追女孩秘籍之方法流

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在追女孩秘籍的酒吧里,你的合作技能是很重要和明显的。特别是在吵闹的夜总会,孤立目标与目标一对一讲话很容易。圈内特别有名的《初次约会:怎么才能吸引女生》中有说到。但这篇不是关于技巧的,而是关于不管你在酒吧还是任何类似环境,游戏前该做的准备。包括你选择的酒吧地点,如何打通酒保等…

本来我是想把这部分内容放在夜店与酒吧的文章中的,但后来想,这本身就可以作为一个单独的话题。

夜店游戏其实与日间游戏有很大的相似性。

在酒吧里,你的社交直觉特别重要。尤其在吵闹的club,孤立目标与目标一对一讲话很容易。

但这篇文章并不是关于技巧的,而是关于不管你在酒吧还是任何类似环境,游戏前该做的准备。相信我吧,这真的很重要。

追女孩秘籍地点:

1.注意!找到一个你喜欢的并且会常去的酒吧。你可以挑一天专门去寻找或在网上搜索。这对决定你在游戏时把妹的数量和质量都有很大的影响。它的重要性我不强调。

2.距离会影响你的“物流”。当你在挑选酒吧地点时把这点牢记在心。

追女孩秘籍技巧:

1.学习如何去交朋友和适时离开团体。我的意思是你要根据你游戏的需要。在酒吧里,首先要打入很多组合里,记住,不仅仅是你的目标组合,而是任何你可以打入的。不管是夜间游戏还是日间游戏,酒吧里都要有你的团体。

2.擅长于一些酒吧活动。(像投镖好手,舞池王能给你带来很多好处,甚至可能不用饿钱袋子)擅长于酒吧活动所带来的价值无须我解释的。

追女孩秘籍社交:

1.混熟员工。不管是在酒吧还是夜总会,与员工混熟了总是好事一桩。有的好处太明显我不多说。至于那些不明显的好处,举个例子,比如你正跟一个妹子跳得火热,但酒吧要关门了,通人脉的你却仍可以继续在舞池上“起舞”。并且,直接给酒吧打个电话问:“兄弟,那边情况怎么样啊?”这多拉风啊!还省得跑腿了。

2.记得混熟常客。但要有所辨别和甄选。酒鬼和常客是有区别的。酒鬼总是全醉的状态且多半没工作。而常客有工作,经常处于半醉的状态,很可能他们只是去散散心罢了!毫不疑问,你当然会选择那些帅气的,正常的客人交朋友。对于那些满腹牢骚的醉鬼置之不理。

3.混熟经常在酒吧的乐队或至少对当地的乐队有所了解。(我不会再解释它的好处了)你至少要听说过10个当地的乐队。

追女孩秘籍注意点:

1.在夜店时,要谨防这种类型的骗术:“今天是我或他生日,能买杯酒送给我或他吗?”你要准备好应急答案。你就可以说:“不好意思!今天也是我生日,要不先送我吧?”

2.一旦你误闯人那些野蛮的醉鬼当中,迟迟纠缠不清不得脱身时,也要有好的对策。如果你与酒保的关系挺铁,那么他很可能以喝得太多为由把他直接扔出去。因为他已经干扰了别人享受夜生活的秩序。

