RNA干扰在植物中的作用机理及其应用研究进展

西北植物学报，２００８，２８（９）：１９２０一１９２７

ＡｃｔａＢｏｔ．Ｂｏｒｅａｌ．－Ｏｃｃｉｄｅｎｔ．Ｓｉｎ．

文章编号：１０００—４０２５（２００８）０９—１９２０－０８

ＲＮＡ干扰在植物中的作用机理及其应用研究进展

马超，郝青南，马兵钢

（石河子大学农学院，新疆石河子８３２００３）

摘要：ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）是广泛存在于生物中的一种现象，它是小干扰ＲＮＡ诱导的转录后基因沉默，是生物抵抗异常ＤＮＡ的一种保护机制，同时在生物生长发育过程巾调控基因的表达。本文综述了近年来有关ＲＮＡ干扰的发现、作用过程及其机理，分析了它与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶的不同，并介绍了ＲＮＡ干扰在植物基因功能、植物抗病毒、作物品种改良等方面的应用，为ｓｉＲＮＡ干扰的进一步利用提供参考资料。

关键词：ＲＮＡ干扰；ｓｉＲＮＡＴ扰；植物病毒

中图分类号：Ｑ７８９文献标识码：Ａ

ＴｈｅＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＲＮＡＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎＰｌａｎｔ

ＭＡＣｈａｏ，ＨＡｏＱｉｎｇ—ｎａｎ，ＭＡＢｉｎｇ—ｇａｎｇ。

（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ，Ｘｉｎｊｉｉａｎｇ８３２００３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｉＳａｎｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｃｏｍｍｏｎｌｙｅｘｉｓｔｅｄｉｎｏｒｇａｎｉｓｍｓ．ＩｔｉＳｏｎｅｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｏｒｇａｎｉｓｍｓｅｌｆ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｄｅｆｅｎｄｉｎｇａｂｎｏｒｍａｌＤＮＡ．Ｉｔｃｏｕｌｄａｌｓｏｒｅｇｕｌａｔｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｉｓａｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｉｎ—ｄｕｃｅｄｂｙｓｍａｌＩｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）．ＴｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅｓｅｙｅａｒｓ．Ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ｒｉｂｏｚｙｍｅａｎｄｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｉＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ｓｉＲＮＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｐｌａｎｔｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔ－ａｎｃｅａｎｄｃｒｏｐｑｕａｌｉｔｙｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｗｅｒｅａｌｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｐｌａｎｔｖｉｒｕｓ

ＲＮＡ干扰是２０世纪９０年代被人们发现的一种生物新技术。１９９０年在进行转基因植物有关研究时偶然发现，将全长或部分基因导人植物细胞后可抑制一些内源性基因不表达，如：梨ＡＣＣ氧化酶基因…、百合ＡＣＯ基因【２０等，但这些基因的转录并无任何影响，并将这种现象称为基因转录后沉默（ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）Ｌ引。近年来的研究表明，一些小的双链ＲＮＡ可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使ｍＲＮＡ降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，由于这是一种在ＲＮＡ水平的基因表达抑制，故也称为ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡｉ，也译作ＲＮＡ干预或者干扰）。

ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）现象最初在线虫中发现，后在多种生物中也同时被发现。当外源或内源性的双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）导入细胞中，与ｄｓＲＮＡ同源的ｍＲ—ＮＡ会被降解，因而其相应的基因受到抑制。这种

收稿日期；２００８—０４—０３；修改稿收到日期：２００８—０８—１３

基金项目：国家自然科学基金项目（３０４６００８１）；新疆自治区高校科研计划（ＸＪＥＤＵ２００５Ｓ１５）；石河子大学青年骨干教师资助项目（ＮＸ０１０１２）

作者简介：马超（１９８３一），男，在读硕士，主要研究方向为园艺植物种质资源及生物技术。Ｅ?ｍａｉｌ：ｍｃｈｊｌｌｌ＠１２６．ｃｏｒｎ

＊通讯作者：马兵钢，博士，副教授．硕士生导师，主要从事园艺植物种质资源及生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｂｇ＿ａｇｒ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

９期马超，等：ＲＮＡ干扰在植物中的作用机理及其应用研究进展

转录后基因沉默机制首先在线虫中得以证实［７］。随后发现，在多种生物如：果蝇¨Ｊ、拟南芥菜‘５｜、小鼠‘６］等均发现存在ｄｓＲＮＡ介导的ＲＮＡｉ现象，表明ＲＮＡｉ可能是生物中普遍存在的在ＲＮＡ水平上调节基因表达的方式。ＲＮＡｉ的发现掀起了ｄｓＲＮＡ介导的基因沉默作用（ｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔ）分子机制及其生物学功能研究的热潮，ＲＮＡｉ技术正在成为ＲＮＡ研究领域的热点。１

ＲＮＡ干扰的作用机理

１．１

ＲＮＡｉ的发现

１９９８年，Ｆｉｒｅ等［７３发现双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）能够特异性地阻断与其高度同源的基因的表达后，ＲＮＡｉ就引起了植物学家的重视。同年Ｗａｔｅｒ—ｈｏｕｓｅ等凹３就在植物中插入可以形成发夹结构的转录本的转基因的重复序列，发现它可以有效地触发基因沉默。之后Ｋａｌａｎｔｉｄｉｓ等［９１将双链干扰ＲＮＡ导人烟草中，成功地获得了抗病毒植株。越来越多的实验研究证明ＲＮＡｉ作用可以有效地降解靶序列，引起基因沉默。

１．２

ｓｉＲＮＡ是ＲＮＡｉ的中间效应分子

近年来研究发现，长的双链ＲＮＡ在类似于

ＲＮａｓｅｌｎ的Ｄｉｃｅｒ酶作用下，通过核酸内切作用，以ＡＴＰ依赖的方式在胞浆中断裂生成２１～２３个核苷酸（ｎｔ）的特殊双链ＲＮＡ分子，由于其为ＲＮＡｉ的触发物，故称干扰性小ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ

ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ

ＲＮＡ，或ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓ，ｓｉＲＮＡ），它是

ＲＮＡ干扰作用（ＲＮＡｉ）赖以发生的重要中间效应分子，即ｓｉＲＮＡ的序列与所作用的靶ｔｕＲＮＡ序列具

有同源性［１引。研究表明，在长链ＲＮＡ被切割成ｓｉＲＮＡ的过程中Ｄｉｃｅｒ酶起关键作用１１１］。长的ｄｓＲＮＡ可以在体外经化学方法合成，经喂饲或显微注射的方式进入细胞，再经Ｄｉｃｅｒ切割产生ｓｉＲＮＡ；也可在体外转录ｓｉＲＮＡ再转染细胞；也可构建质粒，或经逆转录病毒载体或腺病毒载体在体内转录生成ｓｉＲＮＡ。

