羊水等7种脱落细胞检材采用Chelex 2100法提取DNA ,在定量PCR 仪上进行DNA 定量,同时用Identifiler 复合扩增系统在遗传分析仪上对这些DNA 样品进行STR 分型,并作分析讨论,旨在为提高这类生物检材的STR 检验成功率提供参考。
1 材料与方法111 样本
2006年至今广州市刑事科学技术研究所受理的
实际案件中提取的帽子(或头套)8顶,眼镜6副,牙刷29把,剃须刀10把,梳子4把,口香糖15份,羊水4份。112 方法
11211 样本DNA 提取 帽子(或头套):4顶帽子采
用二步擦拭法提取。即:用纯水湿润的细头棉签(购自公安部物证鉴定中心)反复擦拭可能与皮肤接触的部位,然后用干的棉签再擦拭一遍,将两次擦拭的棉
签剪入同一离心管中,加入约60μl 20%Chelex 2100提取DNA
[1]
;3顶帽子、1个头套采用脱落细胞提取
仪(购自公安部物证鉴定中心)吸取帽内脱落细胞[2],剪下滤膜的第二层,加入200μl Chelex 2100、2μl 20mg/ml 蛋白酶K 处理。眼镜、剃须刀、梳子:采用
二步擦拭法擦拭可能与皮肤接触的部位,加入60
μl ?
03?
刑事技术2009年第5期
Chelex2100和2μl20mg/ml蛋白酶K。牙刷:用手术刀片从距离刷毛根部约2mm处切取3～4束刷毛,加500μl纯水浸泡10min左右,震荡5～10s,离心10 000r×3min,吸去上清,加入约150μl Chelex2100和2μl20mg/ml蛋白酶K(以刷毛完全被浸泡在液体中为度)。口香糖:切取约5mm×2mm大小,加入200μl Chelex2100和2μl20mg/ml蛋白酶K。羊水:取015ml羊水,离心10000r×4min,去上清,沉淀加200μl Chelex2100。
所有样品均56℃保温1h,震荡5～10s,然后98～100℃保温10min,震荡5～10s后,离心10000r×4min,上清即为制备的DNA溶液。11212 定量PCR反应 按Quantifiler法医人类DNA定量试剂盒(AB公司,美国)使用手册[4]在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行定量PCR反应。11213 复合STR检测分型 用Identifiler TM K it (AB公司,美国)进行复合扩增,扩增体系8μl[5],在ABI3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳检测分型。以获得性别及10个以上STR基因座明确分型为成功,分析扩增效果。
2 结果和讨论
Chelex2100法提取的76份7种脱落细胞检材的DNA定量结果及10个以上STR位点分型成功情况见表1,总的STR分型成功率达7518%。
表1176 份脱落细胞检材DNA定量结果及10个以上STR位点分型成功情况
帽子(头套)眼镜牙刷剃须刀梳子口香糖羊水例数8629104154
DNA浓度范围(ng/μl)01046～0150901042～014780103～01690104～0133401155～0127301016～1131018～5110 DNA含量范围(ng)2130～401721125～141342142～11012214～151087175～131651167～176160～1020平均DNA含量(ng)813161201714061921016849140320
检出10个以上STR基因座例数642362134
帽子、头套内遗留有头皮屑、头发等生物成分。对于头发,可单独处理。帽子、头套为吸附性载体,其中粘附的脱落细胞较难擦拭,采用“二步擦拭法”提取的皮肤脱落细胞DNA含量较少。4例帽子用该法提取后采用小体系Chelex2100处理,获得的DNA浓度最高为012ng/μl,低为未测出,只有2例成功获得STR分型。1例未测出DNA浓度、STR分型失败的帽子后来采用脱落细胞提取仪提取帽内脱落细胞,因尘土较多,取第二层采用DNA IQ系统提取DNA[6],成功获得性别及15个STR基因座的分型。3例帽子、1例头套采用脱落细胞提取仪吸取帽内脱落细胞,将较少杂质的第二层滤膜剪下加入200μl Chelex2100处理后,测得DNA浓度低者为01230ng/μl,高者达01509ng/μl,取2μl模板量扩增均成功获得STR分型。
