【最新版】不同年限不同批次普洱茶HPLC-UV_指纹图谱研究及其质量评价毕业论文
2014年度本科生毕业论文（设计）
不同年限不同批次普洱茶HPLC-UV 指纹图谱研究及其质量评价
院－系：理学院化学系
专业：化学专业
年级：2010级
学生姓名：余明星
导师及职称：吴娜（讲师）
2014年4月
2014Annual Graduation Thesis (Project) of the College Undergraduate
The H PLC-UV Fingerprints Disquisition and Quality Evaluation of Different Age and Batch about Pu-er Tea Department: Chemistry Department， School of Science
Major: Chemistry
Grade: 2010
Student’s Name: Mingxing Yu
Tutor: Na Wu (Lecturer)
Finished by April，2014
毕业论文（设计）原创性声明
本人所呈交的毕业论文（设计）是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本论文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。
作者签名：余明星日期：2014年5月6日
毕业论文（设计）授权使用说明
本论文（设计）作者完全了解红河学院有关保留、使用毕业论文（设计）的规定，学校有权保留论文（设计）并向相关部门送交论文（设计）的电子版和纸质版。有权将论文（设计）用于非赢利目的的少量复制并允许论文（设计）进入学校图书馆被查阅。学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容。保密的论文（设计）在解密后适用本规定。
作者签名：余明星指导教师签名：吴娜
日期：2014年5月6日日期：2014年5月6日
余明星毕业论文（设计）答辩委员会(答辩小组)成员名单
摘要
论文以普洱茶7542为研究对象，采用超声波提取，将提取液于HPLC-UV 仪上检测，建立了不同年限不同批次的普洱茶HPLC-UV指纹图谱。以样品组分、响应信号为指标，优化了样品提取溶剂和HPLC-UV仪器检测条件。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)版》软件和SPSS软件对其最佳提取溶剂和检测条件下建立的不同年限不同批次的普洱茶HPLC-UV指纹图谱进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，其结果为：不同年限不同批次普洱茶相似度均在0.9以上，以此说明各批次普洱茶之间有良好的相似性，各批次的质量相对稳定；通过聚类分析将19个不同年限不同批次的普洱茶可大致分为三类，同一年的不同批次普洱茶存在微小差异，说明各年限各批次普洱茶之间也存在差异性；同时借助主成分分析验证了不同年限不同批次普洱茶聚类分析结果的准确性。本论文所建立的不同年限不同批次普洱茶HPLC-UV指纹图谱反映了生产批次和质量差异性，可用于评价普洱茶质量和生产批次，能为进一步控制普洱茶的质量提供参考。
关键词：普洱茶；指纹图谱；HPLC-UV；质量评价
ABSTRACT
This paper regarded 7542 Pu-er Tea as the research object, extracted by ultrasonic, then the extracted solution would be detected by HPLC-UV, and worked the sample components and response signal as indicators and optimized sample extracted solvent and HPLC-UV instrument testing conditions. Different years and batches Pu-er Tea fingerprints was built in best experimental conditions, and the similarity of their fingerprints was evaluated by using “Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system (2004 A) ", the cluster analysis and principal component analysis was performed by using SPSS. The similarity of different years and different batches of Pu-er Tea in the experimental conditions was all above 0.9, which showed a good similarity between different batches of Pu-er Tea and quality of each batch of was relatively stable. Pu-er Tea was divided into three categories via cluster analysis. Therefore the Pu-er Tea of the same year and different batches existed minute differences. Moreover, the Pu-er Tea of the different years and batches also existed differences. The result of principal component analysis was undifferentiated about different years and batches Pu-er Tea, which showed the same analysis results as the clustering analysis result .The accuracy of all batches of clustering analysis results was venfied by means of the principal component analysis. This experiment that established the different years and different batches of HPLC-UV fingerprint identified the productive batches and the quality differences of the tea, which provided a reference for the further quality control Pu-er tea.
