大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化

实验原理

处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。

主要试剂

(1)0.1mol/L CaCl2溶液

(2)LB液体培养基

(3)30%甘油:30mL甘油溶于100mL蒸馏水,高压灭菌。

主要设备

(1)超净工作台

(2)冷冻离心机

(3)恒温摇床

(4)-70℃冰箱

(5)10mL移液管

(7)1mL、200μL移液枪(配套枪头)

(8)50mL 离心管

(9)1.5mL离心管

实验材料

(1)大肠杆菌DH5α(R-,M-,Amp-)

实验步骤

(一)受体菌的培养

(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3~5mL LB液体培养基中,37℃下振荡培养过夜(12h左右)。

(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种,取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中,37℃振荡培养2~3h至OD600=0.5左右。

(二)感受态细胞的制备

(注意:以下操作在超净工作台完成。)

(1)将菌液转入50mL离心管中,冰上放置10min。

(2)在4℃下,4000r/min离心10min。弃去上清,将管倒置1min以便培养液流尽。

(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞,冰上放置30min。

(4)0~4℃4000r/min离心10min,弃去上清,加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置(务必冰上放置)。

(注意:以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备)

(三)感受态细胞的分装与冻存

(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油(即1:1体积,甘油终浓度15%)。

(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管),液氮速冻,快速转入-70℃冰箱保存。(如果没有液氮,可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。)

注意事项

⑴、细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接,及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株,OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

⑵、试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃。

⑶、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

⑷、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。

CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 原理: 转化(Transformation):将外源DNA分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性状。 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株,不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-),可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法,如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高,成为感受态细胞(Compenent cells),使外源DNA分子得以进入。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法,RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入无菌甘油至总体积15%,于-70℃保存半年之久,因此CaCl2法为使用更广泛。 准备: 1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油(可用0.1mol/L CaCl2和30%甘油等体积混合) 混合溶液,高温高压灭菌; 注:CaCl2必须为分析纯以上。 2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净, 高温高压灭菌; 注:最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。 3、受体菌的培养:从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基 ( )中,37℃振荡培养过 夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注:培养时间不宜超过2.5小时,否则不能达到最高转化效率。 实验步骤: 1、细菌的收获:培养液冰浴5分钟后,4℃5000g离心5分钟。 注:(1)冰浴时间不要超过10分钟;(2)或者4℃8000g离心2分钟,速度太快或时间太长对细菌状态不利,并且不利于下步洗涤。(3)若出现很多黑色沉淀(细菌碎片),说明有多量细菌死亡,此时细菌状态并不好,但若只有少量黑色沉淀,或对转化效率要求不高,亦可继续进行。 2、用预冷的去离子水洗涤沉淀,4℃5000g离心5分钟。 注:(1)洗去细菌碎片和残留的培养液;(2)洗涤时间宜短不宜长。 3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分 钟,4℃5000g离心5分钟。 注:此时可见细菌沉淀为白色,体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。 4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感 受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

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大肠杆菌感受态细胞的制备 标签: tr..,Ca..,co.. 分类:细胞技术> 感受态细胞 来源: 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2 法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经 CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体 中,一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转 以移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,摄取外源 DNA 。 转化( Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种 手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (R-,M- ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些 特殊方法(如电击法, CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞( Compenent cells )。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant ,即带有异 源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和 RbCl(KCl) 法,RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可 以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70 ℃保存(半年),因此CaCl2 法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB 液体培养基

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。 4、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。 7、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时,可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验,也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化,活细胞数务必少于108个细胞/mL,对于大多散大脑杆菌来说,这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高,可每隔15-20 min测定OD600值来监测,用监测的时间及OD值列一个图表,以便预测培养物的OD600值到0.4的时间,当OD600值达到0.35时,收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间,OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大,因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值,并

常见大肠杆菌感受态的特点和用途

1:DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1 2:BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3) 3:BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLysS ,Camr 4:JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株 基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15] 5:TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型:F- ,mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC),φ80 ,lacZΔM15,△lacⅩ74,recA1 , araΔ139Δ(ara-leu)7697,galU ,galK ,rps,(Strr) endA1,nupG 6:HB101菌株 该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验 基因型:supE44,hsdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1 7:M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶,前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基,后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm,从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割,如FbaI和MboI等,一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割,而有些会影响,如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列,以XbaI为例,只有在位点序列旁出现GA或TC,该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法: (1)选用上述酶的同功酶,如Sau3AI,DNA识别切割位点与MboI相同;但不受甲基化影响; (2)利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备,如E.coli JM110和链霉菌等,前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出,而后者细胞内本就没有甲基化酶,从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8:E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响,需要用特定的dam-,dcm-的菌株,如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒,则不会被甲基化.

