恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶胶体金免疫层析法检测试纸条的研制
?论著?恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶胶体金免疫
层析法检测试纸条的研制3
李莉1,劳海苗2,吴英松2,郝文波2,李明233
(1.南方医科大学基础医学院实验管理中心,广东广州510515;2.南方医科大学生物技术学院)
【摘要】 目的 用氯金酸标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LD H)单克隆抗体(McAb),研制用于诊断恶性疟原虫和间日
疟原虫感染的胶体金免疫层析(GICA)试纸。 方法 采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒、标记抗恶性疟原虫重组
乳酸脱氢酶单克隆抗体,制成免疫层析检测试纸条。用该试纸条检测已知疟疾病人及健康人血样,鉴定方法的敏感性和
特异性。 结果 检测重组LD H抗原的最小量为5ng/ml;对30例恶性疟病人血样及40例间日疟病人血样进行检
测,敏感性分别为83.33%和57.50%,检测100例健康者血样特异性为98.00%。 结论 初步建立了同时诊断恶性疟
原虫和间日疟原虫感染的GICA检测法。
【关键词】 疟原虫,恶性;乳酸脱氢酶;单克隆抗体;胶体金免疫层析试纸技术
【中图分类号】 R382.31 【文献标识码】 A 【文章编号】 167325234(2006)0520348204
Preparation of gold2immuochromatography assay test paper for Plasmodium f alci pa rum lactate dehydrogense
L I Li,LAO Hai2miao,WU Y ing2song,HAO Wen2bo,L I Ming (S outhern Medical Universit y,Guang2
z hou510515,China)
【Abstract】 Objective To establish a gold2immunochromatographic assay(GICA)stripe for detecting both falciparum
and tertian malaria using chloroauric acid2labelled monoclonal antibody against lactate dehydrogense(LD H)of Plasmodi2
um f alci parum. Methods Collodial gold was coupled with monoclonal P.f alci parum LD H antibody to prepare a GI2
CA test paper.The2gold2anti2LD H conjugate reacted with LD H in serum and migrates up the nitrocellose stripe on which
anti2LD H was immobilized,thus producing the detection reaction.GICA stripe was then evaluated for its sensitivity and specificity. R esults The lowest concentration that could be detected was5ng/ml.The thirty cases of falciparum and
forty cases of vivax malaria patients were detected,which showed that the GICA strip had the sensitivity of83.3%and
57.5%for detecting falciparum and vivax malaria respectively,and the specificity98%for both kinds of malaria. Con2 clusion GICA was established in this study is sensitive and specific for detecting both falciparum and vivax malaria,and
is potentially usef ul in developing reagent kits for clinical use.
【K ey w ords】 Plasmodi um f alci parum;LD H;McAbs;gold2immuochromatography assay test