Keywords: Pu-Er Tea; Fingerprints; HPLC-UV; Quality Evaluation
目录
1 绪论 (1)
1.1 普洱茶简介 (1)
1.2 指纹图谱技术 (2)
1.3 HPLC-UV在指纹图谱中的应用 (2)
1.4 指纹图谱用于质量评价的研究 (3)
1.5 论文研究的目的和意义 (4)
2 实验部分 (5)
2.1 仪器 (5)
2.2 试剂 (5)
2.3 主要材料 (5)
2.4 液相色谱条件 (6)
2.5 实验步骤 (6)
2.5.1 普洱茶样品前处理 (7)
2.5.2 普洱茶供试液制备 (7)
2.5.3 普洱茶供试液分析 (7)
2.6 数据处理 (7)
3 结果与讨论 (8)
3.1提取溶剂的选择 (8)
3.2高效液相色谱检测条件的选择 (8)
3.2.1流动相选择 (8)
3.2.2检测波长选择 (8)
3.2.3进样量选择 (9)
3.2.4梯度选择 (9)
3.2.5流速选择 (10)
3.2.6色谱柱柱温选择 (10)
3.2.7检测时间选择 (10)
3.3不同年限不同批次普洱茶指纹图谱的建立 (11)
3.4不同年限不同批次普洱茶指纹图谱相似度评价 (11)
3.5不同年限不同批次普洱茶指纹图谱聚类分析 (14)
3.6不同年限不同批次普洱茶指纹图谱主成分分析 (14)
3.7 不同年限不同批次普洱茶指纹图谱方法学验证 (18)
3.7.1 重复性试验 (18)
3.7.2 精密度试验 (19)
3.7.3 稳定性试验 (19)
3. 8普洱生茶和熟茶比较分析 (20)
4 结语 (22)
参考文献 (24)
致谢 (25)
1 绪论
1.1 普洱茶简介
普洱茶是以云南特有的大叶茶(Camellia sinensis Kuntze. var. assamica Kitamura)的略粗老叶片[1]即晒青毛茶为原料经过特殊的发酵加工工艺生产制成的散茶和紧压茶[2]，也可以称之为黑茶。其大叶茶是中国著名茶树良种，为云南大叶茶类茶树品种的总称，可以制成青茶、绿茶、红茶[3]。在制成普洱茶毛茶后，由于其后期处理工序[4]的不同，所以普洱茶大致可以分为两类：生茶和熟茶。生茶是以符合普洱茶产地地理环境的条件下生长的大叶茶新鲜茶叶为原料经过杀青、揉捻、干燥、成型等工序而成的茶，其中若以晒青茶为原料生产制的的紧压茶又称为青饼，是在普洱茶历史中演化成的最早的普洱茶。而熟茶也以符合普洱茶产地地理环境的条件下生长的大叶茶新鲜茶叶为原料经过湿水、渥堆、翻堆。干燥等工序后经过存放，待其气味平韵，味质平淡后制成的茶。此外还有一种被称为晒青毛茶，其是将新鲜采摘来的茶叶经过杀青后直接在阳光下晒干而成的茶，由于它未进行任何人工发酵而保留了茶叶原本的口味，其营养成分也几乎未遭到破坏而被称为最初级、保留最完整的茶。正是由于普洱茶悠久的文化底蕴和独特的风味品质而被国内外广泛认同，也逐渐成为了云南的地理标志产品。
普洱茶中总多酚、黄烷醇和儿茶素类居多[5]，其次是多糖和蛋白质，而平时听闻的咖啡因、可可碱、矿物质、色素、纤维素等含量较前面的物质含量较低，挥发性物质更是微乎其微，在与其它茶类比较时，其化学成分大致相同，只是普洱茶中可溶性糖含量较高[6]。在其化合物中研究比较多的是儿茶素、茶色素（茶黄素、茶褐素、茶红素）、黄酮类、茶多酚、咖啡碱等几类物质，其中尤以儿茶素类研究居多。此外其挥发性物质主要出现在气相色谱的研究中。
在社会高速发展的今天，普洱茶由于其独特的品质和功效而逐渐成为人们所喜爱的绿色饮料。其具有的减肥、降脂、消炎、抗菌、防癌、抗癌和抗肿瘤等[7]保健的功效也逐渐为人们所关注，而抗氧化却是其具有保健功效的关键机理。在各种动物及人体实验中，通过比较试验普洱茶和晒青毛茶的降血脂作用[8]发现普洱茶具有较为显著的降血脂功效。通过对普洱茶对其在体内肝组织氧化损伤的保护作用观察发现[9]，普洱茶能降低血清胆固醇的含量、清除机体自由基