Ｄｉｃｅｒ酶是一种核酸内切酶，属于ＲＮａｓｅＩｌｌ酶家族的成员之一。Ｄｉｃｅｒ酶的作用模式如图１【１２３所示，从图１中可以看出ＰＡＺ结构域首先识别双链ＲＮＡ分子３’端突出的两个单链碱基，起锚定作用，ｄｓＲＢＤ结构域识别并结合双链ＲＮＡ分子５７端，与ＰＡＺ结构域联合固定Ｄｉｃｅｒ酶，最后在ＲＮａｓｅｌｎ活性域的作用下切割双链ＲＮＡ分子成ｓｉＲＮＡ分子。ｓｉＲＮＡ是ＲＮＡＩ的效应物，两条单链末端具有５’磷酸基团和３’末端具有２个核苷酸突出的非配对的碱基。这种结构对于ｓｉＲＮＡ有效的引发ＲＮＡｉ反应是相当重要的。Ｅｌｂａｓｈｉｒ等¨３１的研究显示，把大小为２ｌ～２３个碱基对的ｓｉＲＮＡ加入细胞裂解液的系统，能有效的降低细胞浆中的ｔｕＲＮＡ。为了证明ｓｉＲＮＡ就是ＲＮＡ干扰中的直接中介物，Ｔｏｍａｒｉ等［１们用ＲＮＡ内切酶处理果蝇细胞内与目标基因，发现只有同源的双链ＲＮＡ才能有效的降解ｔｕＲＮＡ。

研究表明，双链ｓｉＲＮＡ形成后与一种蛋白复合物相结合，这种蛋白复合物含有一个ｓｉＲＮＡ和一个蛋白核酸酶分子，在ｓｉＲＮＡ的指导下，蛋白复合物形成了一种有活性的ＲＮＡ诱导的基因沉默复合体

ＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇ

ｃｏｍｐｌｅｘ），然后ＲＩＳＣ

中的ｓｉＲＮＡｒＪＩ导沉默复合物识别靶向同源ｍＲＮＡ，

图１

Ｄｃｉｅｒ酶作用模式ｕ２３

Ｆｉｇ．１

Ｍｏｄｅｌｏｆｄｉｃｅｒ

ｃｏｍｐｌｅｘ［１２］

西北植物学报２８卷

接着ＲＮＡ解旋酶完成靶向ｍＲＮＡ与ｓｉＲＮＡ正义链换位，在少量ＡＴＰ参与的情况下ＲＮａｓｅ在距离ｓｉＲＮＡ３’端１２个ｎｔ处切割靶ｍＲＮＡ，并使其降解，从而达到转录后基因沉默（ＰＴＧＳ）的结果［１引。哺乳动物中的ＲＮＡｉ主要以ＲＩＳＣ为主，但植物中的ＲＮＡｉ还以另外一种形式进行，即ＲＮＡ依赖型ＲＮＡ聚合酶ＲｄＲＰ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒ—ａｓｅ）Ｄ６３。在ＲｄＲｐ介导的沉默中：首先被导入的ｄｓＲＮＡ直接与目标ｍＲＮＡ形成双链，然后在Ｄｉｃｅｒ作用下形成ｓｉＲＮＡ，再进一步以ｓｉＲＮＡ的反义链为引物，目标ｍＲＮＡ为模板，在ＲｄＲＰ作用下发生类似ＰＣＲ反应，形成新的ｄｓＲＮＡ，新形成的ｄｓＲ—ＮＡ被Ｄｉｃｅｒ再次切割形成ｓｉＲＮＡ，达到干扰目的基因表达的效果（１川，如图２［１８１所示。

图２ＲＩＳＣ与ＲｄＲｐ作用模式‘”３Ｆｉｇ．２ＭｏｄｅｌｏｆＲＩＳＣａｎｄＲｄＲｐＥｌ８］

１．３ｓｉＲＮＡ干扰的放大效应

冯斗等ｃｌ钉在研究ＲＮＡ干扰机制时发现，很少量的ＲＮＡｉ片段就可以获得高效的干扰效果，期间存在高效的扩增机制，才使少量的双链ＲＮＡ分子就足以在相当长的时问内稳定地降解持续表达的目标基因ｍＲＮＡ分子。现在大多学者认为ｓｉＲＮＡ能通过细胞内的ＲＮＡ依赖型ＲＮＡ聚合酶ＲｄＲＰ的作用，以ＲＮＡ干扰起源的双链ＲＮＡ分子，或者一目标ｍＲＮＡ分子作为模板，合成新的双链ＲＮＡ分子，再通过Ｄｉｃｅｒ的加工作用，产生出大量的ｓｉＲ－ＮＡ，以补充细胞内消耗和降解的ｓｉＲＮＡ分子，这样反复进行，达到高效的抑制作用，这种现象就是ｓｉＲ－ＮＡ干扰的放大效应，也称为ｓｉＲＮＡ的扩增，产生的新的ｓｉＲＮＡ称为二级ｓｉＲＮＡ分子［２１｜。Ｓｉｊｅｎ等［２３１在研究ＲｄＲｐ参与ＲＮＡ干扰时发现，设计用来沉默ＧＦＰ—ＬａｃＺ融合基因ｓｉＲＮＡ在经过Ｄｉｃｅｒ切割后产生的二级ｓｉＲＮＡ不仅能切割降解ＬａｃＺｍＲ－ＮＡ，还能降解ＧＦＰｍＲＮＡ，说明经过ＲｄＲｐ的机制扩增后，ｓｉＲＮＡ不仅在数量上大大增加了，而且其沉默的目标ｍＲＮＡ谱也广了，也就是说经过ＲｄＲｐ的机制产生的二级ｓｉＲＮＡ与最初设计投入细胞的初级ｓｉＲＮＡ存在差异。在植物体内，通过ＲｄＲｐ扩增的ｓｉＲＮＡ不仅在同一个细胞内维持基因沉默效应，这些小分子ＲＮＡ还能通过细胞内的运输通道送到植物体的其它细胞内，执行基因沉默功能，把ｓｉＲＮＡ的功能扩展到整个植物体内伽］。许多研究表明，在发生ＲＮＡ沉默的细胞裂解液中存在作用不同的２１～２３ｎｔ的ｓｉＲＮＡ和２４～２６ｎｔ的ｓｉＲＮＡ，而且普遍认为２１～２３ｎｔ的ｓｉＲＮＡ能够进行短距离的信号传导［２引。Ｈｉｍｂｅｒ等瞳们研究不仅证明了上面的观点，而且发现在ＲＮＡ沉默启动后２１～２３ｎｔ的ｓｉＲＮＡ独自移动的距离为１０～１５个细胞，而２４～２６ｎｔ的ｓｉＲＮＡ很可能参与长距离的干扰信号的传导，其机理可能是２４～２６ｎｔ的ｓｉＲＮＡ在侵染的组织中合成后，作为一种韧皮部特定的信号分子引起新生叶导管中产生２１～２３ｎｔ的ｓｉＲＮＡ，随后，细