乳酸脱氢酶(LD H)是广泛存在于动植物及微生物细胞内的一种重要的同工酶,是糖酵解途径的末端酶,疟原虫LD H在疟原虫的整个红内期均表达,在疟原虫能量代谢中发挥重要作用[1,2]。早期的研究已经揭示了在各种疟原虫LD H之间不但有共同抗原表位,还具有种特异抗原表位,因而能同时鉴别诊断恶性疟和间日疟[3];另外LD H仅由活虫体产生,因此可用于鉴别原虫的死活,监测治疗效果和复燃情况[4],是理想的疟疾免疫诊断的靶抗原[5,6]。
目前对疟原虫LD H研究只限于恶性疟原虫和诺氏疟原虫,间日疟的LD H还未见报道,而且间日疟原虫不能体外培养。本研究根据恶性疟和间日疟原虫的LD H具有交叉抗原的特性,利用基因工程技术获得高纯度、具有生物学活性的LD Hpf重组抗原。用该抗原从本室制备的11株抗LD Hpf单抗中,筛出能与恶性疟原虫反应的种特异性和能与恶性疟和间日疟同时反应的属特异性单抗,并将其优化组合,建立了同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的胶体金免疫层析(gold2immuochromatograp hy assay,GICA)检测法。
材料和方法
1 材料
1.1 抗体和血样 抗LD Hpf单克隆抗体由本室制备;恶性疟病人血样、间日疟病人血样由杭州艾康公司
3【基金项目】 广州市科技计划项目(No.2002E32E4012)。
【作者简介】 李莉(1975-),女(汉),河南人,2004年毕业于第一军医大学免疫学专业,硕士。现为南方医科大学基础医学院实验管理中心讲师,主要从事基因工程抗体方面的研究。
E2mail:helansll@https://www.360docs.net/doc/d012073697.html,
33【通讯作者】 李明
提供;健康人血样由杭州第一人民医院提供。
1.2 试剂 氯金酸(HAuCl4?4H2O),Sigma公司产品;蛋白分子质量标准,购自鼎国生物技术公司;硝酸纤维素膜、玻璃纤维、聚酯膜、滤纸、塑料板、色卡均由杭州艾康公司提供。
2 方法
2.1 单抗的纯化 采用饱和硫酸铵法。11株单抗腹水各取5ml,分别按1∶4比例稀释,稀释液为PBS;搅拌条件下加入20ml饱和硫酸铵,磁力搅拌30min, 3000r/min离心10min,弃上清,沉淀溶于3ml PBS 中,混匀;加入
3.6ml饱和硫酸铵,磁力搅拌30min, 3000r/min离心10min,弃上清,沉淀溶于2ml PBS 中,混匀,装入透析袋,PBS中透析48h,其间更换3次透析液。用紫外蛋白检测仪测定蛋白浓度,分别为1C67.3mg/ml,3C9
4.1mg/ml,7D2
5.4mg/ml, 2D72.2mg/ml,6G75.5mg/ml,2B113.2mg/ml, 2C64.8mg/ml,1E70.9mg/ml,6D310.3mg/ml, 3C94.1mg/ml,3D109.4mg/ml,2F123.7mg/ml。
2.2 胶体金的制备 参照文献[7]进行。取0.01% HAuCl4水溶液100ml,加入10g/L柠檬酸三钠水溶液2ml,加热煮沸15～30min,待溶液由蓝逐渐变为紫红色,直至变红,即为胶体金溶液,颗粒直径为40 nm。
2.3 胶体金标记物制备 参照文献[7]。取胶体金1 ml,用0.2mol/L碳酸钾调p H8.2,0.45μm滤膜过滤,分光光度计测A450值。在搅拌下快速加入单克隆抗体30.8μg,继续搅拌30min后,加入10%BSA, 4℃放置3h～4h,3000r/min离心10min,弃沉淀,上清液再12000r/min离心20min,小心吸弃上清液,经0.45μm滤膜过滤即为胶体金标记溶液。
2.4 标记胶体金聚酯膜的制备 将调好终浓度为A450=80的标记胶体金按1ml/条的量由点金标机均匀涂布在聚酯膜上,并做好标记,喷量3μl/cm,37℃干燥过夜,备用。
2.5 单克隆抗体及羊抗鼠Ig G的包被 计算各单抗所需体积,调整蛋白浓度为2.5mg/ml。分别将两种抗体装入两支洁净专用扫描笔中,设定测试带(单克隆抗体)和质控带(羊抗鼠Ig G)宽度均为0.1cm,二者间距为1cm,位于NC膜中部,将程序输入自动点膜机,喷量为1.0μl/cm。进入工作状态,按启动键,开始包被,做标记符号。将包被有抗体的NC膜置37℃孵箱放置过夜,即为包被膜。
2.6 试纸条组装 整个试纸条由NC膜、玻璃纤维膜、聚酯膜、滤纸、塑料板组成。首先取洁净塑料板,将包被膜用双面胶固定于塑料板固定位置上;将吸水滤纸连接在NC膜上端,玻璃纤维连接塑料板下端;胶体金标记物附着在玻璃纤维下,与包被膜衔接;均匀、轻微滚动式推进,以加强粘和力,用切割机将贴好的板切割成
3.3mm宽的条,即为成品试纸条。