从而到达减轻甚至延缓脂肪肝的形成。其机理可能与茶叶中的多糖和多酚类具有的抗脂质过氧化能力和清除氧自由基有关。在对普洱熟茶片临床中调节血糖的观察得出普洱熟茶片能降低糖尿病患者空腹时血糖的水平[10]，而且在患者血糖升高幅度较大时，其作用更加明显并不造成肝肾功能的影响的结论。此外通过研究还发现普洱茶还能够抗病毒，杀菌消炎[11]。
1.2 指纹图谱技术
正是普洱茶的功效及保健作用越来越受到人们的喜爱，在市场利益的驱使下，越来越多的不法分子及黑心商家以假乱真，用不正当的手段赢取暴利。所以在市场调节未起到关键作用的时候，建立起能够正确而又科学的分析方法对普洱茶混乱的市场调节提供参考的基础。在众多的检测手段中，基于中药材发展起来的中药指纹图谱，正是在十多年的摸索滚爬中为中药的现代化形成了成熟而又先进的检测技术。普洱茶指纹图谱是指通过多维分析测定手段对普洱茶中复杂多源物质体系进行检测，尽可能全面地获取普洱茶的物质基础——化学成分群的特征信息，并用于普洱茶的质量控制、质量评价以及进一步开发运用的物质信息表征手段和方法[12]。指纹图谱具有全面性、整体性和关联性特点，能够全面包括检测物有效组分。近些年来普洱茶指纹图谱技术也得到了迅猛发展，大量批次和产地的普洱茶指纹图谱也逐渐以先进而又强有力的分析手段来建立。按分析手段可分为薄层色谱指纹图谱（TLC）、高效液相色谱指纹图谱（HPLC）、气相色谱指纹图谱（GC）、紫外光谱指纹图谱（UV）、红外光谱指纹图谱（IR）、质谱指纹图谱（MS）、核磁共振指纹图谱（1H-NMR）。在其众多分析测定手段中高效液相色谱的重现性好、灵敏度高、分离效果好、适用范围广[13]，已经成为目前研究指纹图谱的主流方法，而且国家标准对于普洱茶中各化学成分的检测也基本采用了HPLC的方法。UV检测器也具有低噪声，宽线性范围的优点，普洱茶中化学成分的差异能以其特征性的差异性来反映。所以将HPLC-UV为用于普洱茶指纹图谱的建立提供了强有力的手段。
1.3 HPLC-UV在指纹图谱中的应用
在指纹图谱的正式建立之前，各位专家学者需对普洱茶中各类化学成分的指纹图谱进行初步探索和研究，为后面指纹图谱库的正式建立提供基础，所以在普洱茶指纹图谱的研究中大都是先基于高效液相色谱对普洱茶各化学成分和功效的研究。金裕范[14]在选用云南思茅、红河、大理下关、西双版纳、临沧五
个不同产地生产的三年生茶为试药，采用高效液相色谱法检测了茶中咖啡因、（+）儿茶素、没食子酸的含量时发现五个产地的普洱茶中没食子酸含量差异较大，咖啡因和儿茶素含量差异不大。在倪倩等[15]人对普洱生茶的指纹图谱研究中已经能对不同批次普洱生茶初步建立指纹图谱了。她们的试验方法所建立的指纹图谱是在充分研究儿茶素及其衍生物类的基础上，既考查了指纹图谱中重复性、精密度、稳定性等方法学，又对主成分峰进行了确认和与两种绿茶（龙井、碧螺春）的指纹图谱进行了比较发现GC，EGCG，ECG这三个峰的的峰差非常显著，而且相似度均在0.9以上，此方法也为普洱生茶质量评价打下了好的基础。在前面的基础上李文博等[16]人普洱生茶和熟茶中的八种主要成分进行了定性和定量分析并以这八种主要成分含量为指标对普洱生茶和熟茶进行了判别分析、主成分分析和聚类分析。在充分进行标准曲线和检出限，精密度和稳定性试验，回收率试验的基础上做出统计分析，以此对新样本进行判别分析以提供普洱生熟茶的鉴定，正确率高达92.5%。在各类研究中我们发现基于高效液相色谱来建立普洱茶指纹图谱已经逐渐成熟，而基于液相中紫外检测建立的指纹图谱大都是中药药材类，并且适用于大批量的样品指纹图谱的建立，也为建立普洱茶的指纹图谱提供了参考。