感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)

感受态细胞的制备(DH5α) 一、准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机(50ml离心管),37℃恒温箱,37℃摇床,超净台(使用前需要紫外消毒15min 至少);0.22μm的滤器2个(过滤灭菌TfB2种溶液),10ml注射器2个;冰盒;高压灭菌的1.5mlEP管1盒,与离心机配套的50ml离心管6个(高压灭菌),高压灭菌的500ml 锥形瓶2个,高压灭菌的100ml玻璃瓶2个,高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制(甘油特别难吸,用蓝枪头慢慢吸吧) ① LB平板:单纯LB平板,加有amp或有kana的(制板时需标注好类型,时间)。 ② SOB培养基(Super Optimal Broth) ③ TfBⅠ:(100ml制备量)分别称取乙酸钾0.294g,MnCl2 0.99g,KCl 0.146g,CaCl2 0.111g,置于200ml烧杯中,加入15ml甘油和85mlDDW,摇晃,使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液,置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中,4℃保存,使用前必须预冷。(装在50ml离心管,封口4度保存) ④ TfBⅡ(20ml制备量,每次现用现配,装在50ml离心管):分别称取MOPS 0.046g,CaCl2 0.167g,KCl 0.015g,置于50ml烧杯中,加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃,使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液,使用前必须预冷。

配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。(50ml离心管分装) 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后,定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。(50ml离心管分装) 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后,定容至100 ml,高温高压灭菌。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液,加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块,调节pH值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后,4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 3.滴加固体NaOH,调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后,4度保存。

实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备(新)

实验三大肠杆菌感受态细胞的制备 【课前预习】 1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么? 2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法? 【目的要求】 1、了解感受态细胞生理特性及制备条件; 2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法; 【基本原理】 所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。 基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,虽然对其基本原理仍然不完全清楚,但是比较认同的看法是,细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂繁殖,重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出阳性细菌转化子。Ca2+处理的感受态细胞,一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小,转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。CaCl2转化法的优点是:简单快速,重复性好,菌株适用范围广。 另外,电击法也可用于转化过程,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依赖短暂的电击,利用瞬时高压电流(数千伏特)处理细胞悬浮液,使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化,产生微孔,悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部,转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存(有效

大肠杆菌感受态

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。本实验室一般用TSS法制备感受态。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外

高效感受态细胞的制备

感受态细胞的制备 一、实验原理 受体细胞通过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,MnCl2,MgCl2等化学试剂法)的处理后,使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的状态,成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。 二、材料及准备工作 一)材料准备

二)试剂配制 1、液体LB培养基(200ml,高压灭菌,4℃保存备用) 蛋白胨 2.0g 酵母提取物 1.0g 氯化钠(NaCl) 2.0g 2、固体LB培养基(2×100ml,高压灭菌) 蛋白胨2×1.0g 酵母提取物2×0.5g 氯化钠(NaCl)2×1.0g 琼脂粉2×1.5g 温度降低到45℃后(不烫手),取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml(100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄)后铺平皿,另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液(100ml)(有效期2周) 聚乙二醇(PEG8000)10g 终浓度10% DMSO 5ml 终浓度5%

MgCl2(1mol/L)5ml 终浓度50mmol/L LB 85ml 终浓度85% 去离子水补足100ml,0.22μm过滤器过滤后,4℃保存备用 注:聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液(10ml)(可-20℃长期保存备用) KCl(2mol/L) 2.5ml CaCl2(1mol/L) 1.5ml MgCl2(1mol/L) 2.5ml 水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后,4℃保存备用(不要高压消毒) 5、氨苄青霉素(amp)(100mg/ml) 取0.5g氨苄青霉素,溶解于5ml去离子水中,0.5ml分装,-20℃ 保存备用 三)仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化(原理) 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存(有效期6个月)。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内,使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法),该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase(DNA酶)的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化。

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37℃,180rpm培养过夜。 [让菌复苏,进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37℃250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变 GAGGAGAGGAFFFFAFAF

异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中,冰浴10min,4000rpm 4℃离心10min,弃上清。(将所有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中,轻吹,4℃30min,4000rpm离心5min弃上清。 [ 细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA),经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。(一定要轻吹,这时细 胞壁打开,十分脆弱)] GAGGAGAGGAFFFFAFAF