2.7 测试方法 将试纸条装入全血板,样品池一端滴入10μl病人全血和20μl缓冲液(PBS)。血样中的LD Hp通过玻璃纤维的层析作用上行与胶体金标记的抗体结合形成抗原抗体复合物,再移行至包被膜,与包被抗体发生反应,形成双抗体夹心复合物,呈现出目测可见的红色条带,全部试验过程需5～20min。结果判断:阴性:试纸条测试带(T)不显色,仅质控带(C)显色,出现1条红线;阳性:试纸条测试带和质控带均显色,出现2条红线;若试纸条测试带和质控带均不显色,无红线出现,则测试无效,表示试纸条已经失效。
结 果
1 盐析单抗的活性
11株单抗腹水经过硫酸铵盐析后用EL ISA检测抗体活性,效价与盐析前基本相当。
2 GICA反应模式的初步建立
GICA反应模式的建立分两步进行。第1步:初步筛选。选择11株单抗中任何一株单抗(3C9)点膜,然后与另外10株单抗配伍(金标),选择反应最强的配伍对。本实验用3C9点膜,1E7做金标反应最强;第2步:进一步筛选。选择单抗1E7作金标,再分别与点膜的另外10株单抗配伍,选择反应最强配伍对,结果同前。
3 灵敏度试验
3.1 最低检测量 以3C9为包被抗体,1E7为标记抗体的模式检测重组抗原,抗原的量依此为1、5、10、100、500ng/ml,结果显示本试纸条检测重组抗原的最低量为5ng/ml。
3.2 疟疾血样的检测 以上述反应模式(3C9为包被抗体,1E7为标记抗体)检测30例恶性疟病人血样及40例间日疟病人血样,分别有25例和23例阳性,与镜检法结果的符合率分别为83.33%和57.50%。
4 特异性试验
检测100例健康人全血标本,2例阳性,特异性为98.00%。
5 重复性试验
用同一批不同试纸条测定同一样品,或用3个不同批号试纸条测定同一样品时,其测试带、质控带的显色时间、颜色深浅和最终结果判断基本相同。
6 稳定性实验
将试纸条置4℃干燥保存,分别于1月、3月、6月抽检,测定疟疾病人及健康人血样,其敏感性和特异性未见明显改变。
1 恶性疟病人血样 2 间日疟病人血样 3 重组抗原
4 健康人血样 5 缓冲液
图1 GICA检测疟原虫LD H结果
1 Pf sample 2 Pv sample 3 The recombinant protein
4 Negative cases 5 Cushion fluid
Fig.1 The picture of sample detecting
讨 论
胶体金快速免疫层析技术,具有快捷迅速、灵敏准确、安全简便、成本低廉、结果易于判定等优点,已被广泛用于临床。其基本原理是在NC膜的捕获线上包被一针对分析物的特异性单抗,同时将另一株抗体偶联在胶体金上(由于胶体金的颗粒表面带负电荷,与蛋白质所带正电荷基团之间形成非共价键的静电吸引而牢固结合,所以这种结合对所标记的蛋白质生物活性无明显影响)作为检测试剂。当加入待测标本后,由于层析作用,样品上行与胶体金标记的抗体结合,形成抗原抗体复合物,再移行至包被膜,与包被抗体发生反应,构成双抗体夹心复合物,呈现出目测可见的红色条带,颜色反应的强弱与样本中的抗原浓度成正比。
目前,疟疾诊断技术或方法主要有:1)厚、薄血膜染色镜检法,该方法费时费力、对低原虫血症者易漏诊[8];2)探针技术和PCR技术,用于检测疟原虫特定的抗原和核酸,其最突出的优点是对低原虫血症者检出率高、敏感性和特异性好,但需要特殊设备和试剂,其应用受到限制;3)免疫学方法,如间接荧光试验(IFA)。Dip stick抗原捕获法(Parasight2F实验)、免疫色谱测试法(ICT)、OptiMAL法,均是利用免疫层析技术的基本原理制备的试剂盒,其操作简便、快速、结果易于判定,已成为疟疾诊断研究发展方向。
Dip stick抗原捕获法(Parasight2F[9.10]实验)和免疫色谱测试法(ICT)都是基于HRP2Ⅱ为诊断抗原,由于抗原本身特点,存在以下缺陷:1)不能发现原虫出现前期患者或血中仅含成熟配子体的病人[11,12];2)在血液中活虫体消失后,仍可检出HRP2Ⅱ抗原;3)类风湿因子(rheumatoidfactor,RF)可与该系统的单克隆抗体Ig G发生交叉反应,出现假阳性。
OptiMAL法以乳酸脱氢酶(LD H)为诊断抗原。LD H是糖酵解途径的终止酶,在疟原虫的整个红内期均表达。pLD H具有种、属特异性抗原,是检测疟原虫理想的靶抗原。这是目前报道的既能鉴别诊断恶性疟和间日疟又能对治疗效果进行监测的一种快速、简便的免疫检测方法,也被用于流行病学调查。