3.永远不要主动去买酒。这不管对酒吧还是俱乐部都适用。

4.如果你想在舞池或飞镖上大显身手的话,带上自己的道具也无可厚非。但不可做的太过。你只是想展示自己而已,并不是参加什么像奥运会一样的酒吧体育赛。

所有这些建议都会给你在酒吧游戏中做最好的铺垫,让你毫不费力地大获全胜。其实在把妹圈内最经典的《第一次约会就可以吸引她》里面已经提到过。

如果你也想到了别的什么点子,欢迎补充。

最详细地流式细胞仪实验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1.标本制备: 2.最小化非特异性结合: 二、凋亡 1.凋亡的检测方法:和其它 2.PI染色法 3.Annexin V 法 4.TUNNEL法 三、细胞因子 1.激活的细胞因子 2.CBA 四、血小板 1.活化 2.活化检测 3.网织血小板 五、红细胞 1.网织红细胞 2.PNH 3.胎儿红细胞 六、肿瘤学 1.DNA 细胞周期 2.蛋白 3.多药耐药 4.微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞/ml),在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),。孵育20-60分钟后,用PBS(pH7.2—7.4)洗1-2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原—抗体—抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1.荧光标记的抗体的浓度应该合适,如果浓度过高,背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2.在使用第一抗体之前,将样品与过量的蛋白一起培育,如小牛血清蛋白(BSA),脱脂干奶酪,或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3.在使用第一抗体之后,将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面,但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合,或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4.使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2 存在的条件下,将新鲜组织或片段一般是不能利用或很难制作。因此,在NaN 3

水闸过流能力及稳定计算

水闸过流能力及结构计算计算说明书 审查 校核 计算 ***市水利电力勘测设计院 2011 年 08 月 29日

1、水闸过流能力复核计算 水闸的过流能力计算对于平底闸,当为堰流时,根据《水闸设计规范》(SL265-2001)附录A.0.1规定的水力计算公式: 23 02H g b m Q s εσ= 22 '02?g bh Q h H c c ? ?? ? ??+= 40 01171.01s s b b b b ???? ? ? - -=ε 式中:B 0—— 闸孔总净宽,(m ); Q ——过闸流量,(m 3/s ); H 0——计入行进流速水头的堰上水深,(m ); h s ——由堰顶算起的下游水深,(m ); g ——重力加速度,采用9.81,(m/s 2); m ——堰流流量系数,采用0.385; ε——堰流侧收缩系数; b 0——闸孔净宽,(m ); b s ——上游河道一半水深处的深度,(m ); b ——箱涵过水断面的宽度,m ; h c 进口断面处的水深,m ; s σ——淹没系数,按自由出流考虑,采用1.0; ?——流速系数,采用0.95; 已知过闸流量Q=5.2(m 3/s )先假设箱涵过流断面净宽确定箱涵过流断面高度,经试算得: 综上,过流断面尺寸为2.5m ×2.0m (宽×高),设计下泄流量Q 为5.2m 3/s ,过流能力满足要求。

2、结构计算 **堤防洪闸均为钢筋砼箱涵结构,对防洪闸进行抗滑稳定、抗倾覆稳定和墙基应力计算。 (1)抗滑稳定计 1)计算工况及荷载组合 工况一:施工完建期,荷载组合为自重+土压力 工况二:外河设计洪水位,荷载组合为自重+土压力+扬压力+相应的闸前闸后静水压力+风浪压力 2)荷载计算 计算中砼强度等级为C20,钢筋采用Ⅰ、Ⅱ级,保护层厚度梁25mm、板20mm,符号规定:力向下为正,向上为负,力矩逆时针为正,顺时针为负。 闸门重 2.352×9.81=23.07 KN; 闸底板重25×4.0×0.7×4.1=287 KN; 闸墩重25×0.8×4×2*2=320 KN; 平台板,梁25×(0.25×0.45×2+1.05×0.15)×2.5=23.91 KN; 柱25×2.82×0.4×0.4×4=45.12 KN; 启闭力-100 KN; 启闭机重0.56×9.81=5.49 KN; 启闭梁25×(0.3×0.5+0.25×0.4+1.35×0.12)×2×3.5=72.1 KN; 工作桥25×(5.9×0.12+0.2×0.25×3)×2.0=42.9 KN; 25×(6.28×0.13×2×0.13+1.2×0.15×5×0.15)×2=34.73 KN; 启闭房砖墙22×0.864×4.1×4=311.73 KN; ∑自重=23.07+287+320+23.91+45.12-100+5.49+72.1+38.815+340 =1016.98KN; 水重10×2.0×2.0×2.5=100 KN;