张志斐[17]先给酸枣仁药材建立HPLV-UV指纹图谱的共有模式，并对不同产地的酸枣仁进行相似度评价。结果表明建立的指纹图谱可以用于不同产地酸枣仁指纹图谱的测定和质量评价，相似度越高也表明各批次药材的化学成分及其含量的差异性越低，有助于确保药材的质量和疗效。董海娟[18]建立的穿心莲注射液HPLC/UV特征指纹图谱标示了九个共有峰，并根据10批次测定结果和参照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) [19]制定了此注射液的指纹图谱检测标准，而且还确定了质量控制。
1.4 指纹图谱用于质量评价的研究
指纹图谱应用于普洱茶的质量评价及质量控制一直是研究普洱茶的难点和重点问题[20]。普洱茶不仅种类繁多，成分复杂，而且产地、储藏时间和生产工艺也不相同，这些诸多原因造成了普洱茶的品质的不同。在普洱茶大部分化学成分研究清晰的成果基础上建立起质量评价的分析方法是为普洱茶的检验标准提供可行的参考，而且随着分析技术的发展普洱茶评价甚至质量控制技术也会相对成熟和健全。但就目前而言，指纹图谱评价技术已经运用于各个领域。而在茶叶指纹图谱中大部分是通过优化色谱条件来分析各种有效成分，建立良好
的线性范围，并以相似度和聚类分析作为参考来评价此色谱条件下茶叶指纹图谱。余静[21]通过建立分离度、精密度和重复性较好的玄参药材指纹图谱并用于10批次的测定，发现各批次指纹图谱相似度在0.98以上而且各成分存在的差异也可以在图谱中得以反映，由此可以得出指纹图谱可以为中药和天然药物质量评价甚至控制的有效手段之一。蒋海峰[22]也通过相似度分析和主成分分析法对不同收集地的乳香药材质量进行了综合评价。结果表明各药材质量不均一且分析结果支持广东的乳香优于其他省区的。胡燕[23]对南路边茶建立的指纹图谱以48批次样品为对象发现与指纹图谱共有模式相似性良好的八家南路边茶生产企业生产的样品所含化学成分及其相似且质量稳定。
1.5 论文研究的目的和意义
通过以上文献的阅读参考，我们发现在应用于质量控制、评价和新药的研发的指纹图谱以其具有的先进性、独特性和合理性而被广泛的开发运用，不仅是中药的发展的可行性工具，更为其应用于其他种类的物质的研究开发提供了参考思路，正式基于以上的分析和考察。所以参考了中药指纹图谱的研究技术把它应用于普洱茶的指纹图谱的建立和质量评价，不仅能够更好的为普洱茶的评价服务，也更好的为普洱茶的品质提供了重要的保障。在此基础上通过此次的实验研究能够充分贡献于普洱茶指纹图谱的研究，更为普洱茶的进一步质量控制和制定普洱茶标准研究寻求更可信的研究思路和分析方法。
本篇论文以普洱茶7542及其不同年限不同批次普洱茶为研究对象，通过采用HPLC-UV对不同年限不同批次普洱茶提取液进行检测，建立不同年限不同批次普洱茶指纹图谱，并采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)版》软件对指纹图谱进行相似度评价和SPSS软件进行聚类分析和主成分分析，以此来分析不同年限不同批次普洱茶的整体性和差异性，从而对普洱茶的质量作评价，为其进一步质量控制提供参考。
2 实验部分
2.1 仪器
表2-1仪器
高效液相色谱仪(HPLC)8030 日本岛津
HS-3120 北京恒奥德仪器仪表有限公司超声波清洗器
SHZ-D（Ⅲ）天津华鑫仪器厂循环水式多用真空泵
EYELAOSB-2100 天津华鑫仪器厂旋转蒸发仪
AR1140 奥豪斯仪器（上海）有限公司数显电子天平
2.2 试剂
表2-2试剂
试剂级别厂家
乙腈(Acetonitrile) GR Tedia,USA
甲醇(Carbinol) AR 天津市凤船化学试剂科技有
限公司
甲醇(Carbinol) GR Tedia,USA
娃哈哈矿泉水大理娃哈哈食品有限公司2.3 主要材料