胞中的沉默将独立进行。

９期马超，等：ＲＮＡ干扰在植物中的作用机理及其应用研究进展

２ｓｉＲＮＡ干扰与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶的作用机制比较

反义寡核苷酸主要指根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成的一类反义脱氧核糖核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯＤＮ），以互补的核酸链能够形成双股螺旋的原理为基础，利用反义基因转录的反义ＲＮＡ来抑制目标性状中靶基因的表达，阻断ＲＮＡ加工处理和翻译，进而达到修饰目标性状的目的［２…。ｓｉＲＮＡ干扰与反义寡核苷酸技术有许多不同，第一，二者的作用位点不同，反义寡核苷酸技术作用于ＤＮＡ链起始密码子上游第２５个脱氧核糖核酸，而ｓｉＲＮＡ作用于ｍＲＮＡ起始密码子下游７０个碱基后的核糖核酸序列［２１｜。第二，ＲＮＡｉ技术中ｓｉＲＮＡ序列选择余地大，可以用于研究单基因功能或基因家族或具有高度相似性的一组基因中的单个基因的功能，如Ｍｉｋｉ等［２５］将水稻ＯｓＲａｃ基因家族的７个成员通过ＲＮＡ干涉技术分别被特异抑制，把基因家族成员的３’非翻译区作为反向重复序列构建ＲＮＡ干涉载体，结果３个成员被高效抑制。第三，ｓｉＲＮＡ干扰具有放大效应，对目标基因的沉默效应很高，而反义寡核苷酸对目标基因的沉默效应较低，且没有放大效应［２引。Ｓｏｏ等［２７３在烟草中通过转入反义的ＡＣＣ合成酶（ＣＡＳ）和ＡＣＣ氧化酶（ＣＡＯ），阻遏了乙烯的生物合成途径，使腺苷甲硫氨酸流向多胺合成途径，增强了转化株抗非生物胁迫的耐受力。

核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ，Ｒｚ）是一类具有催化活性的单链ＲＮＡ分子（ｃａｔａｌｙｔｉｃｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄＲＮＡ），能通过Ｗａｔｓｏｎ—Ｃｒｉｃｋ碱基配对与靶ＲＮＡ结合并在特定的位点特异性剪切靶ＲＮＡ，同时兼具反义抑制效果。Ｐｒｚｙｂｉｌｓｋｉ等心胡研究发现设计的锤头型核酶序列，在Ｍ９２＋的参与下对拟南芥植物的特定基因有抑制作用，但核酶序列的抑制作用不是横向转移的，而是通过一种独立的未知途径进行。关于核酶的ＲＮＡ干扰作用的途径有待进一步的研究。

脱氧核酶（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＤＲｚ）是近年来发现的一类具有催化活性的单链ＤＮＡ分子（ｃａｔａｌｙｔｉｃ

ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡ）。ＤＲｚ剪切靶ＲＮＡ的机制与Ｒｚ相似，即通过和靶ＲＮＡ结合并使之由Ａ型构象

向Ｂ型构象转变，在一些二价金属离子（Ｍ９２＋）的协助下，使剪切位点处的２，＿ＯＨ去质子化并对邻近的磷酸基发生亲核攻击，通过两步转酯反应而使靶ＲＮＡ分子裂解［２９｜。脱氧核酶在动物和人体上的应用很多，如Ｈｏｕ等［３０］针对ＨＢＶＣ基因ｍＲＮＡ设计的脱氧核酶体外剪切效率达１．１×１０９?ｔｏｏｌ－１?ｍｌ’ｎ～。Ｌｉａｎｇ等［３１］设计的脱氧核酶能够有效抑制ｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ，并且有时间和剂量依赖性，能够明显地促进凋亡，抑制胰腺癌细胞株ＰＡＮＣ一１的增殖。脱氧核酶在植物上的应用还不多见，但它仍然有其优点。研究表明，ＤＲｚ是ＤＮＡ片断，故而比较稳定，而且分子量小，易于人工合成，成本也较低，另外脱氧核酶具有与一般药物相似的动力学特点，对靶ＲＮＡ水平的抑制程度及时间容易控制［３２｜。尽管脱氧核酶可以有效地降低细胞内靶ｍＲＮＡ的浓度，但同其它基因灭活因子一样，存在如何有效地进入细胞并准确的在细胞内定位、以及如何对抗核酸酶降解等直接影响脱氧核酶催化效率的问题ｒ３３｜。

总之ｓｉＲＮＡ具有不同于上述单链分子的独特的双链结构，ｓｉＲＮＡ的反义链和正义链对介导ＲＮＡ干扰均是必需的，但正义链所起的作用尚不明确。ｓｉＲＮＡ必须在有关协同因子如核酸酶Ｄｉｃｅｒ、ＲｄＲｐ、解旋酶、激酶等存在的条件下才能有效介导靶ＲＮＡ的裂解，仅仅有ｓｉＲＮＡ而缺乏这些协同作用因子是不能诱导ＲＮＡｉ效应的，人工合成的ｓｉＲ—ＮＡ导入靶细胞后，必须通过模拟天然ｓｉＲＮＡ在细胞内的处理进程才能最终发挥作用，而且ｓｉＲＮＡ介导的ＲＮＡｉ具有一定的可遗传性［３¨。

３ＲＮＡ干扰的应用

在研究生物体早期发育时通常以抑制特定基因的表达来研究该基因在生物体生长发育中的作用。ＲＮＡ干扰作为一种反向遗传学的研究方法，为后基因组时代的基因功能分析提供了一种可靠而又快速的应用技术平台。

３．１植物基因功能研究中的应用

自２００１年《Ｎａｔｕｒｅ》首家报道在哺乳动物培养细胞中通过ｓｉＲＮＡ成功诱导了特异性靶基因表达沉默后，ＲＮＡ干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具应用于低等生物高等动植物领域∞引。在水稻和拟南芥的基因组测序完成后，人们获得了众多的候选基因，ＲＮＡｉ为注释和认识这些基因对植物体的作用提供了一种快速、高效的鉴定方法。由于拟南芥是目前植物基因组资源研究最深入的植物种类，所以ＲＮＡｉ技术在植物功能基因组中的研究主要体现在拟南芥功能基因组的研究上。Ｃｈｕａｎｇ等［３６３用ＲＮＡｉ技术证实了ＡＧ、ＣＩ。Ｖ３、ＡＰＩ、ＰＡＮ基因在拟南芥花的发育过程中所起的作