流式细胞仪常用的几种检测方法

精品文档,放心下载,放心阅读 流式细胞仪常用的几种检测方法(转载) 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档,超值下载 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中; 加入2ml预冷的70%乙醇,4℃保存; 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1~2×106个细胞于PBS(PH=7.2)缓冲液中; 2) 300g离心5分钟,弃上清,反复两次; 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中; 4) 将细胞悬液放置于2~3ml冷70%乙醇中,混匀,保存于4℃,至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意: 2根据实验的要求,固定剂也可选用1~3%多聚甲醛; 2将乙醇作为固定剂时,乙醇应预冷至0~4℃; 2细胞在固定时,固定剂应缓慢滴入细胞悬液中,使固定剂的浓度缓慢增加,并不断震摇,以免细胞成团(特别是用乙醇固定时)。 2 300g离心5分钟,去上清,再重悬于400μl PBS中; 2显微镜下观察,若有明显的黏附,须再用筛网过滤; 2加入PI(含Rnase),避光孵育30分钟; 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液; 2) 500g离心5分钟; 3) 弃上清,重悬于10ml染色-去污剂中; 4) 再过滤,用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤; 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚,2~3片,制成单细胞悬液; 2) 用PBS缓冲液洗涤,500g离心5分钟,弃上清; 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟; 4) 调整细胞浓度为1×106/ml; 5) 上机检测。

流式细胞仪细胞分选的操作步骤

细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究,而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养,因此在样本制备,上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇(用无菌蒸馏水配制) 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子,振摇鞘液筒,确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接,否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处,并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管(若不使用浓缩器)。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门(画一个空门使机器进行分选操作)。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉,点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满(每管注满需要9min ),点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次,共需要1h。 13、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水,振摇鞘液筒,倒掉液体,反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水,盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满(每管注满需要9min),点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次,共需要1h。 20、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管(最左)中收集15 mL PBS后取下,使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞,则应用无菌技术,用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管,将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞

流式细胞仪常用的几种检测方法

流式细胞仪常用的几种检测方法(转载) 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中; 加入2ml预冷的70%乙醇,4℃保存; 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1~2×106个细胞于PBS(PH=7.2)缓冲液中; 2) 300g离心5分钟,弃上清,反复两次; 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中; 4) 将细胞悬液放置于2~3ml冷70%乙醇中,混匀,保存于4℃,至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意: 2根据实验的要求,固定剂也可选用1~3%多聚甲醛; 2将乙醇作为固定剂时,乙醇应预冷至0~4℃; 2细胞在固定时,固定剂应缓慢滴入细胞悬液中,使固定剂的浓度缓慢增加,并不断震摇,以免细胞成团(特别是用乙醇固定时)。 2 300g离心5分钟,去上清,再重悬于400μl PBS中; 2显微镜下观察,若有明显的黏附,须再用筛网过滤; 2加入PI(含Rnase),避光孵育30分钟; 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液; 2) 500g离心5分钟; 3) 弃上清,重悬于10ml染色-去污剂中; 4) 再过滤,用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤; 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚,2~3片,制成单细胞悬液; 2) 用PBS缓冲液洗涤,500g离心5分钟,弃上清; 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟; 4) 调整细胞浓度为1×106/ml; 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布(由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡)

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA 碎片检测比较,使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液:含0.1%NaN ,过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

流式细胞仪操作规程

FACSCalibur流式细胞仪操作规程 一、编号:YQ0606 二、标题:FACSCalibur流式细胞仪操作规程 三、关键词:流式细胞仪操作规程 四、目的:保证流式细胞仪的安全及有效操作 五、背景知识:流式细胞术(Flow CytoMeter,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。 六、原理 待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接受方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过A/D转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,液可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达,其X轴为测量强度,Y轴为细胞数目。一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数,这视其模数转换器的分辨率而定。对于双

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序: 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置,可以连续工作3个小时左右)、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印 机。 3.气压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加入 1滴质控小微球,也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。选择所需校 正内容,如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查,并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕,显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果,退出FACSComp程序。 备注:在质控过程中,如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,一定要用“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件:CellQuest Pro 软件,选择“联机”。 1.