尽管目前国外已生产出以LD Hpf为检测靶抗原的OptiMAL[13]试剂盒,但价格昂贵,病人难以承担。本研究用金标记11株抗重组LD H单抗制成免疫层析检测试纸条,筛选得到3株与恶性疟原虫和间日疟均反应的单抗,经过两次配伍优化组合发现以3C9包被抗体,1E7标记抗体为GICA较适反应模式。以此反应模式制备的免疫层析条对30例恶性疟病人血样及40例间日疟病人血样进行检测,敏感性分别为83.33%和57.50%,特异性为98.00%。敏感性较Palmer报道的OptiMAL法低的原因可能有以下几个方面:1)制备免疫层析条的工艺,如NC膜的孔径大小、质量好坏,抗体与膜材料的结合和稳定性,抗体包被量等;2)pLD H是疟原虫本身所固有的一种具有特异酶活性功能蛋白,其稳定性受外界条件变化的影响,从而影响阳性检出率。研究证实,样品反复冻融和样品长期保存时可使pLD H受到破坏。因此,检测新鲜血样中的pLD H效果最好,如需冻融时可加入蛋白酶抑制剂以避免pLD H破坏[14]。
在今后研究中,期望获得高亲和力、高特异性,同时又能针对恶性疟原虫和间日疟原虫共同表位的单克隆抗体;进一步完善免疫层析条的制作工艺,开发出高性价比恶性疟和间日疟同步诊断试剂盒。另外,根据间日疟和恶性疟的乳酸脱氢酶基因具有的相同序列片段,通过制备抗恶性疟原虫LD H多抗和属特异性单抗,尝试调取间日疟原虫的LD H基因,解决间日疟诊断抗原的问题。
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【收稿日期】 2005212220 【修回日期】 2006206223
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1 资料和方法
1.1 一般资料 2004年1月～12月收治的小儿患者167例,年龄1岁8月～14岁,平均9.2岁。男78例,女89例,男∶女为1∶1.1。农村患儿123例,城市患儿44例,农村∶城市为
2.8∶1。少数民族133例,汉族34例,少数民族∶汉族为
3.9∶1。
1.2 临床表现 以癫痫发作起病80例,占47.9%;以头痛、恶心、呕吐等颅内高压症状发病67例,占40.1%;以肢体麻木、偏瘫等躯体障碍起病8例,占4.8%;精神障碍4例,占
2.4%;失语、听力障碍3例,占1.8%;发现皮肌型囊虫病,后行颅脑影像学检查确诊合并脑囊虫病者3例,占1.8%;正常体检时意外发现2例,占1.2%。
1.3 实验室检查
1.3.1 血象 149例正常;嗜酸粒细胞增高18例,占10.8%。
1.3.2 免疫学检查 用EL ISA法或IHA法检测患儿血清特异性Ig G抗体,阳性率为68.3%;13例患儿脑脊液特异性抗体检测为阳性。
1.4 影像学检查
1.4.1 颅脑CT 全部患儿均行颅脑CT检查,163例患儿发现脑部囊虫病灶,占97.6%;属急性感染101例,占60.5%;慢性感染62例,占37.1%。
1.4.2 颅脑MRI 37例患儿行颅脑MRI检查,脑部均发现囊虫病灶。
1.4.3 病原检查 5例混合型囊虫病患儿,取皮下结节作活组织检查,均发现猪囊尾蚴。
1.5 治疗
1.5.1 病原治疗 采用阿苯达唑片(陕西汉江药业股份有限公司生产,国药准字H20045647)和吡喹酮片(南京制药厂有限公司生产,国药准字H32021380)联合治疗。阿苯达唑按20 mg/kg?d,2次分服,疗程10d。吡喹酮按20mg/kg?d,2次分服,疗程6d,共治疗3个疗程,每疗程间隔2～3月。
1.5.2 对症治疗 对于颅内压增高者,每日静滴甘露醇,连用3d后再作病原治疗。癫痫发作者给予抗癫痫治疗。病原治疗期间积极处理各种并发症。
2 结果
疗效按文献[1]的标准判定。1)痊愈:无癫痫再发作,神经系统症状消失,颅脑CT或MRI检查囊虫病灶全部消失114例,占68.3%;2)显著好转:癫痫发作次数显著减少,程度减轻,神经系统症状显著好转,颅脑CT或MRI检查原囊虫病灶大部分消失或钙化38例,占22.75%;3)好转:癫痫发作次数减少,程度减轻,神经系统症状有所好转,颅脑CT检查原囊虫病灶减少或钙化14例,占8.38%;4)无效:癫痫发作次数未减少,神经系统症状无好转,颅脑CT或MRI检查原囊虫病灶未见改变1例,占0.6%。
3 讨论
通过对167例脑囊虫病患儿的诊断和治疗,总结出以下特点:1)脑囊虫病发病症状多样,患儿往往不能准确地表达病史,因而就诊时应及早进行全面检查,尽快明确诊断,及早治疗。癫痫发作是脑囊虫病最常见的症状,而引起癫痫发作的原因很多,诊断时应与小儿高热惊厥、小儿脑炎、小儿手足搐搦症等相鉴别;2)患儿中急性感染者居多,小儿对药物敏感性高,吸收情况好,所以治疗效果普遍较成人好,故宜早期明确诊断,及早治疗。治疗一定要遵从医嘱,按时全程系统地完成治疗,以求达到更好的疗效。治疗时应加强护理,出现不良反应时及时处理;3)脑囊虫病以农村居民及少数民族人群发病率高,主要与不良饮食习惯、卫生习惯,生猪饲养不善有关。因此应加强厕所管理,提倡圈养猪,控制人畜互相感染。大力宣传脑囊虫病的危害性,消除不良生活习惯,不吃生肉,切生、熟肉时,刀和砧板要分开。另外应加强城乡肉类卫生检疫工作,禁止“米”猪肉出售。
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【收稿日期】 2005212218 【修回日期】 2006207211