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主(受体细胞)使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态:即指受体或者宿主最易接受外源DNA 片段并实现其转化的一种生理状态,是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一,如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素 ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体,我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细 胞内。制备出感受态的细胞,我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中,使其繁殖,就能 获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时,我们能掌握大肠杆菌感受态细 胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中,37C, 180rpm培养过夜。[让菌复苏, 进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中,37C 250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数,以减少菌的变异。] 3取培养物置于40m L的灭菌离心管中,冰浴10min , 4000rpm 4C离心10min,弃上清。(将所 有上清倒光,可以将离心管倒过来) [使细菌的生长停止,代谢减慢。因为这时已经没有培养基了,如果细菌仍有很高的代谢效率,则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2中,轻吹,4 C 30min , 4000rpm离心5min弃上 [细菌处于0度,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基 -钙磷 酸盐混合物黏附于细胞表面(羟基来源于细胞壁上的糖,磷酸来源于DNA ),经短时 间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。(一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中,轻吹,用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂,以致大量细胞死亡。 (一定要轻吹,这时细胞壁打开,十分脆弱)] 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒,冰浴30 min受体菌:感受态细胞100uL, 加入2 uL 无菌双蒸水阴性对照:0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 [第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性;第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶 液和pET-21a质粒未被污染。][冰浴是为了降低细胞代谢率,防止细胞大量死亡。] 7热激42度,90s 【在低温处理后,热激,可以使细胞壁热胀冷缩,再低温,使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB, 37 C复苏1h 【用LB复苏细胞,使细胞恢复活力,从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因,只有这样才能使 转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(短节西林)的LB培养基上铺平板,将平皿放置 37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜,出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落,而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落,这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效,长出了转化为成功的菌 落。用短节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解,所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活,所以应等到LB600C时(热而不烫),加入抗生素。】

大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化解析

一、目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法,了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。 二、原理 (一)大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子 的感受态细胞。在细菌中,能发生感受态细胞是占极少数。而且,细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说: 1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有: (1)发芽的芽孢杆菌容易转化; (2)大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化; (3)适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点,使DNA分子能进入细胞。证据是:(1)蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;

(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论,但是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1776菌株的转化结果,认为: 近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来的水平。 (二)重组DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞,接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞,使受体菌具有新的遗传特性,并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α,必须不同外来DNA分子发生遗传重组,通常是rec基因缺陷型的突变体,同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷(rk- mk- rec-)同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感(Ap)。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素(Ap)基因存在,当它导入受体细胞后,就赋于这些受体细胞新的特性,即Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ,我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ,使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期:2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中,首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中,感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中,0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变,此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器:超净工作台,恒温摇床,冷冻高速离心机,高压灭菌锅,冰箱,70℃超低温冰柜,分光光度计,接种针,10ml 试管,50ml 离心管,1.5ml 离心管,冰浴,微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌,灭菌条件:120℃,15分钟。 材料:土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂: YEB液体培养基(1升):酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖5g, MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0,高压灭菌; 链霉素(Sm)储液:125mg/ml 0.15 N NaCl,高压灭菌。 20mM CaCl2,高压灭菌。

四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基(含Sm 125mg/l)中,28°C振荡培养过夜; 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中,28°C振荡培养至OD600为0.5; 3. 5000rpm, 离心5min; 4. 加入10ml 0.15N NaCl,使农杆菌细胞充分悬浮,5000rpm, 离心5min; 5. 弃上清,置于冰上,加入1ml预冷的20mM CaCl2,充分悬浮细胞,冰浴中保存,24小时内使用,或分装成每管200ml,液氮中速冻1 分钟,置70°C保存备用。 一.农杆菌感受态细胞的制备 二.双元载体转化农杆菌EHA105 三.杆菌转化子的鉴定 A.农杆菌转化子的PCR鉴定 B.农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词:农杆菌感受态细胞转化子 一.农杆菌感受态细胞的制备(同大肠杆菌质粒DNA的提取),然后将其转化大肠杆菌,再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线,28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM(0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0)液体培养基中,220rpm, 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中, 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管,5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min, 4℃下,5000g离心5min,去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液,轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二.双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30min;-70℃放置10min ;取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min;冰浴2min;加入800μl YM液体培养基,28℃,175rpm摇培3hr;取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上,28℃培养到形成单菌落。