西北植物学报２８卷

用。Ｓｅｎｔｈｉｌｋｕｍａｒ等口７１通过ＲＮＡｉ技术发现２个ＶＨＡ—ｃ一基因一ＶＨＡ—ｃ１和ＶＨＡ—Ｃ２，他们在拟南芥生长中通过主动胞外分泌向细胞供给ＵＡＰＴａｓｅ，支持扩增细胞的生长。Ｆｒａｎｋｉｓｈ［３８１在Ａｒ—ａｂｉｄｏｐｓｉｓｓｕｅｃｉｃａ中使用ＲＮＡｉ的方法证实了通过合理没计双链ＲＮＡ就可以有效地使一个基因家族沉默。在其它植物中ＲＮＡ十扰的应用也很广泛。Ｓｅｎｔｈｉｌ等［３叩用ＲＮＡｉ技术分析了异黄铜合成酶基因在大豆子叶及根部的作用效果及其对异黄铜积累的影响，证实ＲＮＡｉ对大豆子叶中ＩＦＳ基因的功能分析有效。Ｆｕｋｕｓａｋｉ等【４叩通过利用ＲＮＡｉ技术成功地诱导查尔酮合成酶一花青素和类黄酮生物合成中的一种关键酶基因沉默，使花的颜色由原来的蓝色变为白色或苍白色。最近ＭｃＧｉｎｎｉｓ等［４¨设计由ＲＮＡ干扰减少目的基因表达的反向重复定位的短基因片段，并将此基因片段导人玉米愈伤组织中，筛选得到了稳定遗传的转基因系。因此，ＲＮＡｉ作为基因功能研究的重要技术，具有简单、快捷、高通量的特点，可以快速获得单一基因差异的转基因植株，对植物基因功能的研究很有益处。

３．２植物抗病毒研究中的应用

利用ＲＮＡ干扰技术的原理可设计合成与病毒同源的ｄｓＲＮＡ，并将其导入植物体，由于植物体的ＲＮＡ干扰机制对病毒基因组进行特异性切割降解，阻止病毒的复制扩张，从而保护植物体不受病毒危害Ｌ４２｜。自从１９８６年Ｐｏｗｅｌｌ—Ａｂｅｌ等［４３］首次将烟草花叶病毒（ＴＭＶ）的衣壳蛋白（ＣＰ）基因导人烟草，获得抗ＴＭＶ侵染的转基因烟草以来，很多研究人员将病毒的不同基因序列导入植物均获得抗病毒植株。Ｍａ等ｎ４】根据抗水稻矮缩病毒序列，构建了与其相关的ＲＮＡ干扰序列，导入水稻中，发现对水稻矮缩病毒有很高的抗性。赵明敏等ｎ５１以烟草花叶病毒（Ｔｏｂｓｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）外壳蛋白基因为靶位，设计合成ｓｉＲＮＡ，通过农杆菌介导的方法导人烟草中，瞬时表达的结果表明设计的干扰序列对ＴＭＶ有明显的抑制作用。此外，同源于ＴＭＶ外壳单边的ｓｉＲＮＡ瞬时表达对非同源的黄瓜花叶病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）没有抑制作用，这表明ｓｉＲＮＡ干扰作用具有高度的同源依赖性。另外，Ａｎｄｉｋａ等【４６１证实ＲＮＡｉ诱导的抗甜菜坏死黄色叶病毒（Ｂｅｅｔｎｅｃｒｏｔｉｃｙｅｌｌｏｗｖｅｉｎｖｉｒｕｓ，ＢＮＹＶＶ）在叶中比根部有效。虽然利用ｓｉＲＮＡ干扰技术对抵抗植物病毒有一定的作用，但是最近的研究发现病毒中含有能编码抑制植物对病毒ＲＮＡ

干扰的蛋白质，目前人们还不清楚其机制，这些沉默抑制蛋白在对沉默的抑制方面各具特点，但对ｓｉＲ—ＮＡ干扰都有一定的抑制作用［４川。如Ｖａｒｑａｓｏｎ等［４８］发现Ｐ１９蛋白（一类由番茄丛矮病毒科病毒编码的蛋白质，分子质量为１９ｋＤ）可以特异性的结合２１～２５ｎｔ的ｓｉＲＮＡ形成复合物，阻止ＲＩＳＣ的形成从而降低参与到ＲＮＡ干扰中或扩散至其它组织引发ＲＮＡ干扰的ｄｓＲＮＡ的数量，使沉默作用不能维持，结果导致沉默抑制效应。

３．３作物品种改良中的应用

长期以来人们都采用常规育种的方法改良作物的品质，常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功，但育种年限长，并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料，而利用ＲＮＡ沉默技术，可操作基因的范围和突变的种类扩大了，而且对目的基因的表达有了可控性¨引。王洲［５叩构建了两个抑制矮牵牛查尔酮合成酶（ＣＨＳ）基因表达的ＲＮＡ干扰载体ｐＢｌｌ２１－ＣＨＳ，并用基因枪转化和农杆菌介导的遗传转化方法转入矮牵牛植株中，发现其对矮牵牛花色产生部分干扰效应。李加瑞等ｆ５１１利用ＲＮＡ沉默技术进行小麦淀粉品质改良的研究，使颗粒结合型淀粉合成酶（Ｇｒａｎｕｌｅ－ｂｏｕｎｄｓｔａｒｃｈｓｙｎ—ｔｈａｓｅＩ，ｗＡＸＹ）基因沉默，得到了直链淀粉含量明显下降的植株。张银波等［５２１利用ＲＴ—ＰＣＲ技术克隆到了油菜ＰＥＰ基因片段，并构建了对应于ＰＥＰａｓｅ基因的ＲＮＡｉ载体，用ＲＮＡｉ技术抑制油菜ＰＥＰａｓｅ基因的表达，使代谢流偏向油脂合成，从而提高油菜籽粒中的油脂含量。对ｓｉＲＮＡ干扰在番茄中的应用研究较多，Ｄａｖｕｌｕｒｉ等［５３３利用一个果实特异启动子在番茄中沉默内源的光形态发生调控基因ＤＥＴｌ，提高了类胡萝卜素和类黄酮含量，但却不影响野生型的其它特性；Ｘｉｏｎｇ等∞刈人根据ＡＣＣ氧化酶基因的序列，利用ＲＴ—ＰＣＲ技术，设计出ｓｉＲＮＡ干扰结构，通过遗传转化，６９％的转化植株表现出１００％的ＲＮＡ干扰效果，番茄果实从破色期到成熟期需要１２０ｄ；１８％的植株表现出５０％干扰效果，果实从破色期到成熟期需要３０ｄ，而对照果实从破色期到成熟期只需５ｄ。万群等［５朝根据番茄红素环化酶基因序列构建了ｓｉＲＮＡ干扰结构，将其导人番茄中，发现转基因番茄果实中番茄红素含量均比对照高，番茄红素的平均含量是对照的２．１倍，其中１号转基因番茄果实中番茄红素含量增加最多，是对照的２．６倍。从以上成果可以看出，利用ＲＮＡ干扰技术可以有效地提高或抑制直目的