化学分析滤纸、Ⅰ级蒸馏水（实验室自制）、2.5mL一次性针筒、0.45μm 有机相滤膜、0.45μm水相滤膜、2 mL进样瓶、大益牌（7542）普洱茶生茶和熟茶、不同年限不同批次大益牌（7542）普洱茶生茶。
表2-3不同年限不同批次普洱茶编号
（The number of different years and batches ）
编号（Number）年限批次（Years and Batches）
1 2000年01批次（001）
2 2001年01批次（101）
3 2001年05批次（105）
4 2002年（02）
5 2003年03批次（303）
6 2004年26批次（426）
7 2004年36批次（436）
8 2005年01批次（501）
9 2005年02批次（502）
10 2005年04批次（504）
11 2005年05批次（505）
12 2006年05批次（605）
13 2006年06批次（606）
14 2006年08批次（608）
15 2006年10批次（610）
16 2007年03批次（703）
17 2008年01批次（801）
18 2009年01批次（901）
19 2009年12批次（912）
2.4 液相色谱条件
岛津高效液相色谱仪（HPLC），岛津紫外检测器（SPD-20A），色谱柱：岛津（VP-ODS-C18,5 μm,2.2 mm×150 mm），流动相：甲醇-水，梯度洗脱（见表2-4），流速：0.3 mL/min，分析时间：45 min，柱温：35℃，检测波长：210 nm，进样量：1 μL。
表2-4高效液相色谱梯度洗脱程序
0 90 10
4 7
5 25
15 65 35
45 0 100
2.5 实验步骤
2.5.1 普洱茶样品前处理
将购买的普洱茶样品茶叶按样品处理方法中的四分法平均将其分成四份，取其中一份用研钵进行粉碎，过60目的筛子。将粉碎好的茶叶粉末置于干燥的具塞广口瓶中密闭保存。
2.5.2 普洱茶供试液制备
称取粉碎茶粉约0.5000 g，置于具塞三角瓶中加入50 mL甲醇，在提取温度（T）为30℃，功率（W）为3 KW的超声仪中超声30 min。将超声好的普洱茶样液常压过滤，过滤后转移至50 mL梨形瓶中。在水浴温度为60℃的旋转蒸发仪上真空浓缩至近干，再加入甲醇（GR）定容至2 mL。用安好0.45 μm 有机相滤头的2.5 mL一次性针筒过滤并注入进样品瓶。
2.5.3 普洱茶供试液分析
将装有普洱茶供试液的样品瓶放入高效液相色谱仪自动进样室按照 2.4中液相色谱条件进行分析。
2.6 数据处理
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004（A）版》、SPSS 19.0软件和《中药色谱图分析和数据管理系统》处理。
3 结果与讨论
3.1提取溶剂的选择
在常用的样品制备方法中选取醇提和水提作比较。参照2.5.2中普洱茶供试液制备方法制备甲醇提取液和水提取液并以2.4中高效液相色谱条件来做分析，其结果如图3-1。
图3-1普洱生茶提取溶剂选择对照图
从图中可以看出用甲醇制备样品较水制备样提取成分较多，峰的分离也较好，化学成分的响应信号也较强。由此确定用甲醇来作为制备普洱茶的供试液的试剂。
3.2高效液相色谱检测条件的选择
检测条件的准确性不但影响各化学成分的分离，还直接影响了指纹图谱的建立，所以分别选择流动相、流速、波长、梯度、进样量、柱温和检测时间为对象来确定指纹图谱建立的高效液相色谱条件，最后以各种实验条件下检测的谱图作参考来确定各个实验条件并确定指纹图谱建立的检测条件。得出的最佳检测条件为：将普洱茶甲醇提取供试液以A：娃哈哈纯净水和B：甲醇（GR）为流动相，在35℃柱温、210 nm波长和0.3mL/min流速条件下进1μL的普洱茶样品液并以0~4 min,10~25% B;4~15 min,25~35% B;15~45 min,35~100%B 梯度洗脱，分析时间为45 min。