7种脱落细胞检材中,从眼镜中提取的脱落细胞平均DNA含量最低。为提高眼镜中脱落细胞DNA的STR检验成功率,提取眼镜时应注意避免触碰镜架与皮肤接触的部位,采用塑料袋包装送检,以减少镜架上粘附的脱落细胞在提取送检过程中因摩擦蹭落。
牙刷中残留的口腔脱落细胞的DNA含量差异非常悬殊,29份牙刷样本中,DNA含量高者较含量低者相差近50倍。这除了与使用者使用牙刷的习惯等个人原因有关外,还与样本是否及时检验及提取送检方式密切相关。牙膏中含有摩擦剂、洗涤泡沫剂等可能抑制PCR的物质。牙膏在刷毛根部容易有残留,因此切取刷毛时从距离刷毛根部约2mm处切取,避免沾上牙膏,消化前用纯水浸泡洗涤,如泡沫较多则适当增加洗涤次数,可降低残留牙膏对PCR的影响、提高STR检验成功率。
人们使用剃须刀后,一般只对剃须刀的表层进行清洁,内层往往残留较多的胡须碎屑和皮屑。
所以提取剃须刀上的皮肤脱落细胞,不仅需擦拭剃须刀与皮肤的接触面,还应擦拭剃须刀的内层。作者检验了10把剃须刀,除4把锈蚀较严重、测得的DNA浓度非常低不能成功进行DNA分型外,其余6把均成功进行了STR分型。
梳子作为个人物品,其专一性不如牙刷、剃须刀、眼镜甚至帽子。作者检验了4把梳子,虽然测得的DNA浓度不低,但只有2把检出主要是单人的基因型,另2把检出无法判读的混合基因型。作者成功检验的6顶帽子(头套)、4副眼镜、23把牙刷、6把剃须刀中,只有1顶帽子和1个头套检出混合基因型,其余37份样品均检出单人的基因型。这说明案件中提取个人物品进行DNA检验时,应优先提取牙刷、剃须刀等专一性强的物品,而梳子不宜作为优先提取的对象。
口香糖一般经反复咀嚼,检材中含有大量的口腔脱落细胞。用Chelex2100提取,注意勿取检材太多,一般情况下采用本文中的方法以1μl模板量均可成功进行STR分型。口香糖的胶基不影响PCR,因此无需特别的处理。但一些盗窃案中,疑犯将嚼过的口香糖塞入锁孔中作案,口香糖被机油、铁锈污染,单纯用Chelex2100法提取,(下转第34页)
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于Y2STR,因此建立一个适合法医学应用的多态性高、稳定性好的Y2SN Ps复合检测体系需要更多的Y2 SN Ps位点,实验难度大,且在实验过程中存在检测步骤繁琐、耗时长、过于敏感等,可能会得到假阳性、阴性结果,因此要想在法医学领域取代Y2STR需要在许多方面进一步完善。
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收稿日期:2009203204
(上接第31页)
获得的DNA浓度和STR检验成功率非常低,这推测是由于PCR抑制物质太多,采用磁珠法或有机法进一步纯化后可提高STR检验成功率。
羊水由绒毛膜分泌产生,含有大量的胎儿脱落细胞。抽取羊水进行细胞学检查是诊断某些先天性疾病的重要手段。DNA定量结果表明,羊水脱落细胞DNA含量较高,从015ml羊水样本中提取的DNA 含量低为160ng,高达1020ng,这说明抽取羊水进行DNA检验时,量不必取太多,取015ml就足够。
Chelex2100法提取DNA,操作简单快速,整个提取过程均在一个离心管中进行,避免了DNA在提取过程中的损耗,因此几乎适用于法医实践中遇到的所有生物检材。对于微量脱落细胞检材,采用小体系Chelex2100法提取,然后取1～2μl模板量扩增往往是简便有效的方法。但由于Chelex2100法提取的DNA溶液中杂质较多,污染严重的脱落细胞检材单纯采用Chelex2100法难以获得满意的检验结果,进一步结合其它纯化方法如磁珠法、有机法可获得较高的STR检验成功率[7]。
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