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基因的表达，这对作物品质改良有非常积极的意义，且育种年限短，对年改良作物品种十分有益。

４结语

作为生物界普遍存在的机制之一，ＲＮＡ干扰技术在维持基因组稳定，防御外来遗传物质入侵，调控基因表达等方面起着重要作用。随着对ＲＮＡ干扰认识的逐步深入，ＲＮＡｉ机制的进一步阐明，以及ＲＮＡ干扰技术的日臻完善，为深入了解植物与病毒之间的互作关系提供了有力的理论依据。ＲＮＡｉ技术已经作为一种新的技术方法，在各个生物研究领域内广泛应用并取得了很多重要成果，因此ＲＮＡｉ为大规模高效而复杂的功能基因组学研究提供了一个便捷的平台，也是植物遗传改良的有力工具。此外，ＲＮＡｉ技术将可能成为研究细胞信号传递途径与基因治疗的新途径之一。但是，ＲＮＡｉ作为一项新兴的分子生物学技术，其发展仅数年时间，大多数研究是在细胞水平进行，ＲＮＡｉ技术对整个生物体的影响仍不明确，对作用于不同靶位ＲＮＡｉ的效应存在差异的机制。因此，ＲＮＡｉ技术的安全性和稳定性等问题仍有待进一步深入研究。

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ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆｖａｃｕｏｌａｒＨ＋一ＡＴＰａｓｅｓｕｂｕｎｉｔｃ

ｇｅｎｅｓ

ｉｎｔｉｓ—ｓｕｅｓａｃｔｉｖｅｉｎｍｅｍｂｒａｎｅｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇａｎｄｔｈｅｉｒｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙＲＮＡｉＥＪ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ０１．，２００４，１３４（４）：１５１４—１５２６．ＦＲＡＮＫｌＳＨＨ．ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍｕｓｅｓＲＮＡｉｔｏｕｎｃｏｖｅｒｇｅｎｅ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，２００３，３６１：５８４—５８４．

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ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ０．９０４６中国野生植物资源０．５８５１３热带及亚热带植物学报０．８１８７植物分类学报０．３６７１４注；资料来源于中国科学技术信息研究所２００７年版《中国期刊引证报告》（扩刊版），科学技术文献出版社。

（襞阿卫提供）

RNA干扰在植物中的作用机理及其应用研究进展

作者：马超， 郝青南， 马兵钢， MA Chao， HAO Qing-nan， MA Bing-gang

作者单位：石河子大学农学院,新疆石河子,832003

刊名：

西北植物学报

英文刊名：ACTA BOTANICA BOREALI-OCCIDENTALIA SINICA

年，卷(期)：2008，28(9)

被引用次数：2次

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相似文献(10条)

1.学位论文游牧siRNA干扰Bmi-1对膀胱癌5637细胞增殖抑制作用的研究2009

目的：Bmi-1作为一种原癌基因，它的高表达是肿瘤发生和产生耐药性的重要原因之一。因此，利用RNA干扰技术，通过抑制原癌基因的表达，达到促进肿瘤细胞凋亡的目的，是目前正积极探索的一条新的肿瘤治疗途径。本研究通过构建反义Bmi-1的质粒并转染膀胱癌5637细胞，使其产生的反义mRNA封闭膀胱癌5637细胞中Bmi-1的表达，以观察其对膀胱癌5637细胞生长的抑制作用以及对膀胱癌5637细胞株生物学性质的影响，从而探讨反义Bmi-

1抑制膀胱癌5637细胞增殖的作用机理，为膀胱癌的治疗提供新的思路。

方法：1.根据siRNA的设计原则、载体的酶切位点、promage公司在线siRNA设计程序以及GenBank中Bmi-1的编码序列，合成针对。Bmi-1核心编码区的寡聚核苷酸片段，并将靶位点的序列、阴性对照的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列同源的序列，设计合成相应的小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）。

2.与pGeneClipTM质粒退火连接，构建针对Bmi-1的siRNA重组质粒pshRNA-Bmi-1及阴性对照的重组质粒pshRNA-错配。

4.在体外转染中利用脂质体将重组质粒导入膀胱癌5637细胞中。

5.用MTT法检测RNA干扰对膀胱癌5637细胞活力的影响并确定最佳反应条件。

6.利用RT-PCR检测Bmi-1的mRSA转录水平的变化。

7.倒置显微镜下观察膀胱癌5637细胞形态的改变。

结果：

1.经电泳确证针对Bmi-1基因的shRNA重组质粒pshRNA-Bmi-1及阴性对照的重组质粒pshRNA-错配构建成功。

2.转化感受态细胞成功后生成大量重组质粒克隆

3. siRNA干扰Bmi-1基因导致bmi-1基因表达明显减少、细胞凋亡并显著抑制肿瘤细胞的生长。MTT法可见空转染组及pshRNA-错配对膀胱癌5637细胞细胞无显著抑制作用（P>0.05），两组pshRNA-Bmi-1对膀胱癌5637细胞均有明显的抑制作用（P<0.05）；确定阳性处理组半数致死浓度为：1×10-

8mmol/L，时间为48小时；两组阳性处理组间抑制率无明显差别（P>0.05）；阳性处理组中膀胱癌5637细胞生长均呈不同程度地减慢，随着时间的延长，抑制率增加，随着浓度的增加，抑制率也得到增加，表现为细胞生长受到siRNA浓度及时间的双重影响；

4. RT-PCR后通过图处理软件分析条带的灰度值，可见正常对照组、空白对照组与两组阳性处理组（加入siRNA1组及加入siRNA2组）之间的灰度值比较具有显著统计学意义（P<0.05），而正常对照组、空白对照组、阴性处理组（加入siRNA1-错配1）、阴性处理组（加入siRNA2-错配2）几组灰度值未见明显改变（P>0.05）；