3.2.1流动相选择
高效液相色谱中流动相的选择大都选择有机试剂，而且实验室中的自动进样针的洗液为1:1的甲醇-水，则将甲醇-水作为参考流动相。此外常用的有机试剂流动相还有乙腈，因此也选择了乙腈-水为对比流动相。结果如下（见图3-2）
图3-2高效液相流动相的选择对照图
作为实验室常用流动相的甲醇-水和乙腈-水对普洱茶化学成分的分析差别大，乙腈-水流动相使得几种化学成分峰合并在一起，分离效果较甲醇-水较差。因此选择甲醇-水作为检测时的流动相。
3.2.2检测波长选择
普洱茶中各种化学成分在不同波长下的吸收强度也不一样，但是如何在单一波长均让各化学成分都有较强的吸收，需要做对比来确定。从目前所掌握资
料中得出各类研究基本选择210 nm和280 nm作对比，所以试验时做出两种波长下的色谱图。结果如下图（3-3）
图3-3普洱茶有效组分检测波长的选择对照图
由图看出普洱茶中各化学成分在210 nm有较强吸收，所以以210 nm为检测波长。
3.2.3进样量选择
在设计进样量时先参考资料中进5μL普洱茶供试液做出色谱图，再以此为基准增大或减小进样量。在此设置下做出了如下图（3-4）的色谱图
图3-4普洱茶进样量的选择对照图
结果在进样量为5μL时普洱茶各化学成分吸收强度较大且峰型较差，所以将进样量递减至了2μL和1μL。发现仅有1μL进样量时峰型较好，其色谱图达到了建立指纹图谱的要求，因此设置进样量为1μL。
3.2.4梯度选择
不同梯度不但对普洱茶中各化学成分的分离有影响，还可以更好的将各化学成分的峰洗脱至较短分析时间，以此来增加峰型的数目，缩短分析时间。由此将表3-1中标号为1的洗脱程序为基准来进行梯度的选择，最后做出不同梯度下的色谱图（图3-5）。
对比不同梯度色谱图发现在梯度1和梯度2洗脱下出峰较少，各化学成分不能够得到有效的分离，而且梯度2洗脱下有些成分的峰保留时间较梯度3下的长，不利于指纹图谱的建立，而梯度3条件下出峰较多，各化学成分得到了较好地分离，各成分的峰的保留时间较梯度2下的短。
图3-5程序洗脱梯度的选择对照图
注：从上往下依次为梯度3、梯度2、梯度1
表3-1各个梯度洗脱程序
梯度编号洗脱时间甲醇(GR)/%
1 0~25min 50%~80%
25~45min 80%~100%
2 0~20min 10%~80%
20~45min 80%~100%
3 0~4min 10%~25%
4~15min 25%~35%
15~45min 35%~100%
3.2.5流速选择
流速的快慢会影响普洱茶中化学成分的出峰时间。如果不同流速下化学成分的峰型类似，则选择流速较快的作为所需流速，有助于减少色谱图分析时间，有利于普洱茶指纹图谱的建立，所以在最大流速的0.3 mL/min之外再设置0.2 mL/min的流速作对比。
图3-6流速的选择对照图
由图3-6可以看出两个流速下色谱图无论在峰的数目，还是吸收强度上无较大差异，但0.3 mL/min流速下色谱图显示各化学成分的分离较好，各化学成分出峰时间提前。由此确定流速为0.3 mL/min。
3.2.6色谱柱柱温选择
柱温度会影响普洱茶中化学成分的分离，而在设置色谱柱柱温时发现温度是35 ℃，在此之外查阅文献后发现还有一些色谱柱柱温设置为30 ℃，所以在确定色谱柱柱温时选择35 ℃和30 ℃作对比。
图3-7柱温的选择对照图
结果（见图3-7）发现两个柱温下的化学成分有较小差异，而且柱温为30℃时的峰型显示异常，不符合指纹图谱建立的要求。因此选择35℃作为分析柱温。
3.2.7检测时间选择