(2)对实验样本进行命名; (3)对实验通道进行预设(FSC,SSC,FL1-FL4)。 备注:如果界面被关闭,重新调出步骤: 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具(一般选择散点图),Inspect 界面会自动弹出,对几个常用选项进行设定:将散点图选中(用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形),将 更改横纵坐 备注:第一个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC 。 (1一般获取10000个细胞。 (2 ( 3)将所有补偿调为0 (4)将非 52 (5)FSC和SSC (6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀,上机,功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号,第一个图:让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域;其他三个 散点图,要将细胞信号调整到阴性区域,即左下角区域。通过移动通

方法--流式细胞术检测细胞

2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期 2.2.2.5.1 实验原理 用流式细胞仪检测细胞周期,通常用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染细胞核。PI在一定波长的光下发出荧光,其强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数,可检测细胞的增殖、凋亡。 2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤 收集对数生长期细胞,计数,以(1~5)×105/孔接种于6孔板,置37℃,5%CO2条件下培养过夜,使细胞贴壁。次日更换培养液,各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔,继续常规培养;每24 h同法换液一次。每个浓度设3个重复。 48 h后,中止培养,胰酶消化后,收集细胞于流式管1000 r/min离心5min,弃上,冷PBS洗涤细胞3次,离心去上清; 一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀,4℃固定18 h以上;离心,弃去乙醇上清,加入预冷的PBS洗沉淀1次,离心去上清; 加入RNA酶(50 mg/L)10 μL/孔和PI(50 mg/L)300 μL/孔,震荡混匀。室温、避光反应30 min; 流式细胞仪进行DNA检测,用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。 2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡 2.2.2.6.1实验原理 在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV 是一种分子量为35~36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 2.2.2.6.2 结果判断 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性,坏死细胞则不能。 细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象

有植被河道水流特性研究进展

王莹莹赵振兴 (河海大学 环境科学与工程学院 南京 210098) 摘要:近年来,生态修复一直是学者探讨的热门课题,河岸种植植被能固滩固岸,保护岸坡不受侵蚀,但也有专家提出植被会降低河道的泄洪能力。如何布置,使植被更大限度地发挥“固滩护堤”的作用,是生产实际中提出的新问题。于是研究植被对水流特性的影响越来越重要。本文详细回顾了前人对有植被河道水流特性问题的研究状况,综合评述了已有研究的局限性,提出今后研究的重点与方向。 关键词:生态护岸河道 刚性植被 柔性植被 1. 背景 河流的开发利用带来了一定的经济效益,为经济的繁荣做出了很大的贡献。但与此同时,也带来了不少负面影响,许多河道的岸坡受到不同程度的破坏,生态也严重受损,导致了河流的行洪能力大大降低,洪灾总体风险不断增加,城市洪涝灾害的发生日渐频繁且强度加甚。 这种人为造成的自然灾害不得不越来越引起人们的广泛关注,于是乎近年来河道的生态修复已提上日程并在许多实际工程中得到应用,也已经普遍得到专家人士的认可。其中,植物护坡技术在国内外堤防工程中更是被广泛采用。河岸种植植被,植被的根系可以保护土壤,防止水土流失,能切实可行地做到“固滩固岸”,保护岸坡不受侵蚀。采用种植植被护坡技术投资少,技术简单,又可以绿化自然,美化环境,有利于生态的良性循环。此又可谓之“生态护岸工程”,生态护岸能达到加固河岸,防止河道淤积、侵蚀和下切的目的。然而,另一方面,我们还不得不考虑到,水中种植植被增大了河流的阻力,减缓了河流的流速,导致河道水位的攀升,甚至引起部分泥沙的淤积;另外,河道水流部分能量被迫转换成植被附近产生的紊流脉动动能,使水流动能得到消耗。从这方面考虑,种植植被则降低了河道的泄洪能力。因此,我们要从各方面综合考虑这种植物护坡技术的可行性,分析其利弊,因地制宜,找出最合理的种植植被的方案,使其扬利除弊,更好地发挥作用,保证行洪的安全,并能起到保护生态环境的作用。这正是生产实际中面临的新问题,因此,弄清河道中种植植被对水流的阻力影响、水流的紊动结构等是非常有必要的。 2. 国内外研究进展 有植被的河道水流问题是一门多学科交叉问题,该项目涉及到水流、植被、泥沙、地貌、河道演变、水土流失以及环境生态等诸多领域。研究有植被水流的紊流结构,对河道中泥沙的输运与沉降、河床的淤积与堤岸的侵蚀、河道中污染物的扩散以及生态环境的优化都有很重要的现实意义及其广阔的应用前景。因此,对种植植被的河道水流特性的研究 1