5.倒置显微镜下可见正常对照组、空白对照组、阴性对照组膀胱癌5637细胞细胞体外生长活跃，而阳性处理组则细胞生长缓慢。

结论：

1.构建的两组重组质粒pshRNA-Bmi-1均能够有效地作用于膀胱癌5637细胞，克服了合成RNA成本高费用大、转染率低的缺点，更有利于RNAi技术的推广和应用。

2.生物学活性实验证明，siRNA干扰后Bmi-1基因表达明显降低并显著抑制细胞的生长。同时验证了Bmi-1基因的RNA干扰在进行抗肿瘤的治疗中有潜在的应用前景。

2.学位论文陈琳siRNA干扰survivin基因对K562细胞分化及化疗敏感性的研究2008

目的：应用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制survivin基因的表达，观察重组质粒对K562细胞分化及化疗敏感性的影响并探讨其机制，为临床白血病治疗提供理论依据。

方法：

1.转染survivin重组质粒对K562细胞survivin mRNA和蛋白表达的影响。实验分三组：RNAi组、脂质体组、空白组。经阳离子脂质体介导的方式进行转染。转染48小时后RT-PCR检测survivinmRNA表达情况，免疫组织化学法检测survivin蛋白表达。

2、重组质粒对K562细胞分化影响。实验分三组：RNAi组、脂质体组、空白组。转染48小时后用光学显微镜检查细胞的形态变化，RT-PCR方法检测c-myc、c-fos mRNA表达情况，免疫组织化学法检测c-myc、c-fos蛋白表达，流式细胞仪检测细胞表面分子CD1

3、CD33表达情况。

3、阿霉素对K562细胞的抑制作用。实验分两组：RNAi组、空白组。用MTT法测定不同浓度的阿霉素对各组K562细胞的抑制率，根据其对K562细胞的抑制情况选择浓度为0.2ug/ul的阿霉素作用于各组细胞，1小时后流式细胞仪检测各组细胞内阿霉素的荧光强度。流式细胞仪检测各组细胞内阿霉素的荧光强度。

4、K562细胞耐药机制研究。实验分三组：RNAi组、脂质体组、空白组。免疫组织化学法检测各组细胞p-gp、GST-π、TOPOII三种耐药蛋白的表达水平。

结果：

1、survivin mRNA和survivin蛋白在K562细胞中呈高表达，转染重组质粒后survivin表达下调(p＜0.05)，而脂质体组及空白组无明显变化。

2、RNA干扰组K562细胞转染48小时后细胞形态学出现改变， CD33表达下降(P＜0.05)，CD13的表达较对照组无明显改变。

3、转染48小时后RNA干扰组细胞c-myc mRNA及蛋白表达较两对照组降低(p＜0.05)，c-fos mRNA及蛋白与对照组相比表达无明显改变(P＞0.05)。

4、阿霉素对K562细胞的抑制作用呈浓度依赖性，浓度越大抑制作用越强。RNA干扰组K562细胞对阿霉素敏感性较对照组增高(P＜0.05)，RNA干扰组细胞内阿霉素平均荧光强度为120.71，较两对照组明显增高(P＜0.05)。

5、RNA干扰组K562细胞耐药蛋白GST-π表达下降(P＜0.05)。

结论：

1、重组质粒pshRNA-survivin可下调K562细胞survivin mRNA和蛋白表达。

2、survivin基因与K562细胞的分化有关，但诱导其向粒系分化可能性小。

3、RNA干扰survivin基因可增加K562细胞对阿霉素的敏感性。

4、RNA干扰survivin基因可能通过降低耐药蛋白GST-π的表达增加K562细胞对阿霉素的敏感性。

3.期刊论文欧阳溪.陈俊霞.何晓燕.褚颖豪.夏俊RI基因siRNA干扰质粒的构建及其对人膀胱癌细胞迁移和侵袭能

力的影响-中国生物制品学杂志2009,22(5)

目的 构建核糖核酸酶抑制因子(RI)基因siRNA干扰质粒,并检测其对人膀胱癌细胞BIU-87迁移和侵袭能力的影响.方法 设计并构建针对RI基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体和1个无同源性的阴性对照载体,经酶切和DNA测序鉴定后,转染BIU-87细胞,通过RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测干扰的有效性.光镜及HE染色观察细胞形态的改变,黏附试验、划痕试验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构.结果 酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性siRNA表达载体的BIU-87细胞RI蛋白的表达水平明显降低,对照组未发生明显改变;转染干扰质粒的细胞堆叠严重,细胞黏附能力显著降低,迁移和侵袭能力显著提高,细胞骨架微丝聚集,伸展出片状伪足.结论 已成功构建RI基因siRNA干扰质粒,其可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,说明RI可作为抑制肿瘤迁移和侵袭的有效靶点.

4.期刊论文王齐全.魏小斌.郑健超.Qi-Quan Wang.Xiao-Bin Wei.Jian-Chao Zheng siRNA干扰Slug基因表达对胰

腺癌BxPC-3细胞放射敏感性的影响-世界华人消化杂志2009,17(11)

目的:探讨siRNA干扰Slug基因表达对BxPC-3细胞γ射线敏感性的影响.方法:制备携带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的siRNA-Slug质粒载体,用脂质体转染法将siRNA-Slug(实验组)、pGCL-GFP(阴性对照)导入BxPC-3细胞(空白对照组),G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆.将转染载体的BxPC-3阳性克隆细胞和未转染载体的BxPC-3细胞采用60Co γ射线对其进行照射3Gy.RT-PCR和Western blot检测不同组细胞经γ射线后的Slug、PUMA表达

,MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果:实验组细胞内Slug基因被有效沉默;实验组细胞内PUMA蛋白和PUMA mRNA的相对值明显高于对照组(0.98±0.15 vs 0.32±0.08,1.03±0.16 vs 0.38±0.08,均P<0.05).实验组细胞生长抑制率和凋亡率分别高于对照组(37.46%±9.63% vs

2.13%±0.12%,32.4%±9.5% vs

3.47%±0.18%,均P<0.05).实验组细胞受到γ射线作用后,PUMA mRNA和PUMA蛋白表达明显增加,分别为1.26±0.18和

1.23±0.18,生长抑制率和凋亡率增加,分别为78.4%±18.5%和73.3%±17.4%,与射线作用的对照组和阴性对照组比,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论:siRNA干扰Slug基因后,解除Slug对PUMA基因的抑制,增强BxPC-3对γ射线的敏感性.