检测时间的长短也是影响指纹图谱建立的因素，检测时间较短有助于快速检测普洱茶样品中物质，提高分析效率，而在尽可能获取较多化学成分后缩短检测时间更有利于指纹图谱的建立，所以在此条件下先进行检测时间的选择。在前面几个确定检测条件下延长时间到60 min以得出的色谱峰峰型来评判检测时间。
图3-8检测时间的选择图
图3-945min后100%甲醇洗脱图
注：图中序号代表试验次数
当把洗脱时间设置到60 min时显示在45 min后无化学成分峰（见图3-8），而且在45 min后用浓度为100%的甲醇洗脱后也无强吸收峰（见图3-9），所以由此确定检测时间为45 min。
3.3不同年限不同批次普洱茶指纹图谱的建立
确定最佳检测条件的后，将19个批次的普洱茶样品按照2.5.2中普洱茶供试液的制备来制备供试液，之后在岛津高效液相色谱仪器上按2.4中设置的色谱条件进行普洱茶供试液分析，再将各个批次普洱茶的色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)版》，再建立不同年限不同批次普洱茶指纹图谱（图3-10，图中S1对照指纹图谱，其余顺序均对应表2-3中各批次顺序）并采用平均数生成法生成对照谱图（图3-11）。
图3-10不同年限不同批次普洱茶指纹图谱
注：S1为对照指纹图谱；其余均对应表2-3中各批次顺序
图3-11不同年限不同批次普洱茶对照谱图
在相似度评价软件中得出了不同年限不同批次普洱茶指纹图谱和对照谱图，但是不能对共有峰进行确定，所以借助了《中药色谱图分析和数据管理系统》标注共有峰。将高效液相色谱AIA数据导入《中药色谱图分析和数据管理系统》中。采用多项式最小二乘拟合平滑法消除噪音，自动校正基线。然后以生成的对照谱图为参照图谱，设置好匹配点后进行自动匹配得出不同年限不同批次普洱茶共有峰。
图3-12不同年限不同批次普洱茶共有峰图
注：从下往上除第1条对照指纹谱图；其余均对应表2-3中各批次顺序，从左往右依次为1~33号共有峰结果发现19个不同年限不同批次普洱茶有33个共有峰（图3-12）。
3.4不同年限不同批次普洱茶指纹图谱相似度评价
将生成的对照谱图和各批次普洱茶HPLC色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)版》，以对照谱图为参照谱，采用平均数方法自动匹配后进行相似度评价，结果见表3-2。
表3-2不同年限不同批次普洱茶相似度
(The similarity of different years and different batches of Pu'er Tea)
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S1 1.000 0.989 0.994 0.991 0.987 0.978 0.986 0.988 0.985 0.988 S2 0.989 1.000 0.995 0.995 0.975 0.961 0.979 0.977 0.971 0.976 S3 0.994 0.995 1.000 0.995 0.985 0.972 0.987 0.986 0.982 0.987 S4 0.991 0.995 0.995 1.000 0.98 0.969 0.984 0.982 0.977 0.981