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样(大约1×106 cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞,﹣20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl的Rnase(GenScript试剂A),37℃水浴30min,然后再加入400μl的PI染液(GenScript试剂B),在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells, 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDBY,5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H(选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

流式细胞术实验方法

流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定过夜。 4、离心,弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室温避光孵育30min。 9、混匀,过300目筛网,置流式管中, 4℃冰箱保存,待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。 3、加入2ml预冷PFA,PFA的浓度根据细胞的特点进行调节,4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的(4-9) 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、以冷PBA 1ml,离心洗涤,弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次,以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀,置流式管中,4℃避光保存,待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul,对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心,弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次,以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。

流式细胞仪操作方法

—、样品制备 1、取样(大约lx cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1 ml 70%的冷乙醇固定细胞,-20°C冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100|j 啲Rnase (GenScript试剂A), 37°C水浴30min,然后再加入400』的PI染液(GenScript试剂B),在4°C避光条件下孵ff30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2xl04cells, 二、上流式测细胞 1」、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属扌当板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属扌当板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖, 检查所有管路是否妥善安責。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBYo如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀責于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowce呻的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流岀)。结束后自动STANDBY, 5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plot type选择Acq-analysis, X参数和丫参数分别取FSC-H、SSC-H (选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type选择Acq-onalysis, X 参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H) Y Parameter Plot Source: |< Select File... X Parameter Mie:| Acquisition

(完整word版)流式细胞术步骤.docx

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内,培养过夜后,用相应药物处理 细胞。 (设置实验组和对照组,实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组,2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组 正常对照组 (NC 组):胰岛素终浓度 0.058mg/L A 组:辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ; B 组:辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ; C 组:辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ; 于 37℃, 5%CO2 培养箱中孵育 48h) 2. 胰酶消化收集细胞,并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次,全部加入15ML 管中。 3.800 rpm 离心 5 分钟,去除上清,加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复 两次,最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。 4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇,固定, 4℃过夜。 5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟,弃上清,加入 4 mL PBS 清洗一次,用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 6. 加入 5 μL RNaseA( 10 mg/ml ) 37℃消化 1 (propidium iodide PI )4℃避光染色过夜(或者小时,加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时),在 EPICS XL 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内,培养过夜后,用相应药物处理 细胞。 2.胰酶消化收集细胞,并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次,全部加入15ML 管中。 3 . 800 rpm 离心 5 分钟,去除上清,加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复 两次,最后重悬细胞于0.1mL PBS中,并转移到 1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗(如下图对应),置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm ,小型离心机离心 5 分钟,去除上清,加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复 3 次,最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。

流式细胞仪使用方法

流式细胞仪的使用方法及相关资料 仪器名称:流式细胞仪 生产厂家:美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法: 一.开机程序 1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。 2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。 4.如果需要打印,打开打印机电源。 5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。 7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。 二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。 3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测,EXP用于细胞表面标志分析。 三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3.从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框。 4.在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞,按1×106 cells/mL以1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h后,进行所需的处理(比如加药,照射) ↓ 特定时间后终止培养,进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液,洗后的PBS和消化后的细胞,将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min(短时低速离心) ↓ 弃上清,用1.5ml预冷PBS,1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇,混匀后,于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓

将乙醇吸除,加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍,将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS,加入200ul PBS和2ul的RNA酶(0.25mg/ml)(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中(PI 具有很强的粘附性,容易使细胞聚团),标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机(先开仪器后开软件) ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分:①流动室及液流驱动系统;②激光光源及光束成形系统;③光学系统;④信号检测、存贮、显示、分析系统;⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞,然后插入流式细胞仪上