5.期刊论文凌晖.朱亚平.刘芳.李艳兰.文玲.苏琦.LING Hui.ZHU Ya-ping.LIU Fang.Li Yan-lan.WEN Ling.SU Qi

siRNA干扰Chk1抑制人胃癌BGC823细胞增殖的实验研究-中国癌症杂志2010,20(7)

背景与目的:细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)与肿瘤的关系及其在肿瘤发生、发展及治疗中的作用是目前研究的热点.为探索Chk1在人类肿瘤细胞中对生长增殖活性和细胞周期的调控作用,本研究旨在观察SiRNA干扰Chk1基因对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响.方法:采用RNAi技术抑制BGC823细胞中Chk1表达,采用Western blot检测转染前后Chk1蛋白表达情况,实验分为未转染组、脂质体组和Chk1 siRNA转染组三组.然后采用MTT法和流式细胞术分析Chk1基因沉默对人胃癌BGC823细胞生长及周期的影响.结果:Western blot检测结果显示,Chk1 siRNA转染24 h后,BGC823细胞中Chk1蛋白相对灰度值为0.11±0.08,明显弱于未转染对照组的0.66±0.21和脂质体转染组的0.70±0.25(P＜0.05),而未转染对照组和脂质体转染组之间比

增殖活性下降,其增殖抑制率为48.1%(P＜0.05).FCM法检测结果显示,Chk1基因沉默后细胞周期在G0/G1期发生停滞,未转染组24和48 h后细胞在G0/G1期为48.3%和50.2%,转染Chk1 siRNA组细胞在转染24和48 h后G0/G1期增加至63.9%和66.1%,增殖指数(PI)由51.7%(24 h)和49.8%(48 h)减少至36.2%(24 h)和34.4%(48 h).结论:Chk1 siRNA转染可明显抑制人胃癌细胞增殖,且其抑制增殖作用与诱导G0/G1期阻滞有关.

6.期刊论文张敏.黄晓燕.周希.施翔翔.黄芳.张怀勤.杨德业.ZHANG Min.HUANG Xiao-yan.ZHOU Xi.SHI Xiang-xiang.HUANG Fang.ZHANG Huai-qin.YANG De-ye siRNA干扰SLC7a8对NRK-52E细胞摄取左旋多巴的影响-中国病理

生理杂志2010,26(3)

目的:通过RNA干扰(RNAi)技术选择性下调高血压相关基因SLC7a8的表达,探讨对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)摄取左旋多巴的影响.方法:设计并合成3个针对大鼠SLC7a8基因的特异性siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),以含非特异性编码序列的siRNA-con为对照.将上述3个片段及阴性对照通过阳离子脂质体法转染至NRK-52E内,通过流式细胞仪估算转染效率后经RT-PCR初步筛选高效率干扰片段,用Western blotting检测蛋白水平的干扰效率,采用紫外分光光度法检测空白对照组(blank)、siRNA-con转染组和SLC7a8基因特异性沉默组不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120 min) NRK-52E内左旋多巴的浓度.结果:流式细胞仪测定siRNA转染NRK-52E效率为94%,RT-PCR初步筛选结果显示siRNA-1、3干扰效率较高,Western blotting检测显示siRNA-3组在蛋白水平的干扰效率较高,而对照组siRNA-con与空白对照组(blank)的SLC7a8 表达差异不明显.通过紫外分光光度法检测NRK-52E对左旋多巴的吸收结果显示干扰组不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120 min)细胞内左旋多巴浓度均低于siRNA-con转染组和空白对照组;对照组siRNA-con与空白对照组相比则无明显差异.结论:RNA干扰技术能选择性下调大鼠肾小管上皮细胞SLC7a8的表达水平;SLC7a8基因特异沉默后NRK-52E对左旋多巴的摄取在各个不同时点(6、12、24、36、48、60、72、120 min)均降低.

7.学位论文陈正荣siRNA干扰VEGF-C表达抑制胃癌淋巴生成的实验研究2007

目的：在体外，应用RNA干扰(RNAi)的方法抑制胃腺癌细胞株SGC7901淋巴内皮生长因子-C(VEGF-C)的表达，探讨其抑制SGC7901细胞VEGF-C表达的有效性，并筛选有效的小干扰RNA(siRNA)；建立BALB/c裸鼠SGC7901皮下移植瘤模型，在体内，研究瘤内注射siRNA抑制VEGF-C表达能否导致胃癌生长受抑和胃癌淋巴管生成受抑。

方法：体外实验：设计并化学合成siRNA，并通过非变性凝胶电泳(PAGE)纯化；脂质体介导siRNA转染胃腺癌细胞株SGC7901，观察细胞形态变化，并四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖；荧光素6-Fam标记的siRNA转染SGC7901细胞，荧光显微镜观察并计算siRNA转染SGC7901细胞的效率；半定量RT-PCR检测不同siRNA实验分组细胞VEGF-C mRNA水平变化；半定量RT-PCR和Western blot法检测经VEGF-C小干扰RNA(VEGF-CsiRNA)干预后SGC7901细胞随时间变化mRNA和蛋白水平的变化。体内实验：裸鼠皮下注射SGC7901细胞构建胃癌皮下移植瘤模型24只，随机分为4组为：siRNA脂质体混合液注射组、单脂质体注射组、单siRNA注射组和PBS注射组，当肿瘤直径达0.5cm，即进行VEGF-CsiRNA瘤内注射，每隔6天注射一次，共注射3次，随后记录各实验组肿瘤体积变化，免疫组织化学法检测各实验组肿瘤组织VEGF--C的表达，并通过抗人CD31和LYVE-1单克隆抗体检测瘤体内血管和淋巴管生成情况。

结果：体外实验：脂质体介导siRNA体外转染SGC7901细胞，VEGF-CsiRNA转染组出现细胞生长减慢，但MTT结果显示未转染组、单用脂质体组和转染VEGF-CsiRNA干扰组细胞凋亡情况无明显差异(P>0.05)；6-Fam标记的siRNA和GAPDHsiRNA分别转染SGC7901，显示siRNA在工作浓度为100mmol/L转染效率最优化，其转染效率为37.1％±3.0％，内源性基因GAPDHmRNA下调为未转染组的的65.5％±3-3％；半定量RT-PCR筛选结果显示No.1VEGF-CsiRNA为有效的敲减VEGF-C表达的小干扰RNA，使VEGF-CmRNA下调为对照组的52.5％±2.6％，且在转染后48h左右出现VEGFmRNA的敲减高峰，VEGF-CmRNA水平下调为对照组的43.5％；Western blot检测显示VEGF-C蛋白的表达下调为对照组的32.7％±1.1％，且在转染72h后出现VEGF-C蛋白的敲减高峰，蛋白水平下调为对照组的18.9％。体内实验：VEGF-CsiRNA干扰组较对照组肿瘤生长明显减慢(P<0.001)，siRNA加用脂质体干扰组和单用siRNA干扰组肿瘤生长无明显差别(P>0.05)。免疫组化抗人VEGF-C单抗检测干扰组肿瘤细胞VEGF--C染色减弱，和对照组相比VEGF--C表达下调68.3％(P<0.01)，同时抗人LYVE-1单抗免疫组化染色表明胃癌组织中淋巴生成减少，干扰组LND值为3.2±1.3，而对照组为9.8±2.7，VEGF-CsiRNA干扰组IND值下降至对照组的