S5 0.987 0.975 0.985 0.98 1.000 0.996 0.987 0.999 0.999 0.999 S6 0.978 0.961 0.972 0.969 0.996 1.000 0.98 0.997 0.997 0.996 S7 0.986 0.979 0.987 0.984 0.987 0.98 1.000 0.987 0.984 0.986 S8 0.988 0.977 0.986 0.982 0.999 0.997 0.987 1.000 0.999 0.999 S9 0.985 0.971 0.982 0.977 0.999 0.997 0.984 0.999 1.000 0.999 S10 0.988 0.976 0.987 0.981 0.999 0.996 0.986 0.999 0.999 1.000 S11 0.991 0.981 0.989 0.985 0.996 0.992 0.988 0.997 0.996 0.997 S12 0.99 0.979 0.988 0.984 0.997 0.993 0.987 0.997 0.996 0.997 S13 0.988 0.975 0.987 0.982 0.998 0.996 0.986 0.998 0.998 0.999 S14 0.989 0.978 0.988 0.983 0.999 0.995 0.987 0.999 0.999 1.000 S15 0.985 0.994 0.992 0.99 0.966 0.949 0.975 0.968 0.961 0.968 S16 0.995 0.99 0.996 0.992 0.994 0.986 0.989 0.995 0.992 0.995 S17 0.994 0.99 0.995 0.991 0.995 0.987 0.989 0.996 0.993 0.996 S18 0.988 0.976 0.986 0.981 0.998 0.994 0.986 0.998 0.998 0.999 S19 0.994 0.986 0.993 0.989 0.998 0.992 0.991 0.998 0.997 0.998 S20 0.997 0.659 0.975 0.657 0.986 0.981 0.998 0.995 0.986 0.998 注：S1为对照指纹谱图；其余均对应表2-3中各批次顺序
续表3-2不同年限不同批次普洱茶相似度
(The similarity of different years and different batches of Pu'er Tea)
S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S1 0.991 0.99 0.988 0.989 0.985 0.995 0.994 0.988 0.994 0.997 S2 0.981 0.979 0.975 0.978 0.994 0.99 0.99 0.976 0.986 0.659 S3 0.989 0.988 0.987 0.988 0.992 0.996 0.995 0.986 0.993 0.975 S4 0.985 0.984 0.982 0.983 0.99 0.992 0.991 0.981 0.989 0.657 S5 0.996 0.997 0.998 0.999 0.966 0.994 0.995 0.998 0.998 0.986 S6 0.992 0.993 0.996 0.995 0.949 0.986 0.987 0.994 0.992 0.981 S7 0.988 0.987 0.986 0.987 0.975 0.989 0.989 0.986 0.991 0.998 S8 0.997 0.997 0.998 0.999 0.968 0.995 0.996 0.998 0.998 0.995 S9 0.996 0.996 0.998 0.999 0.961 0.992 0.993 0.998 0.997 0.986 S10 0.997 0.997 0.999 1.000 0.968 0.995 0.996 0.999 0.998 0.998