↓ 流动室内充满鞘液,细胞排成单列由喷嘴中心喷出,形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交,细胞上的荧光染料被激发产生荧光(488nm激 发光源) ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析(荧光染料和细胞DNA分子特异性结合,可以检测出细胞周期各时相细胞比例) ↓ 在用第三方软件分析之前,将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析

8. Attune NxT流式细胞仪标准操作规程

Attune NxT流式细胞仪标准操作规程 一、启动Attune NxT流式细胞仪 1、依次打开电脑主机电源、显示器及仪器电源。电脑用户名为INSTR-ADMIN, 密码为INSTR-ADMIN(全部大写)。 2、双击Attune软件图标,用户名为admin,密码为password1(全部小写)。 3、检查仪器内四个液体容器,清空“waste”桶中的废液,确认“Focusing fluid”、 “Wash solution”和“Shutdown solution”三个桶中的液体量是否满足实验要求(液面较高)。 4、点击startup,等待机器启动,整个过程大约需要3分钟。仪器指示灯显示为 绿色,软件左下角出现绿色对勾即为启动完成。 5、点击performance test,在2mL鞘液中滴入3滴performance tracking beads, 混匀后上机,点击Run Performance test。Performance test每天运行1次。这个过程大约耗时3分钟。 二、检测样品 1、点击new experiment新建一个实验,选择tube或plate实验,输入实验名称, 采用默认的Workspace和仪器设置参数,输入Tube Groups和Tube Samples 的数量,点击OK。 2、双击软件右侧Experiment下的Compensation,在弹出的对话框中选择相应的 荧光通道,点击OK。 3、双击UC后上样,点击Run,并调节电压,电压调好后点击Record,依次将 每个单染色的样本上样,并点击Record记录其荧光信号。 4、荧光补偿调好之后双击sample,上样后点击Run即可得到样本的荧光信号。 根据需要建立散点图并建门。 三、关闭Attune NxT流式细胞仪 1、确认”wash solution”和”shutdown solution”桶中液面高度至少在桶高的一半以 上,清空“waste”桶。 2、点击shutdown,选择Quick、Standard或Full,样品管内加入3ml 10% bleach 液,点击next启动关机程序,此时请勿关闭软件或者终止shutdown过程,关

流式细胞仪

1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术,用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。 目录 * 1 原理 * 2 流式细胞仪(flow cytometer) * 3 应用 * 4 参见 原理 一束单色光(通常是激光)照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点,其中一个和激光在同一直在线(称作前散射(FSC)),其它几个和激光垂直(旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器)。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射,同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录,根据各检测器亮度的波动(每个细胞会显出一个散射或荧光的峰)就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关,而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度(比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度)。 可以检测的参数有: 细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA(细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等)、RNA 染色体分析和分选(文库构建、染色体涂染)、蛋白质、细胞表面抗原(CD标记)、胞内抗原(各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等)、核抗原、酶活性、pH,胞内离子化的钙、镁,膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)(定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化)、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合(DNA/表面抗原等等) 流式细胞仪(flow cytometer) 流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计(FACS,Fluorescence Activated Cell Sorter)。现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒,并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。 流式细胞仪和显微镜比较像,但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。 一个流式细胞仪包括五个组成部分: * 细胞流动系统:液流(鞘液(sheath fluid))携带细胞,使颗粒以串流形式通过光束。 * 光源:有通常的灯(汞或氙)、高功率水冷的激光源(氩、氪、染料激光)、低功率气冷激光(氩(488nm),红氦氖(633nm),绿氦氖,氦镉(紫外))、偶极激光(蓝、绿、红、紫)。 * 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统:产生前散射、旁散射光和荧光的信号。 * 放大系统,线性或对数放大。 * 计算机,用于分析信号。 早期的流式细胞仪主要是实验设备,但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同,主要的厂商和品牌如下: * Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms) * Becton, Dickinson: (FACS's): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform) * Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform) * Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms) 应用 流式细胞术在很多领域中都有应用,包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中,

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