32.7％(P<0.01)，而干扰组和对照组的MVD值无明显差异(P>0.05)。

结论：本实验筛选的siRNA能有效抑制胃癌细胞的VEGF-C基因mRNA和蛋白水平的表达，在体外干扰VEGF-C的表达，能使细胞出现生长减慢但不能使细胞发生凋亡。在胃癌动物模型中，瘤内注射VEGF-CsiRNA能显著下调肿瘤组织内VEGF-C的表达，抑制胃癌皮下瘤生长，同时抑制瘤内淋巴管生成，而对肿瘤血管生成无影响。提示下调VEGF-C表达能抑制胃癌淋巴生成。

8.学位论文徐永芳SiRNA干扰对宫颈癌HELA细胞株VEGF表达的影响2007

背景和目的：肿瘤发生与进展和血管生成密切相关。血管内皮生长因子等促血管生产因子是血管生成的强烈刺激剂。RNA干扰自被发现以来成为研究基因功能的强大工具。本研究主要探讨血管内皮生长因子(VEGF)SiRNA干扰对宫颈癌Hela细胞株VEGF的影响。

方法：从基因库中搜索出人VEGF的mRNA链6条(NM001025366．1、NM001025367．1、NM001025368．1、NM001025369．1、NM001025370．1、

NM003376．4)，以其同源的CDS部分设计并合成VEGF SiRNA 1、2、3号链，为检验有无非特异性干扰同时合成阴性对照(Negative controlduplex)链，体外脂质体介导转染宫颈癌Hela细胞株，半定量RT-PCR及Westernblot分析转染效果。

结果：转染VEGF SiRNAI、2号链后，RT-PCR显示宫颈癌Hela细胞株VEGFmRNA表达较空白和阴性对照组明显下降，VEGF蛋白水平下降不明显。

结论：RNM存在于Hela细胞中，对VEGF有特异的干扰作用。

9.期刊论文赵环宇.张维铭.陈锦飞.ZHAO Huanyu.ZHANG Weiming.CHEN Jinfei siRNA干扰STAT3基因对食管癌Eca-

109细胞生物学特性的影响-中国肿瘤临床2009,36(24)

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3信号传导通路对人食管癌Eca-109细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法:针对人STAT3基因mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,将其连入pRNAT-U6.1/neo质粒中,构建STAT3-siRNA表达载体,稳定转染人食管癌Eca-109细胞,利用RT-PCR、Western blot技术分别检测转染细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,MTT实验、流式细胞技术检测转染细胞的增殖、细胞周期和凋亡变化情况.结果:成功构建STAT3-siRNA表达载体,经测序鉴定正确.RT-PCR和Western blot结果显示,STAT3-siRNA3表达载体明显抑制了人食管癌Eca-109细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).MTT实验显示,稳定转染siRNA后,siRNA3实验组细胞的增殖能力明显下降,细胞生长抑制卒为

35.68%,较对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞技术显示,siRNA3实验组出现了细胞周期阻滞和细胞凋亡,细胞周期阻滞于G_0/G_1期,细胞凋亡率为13.26%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);结论:RNA干扰技术沉默STAT3基因可以有效地抑制STAT3基因的表达,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖,引起细胞周期G_0/G_1期阻滞,促进其凋亡.

10.学位论文赵宗刚siRNA干扰人肝癌细胞株HepG2生存素表达的实验研究2007

本研究分为三个部分：

第一部分肝癌组织中survivin蛋白、PCNA的表达及其与预后的关系

目的：探讨人肝癌组织中survivin蛋白及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及其与预后的关系。

方法：应用免疫组织化学染色方法对46例原发性肝癌组织中survivin蛋白与PCNA的表达情况进行检测，并结合临床预后进行分析。

结论：survivin蛋白对促进肝癌细胞快速增殖具有重要作用，survivin蛋白的表达情况可以作为判断肝癌病人预后的重要指标。

第二部分RNA干扰对肝癌细胞survivin基因表达及细胞凋亡的影响

目的：探讨将survivin基因特异性小干扰性RaNA(small interfering RNA，siRNA)转染肝癌细胞hepG2对survivin基因表达及细胞凋亡的影响。

方法：将体外合成的survivin特异性的siRNA序列1、序列2和对照序列，通过Lipofectamin2000分组转染肝癌细胞hepG2，应用RT-PCR及Westcrn印迹方法检测肝癌细胞survivin mRNA和蛋白的变化，应用MTT法及流式细胞技术评价其对体外培养肝癌细胞增殖和凋亡的影响。

结论：Survivin基因特异性siRNA转染hepG2细胞可抑制survivin mRNA和survivin蛋白的表达，并可体外抑制肝癌细胞增殖，诱导肝癌细胞凋亡的发生。

第三部分：RNA干扰Survivin基因联合顺铂对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的：探讨将survivin基因特异性小干扰性RNA(small interfering RNA，siRNA)转染肝癌细胞hepG2同时联合应用顺铂对survivin基因表达及细胞凋亡的影响。

方法：将体外合成的survivin特异性的siRNA序列和对照序列，通过Lipofectamin2000分组转染肝癌细胞hepG2，24小时后再加入顺铂。应用RT-PCR及Westem印迹方法检测肝癌细胞survivin mRNA和蛋白的变化，应用MTT法及流式细胞技术评价其对肝癌细胞体外增殖和凋亡的影响。

结论：Survivin特异性siRNA转染肝癌细胞可抑制survivin mRNA和survivin蛋白的表达，顺铂对肝癌细胞hepG2的survivin基因表达并无影响，在体外抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡方面survivin特异性的siRNA和顺铂具有协同作用。

引证文献(1条)

1.马超.马兵钢.郝青南.何娟.王蕾番茄红素β环化酶基因RNAi植物表达载体的构建及遗传转化[期刊论文]-石河子大学学报（自然科学版） 2010(1)

本文链接：https://www.360docs.net/doc/da10396173.html,/Periodical_xbzwxb200809035.aspx

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下载时间：2010年12月1日