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 【实验目的】 法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 掌握用 CaCl 2 【实验原理】 常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌,首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。 受体细胞经一定方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。 【材料和试剂】 溶液、75%的甘油(以上试DH 5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl 2 剂均需高压灭菌) 【仪器设备】 振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头及微量移液器等 【实验步骤】 1、将 1ml新鲜的16h过夜培养物,转到 100ml LB培养基中。于 37℃振荡摇 =0.314。 匀 3h(旋转摇床200~300r/min),测量 OD 600nm 2、在无菌条件下,将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的Eppendorf管中,在冰上放置10min。 3、于 4℃用 4000r/min 离心10min。 4、弃去上清液,将 Eppendorf管倒置 1min,使残留培养液流尽。 溶液重悬细胞,合并两管,冰浴10min。 5、各加 150μL冰预冷的 0.1mM CaCl 2 6、于4℃用 4000r/min离心 10min。 7、弃上清,将 Eppendorf管倒置 1min,使残留的痕量培养液流尽。 溶液重悬细胞,再加入 25μL预冷的8、先加入 800μL冰预冷的0.1M CaCl 2 75% 的甘油,之后于 -80℃贮存备用。 【注意事项】 1、制备过程均需在低温(4℃)下进行,应尽量避免处理的细胞升温或于室温

实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化

实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象,一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变,这种现象叫做转化,获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中,所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞,表达相应的选择标记基因,并在一定的培养条件下,在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内,才能进行扩增和表达,从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作,如亚克隆等;或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞(competent cell)。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态,而另一些细菌只有处于某个生长时期时(一般为对数生长早、中期),才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强,从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法,通过瞬间的高压电流,在细胞上形成孔洞,使外源DNA进入胞内,从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级,达到1 x 108转化子/μg DNA,甚至1 x 109转化子/μg DNA,所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术,大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌,本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1.LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中,另各取3mL装于2只大试管中,其余装于装于500mL三角瓶中,121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2.LB/Amp/IPTG/X-Gal平板(1): 配1L LB液体培养基,加入20g琼脂粉和1支搅拌棒,同上高压灭菌,趁热取出置搅拌器上冷却,待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板,每皿倒约15 mL,室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG,涂匀,待这两种化合物渗入琼脂后,即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个,LB/Amp 平板5个,LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3.IPTG储存液(0.1mol/L):1.2g IPTG加水至50ml,过滤除菌,4℃储存。 4.X-gal储存液:50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中,过滤除菌,4℃储存。 5.1 mol/L CaCl2储存液,使用浓度为0.1mol/L,CaCl2应使用分析纯,配100mL,高压灭菌,全班用。6.甘油(灭菌),全班50mL,同上高压灭菌。 7.酸洗无菌玻璃珠,涂布平板用,用50mL三角瓶分装,同上高压灭菌,烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等

大肠杆菌感受态的制备

大肠杆菌感受态的制备 原理: 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞,可以诱导其产生短暂的“感受态”,易于摄取外源DNA。转化效率为106 ~107转化子/μg DNA。 材料: Top10、pcDNA3.0, TB buffer(现用现配)、超纯水、碎冰。 LB液体培养基200 ml(不含AMP)、LB固体培养基(含AMP)、LB 固体培养基(不含AMP) 10ml圆底离心管(玻璃或塑料)、100ml锥形瓶、2.0 ml离心管、各型号枪头, 刻度移液管均需灭菌处理 甘油:100ml (高压灭菌) 氨苄(母液100mg/ml,终浓度为100ug/ml):1ml母液需氨苄100mg 过滤除菌。 仪器:滤器、0.22um微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。 步骤:1)从冻存的E.coli.Top 10, 划线接种至LB固体培养基(不含AMP). 37℃培养O/N, 16h左右。 2) 从新活化的E.coli.Top 10菌平板上挑取一单菌落,接种与 2ml LB液体培养基(10ml圆底离心管)中,37℃振荡培养 O/N, 16h左右。备注: E.coli. Top 10, 20%无菌甘油, -70℃保 存。

3)将该菌悬液以(400UL)1:100~1:50转接于20 ml LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液明显混浊后,2.5~3小时后测一次OD(600nm),至OD600nm≤0.6时停止培养. 摇菌期间, 配TB buffer,开制冰机。TB buffer置于冰上预冷 (20~30分钟). 低温离心机预冷(20~30分钟) 以下步骤需在超净工作台和冰上操作; 4)细菌置于冰上,10min。 5)取12管, 1.5 ml细菌培养液3000 g 4℃离心5min,弃上清。 6) 每管加200 ul 预冷的LB,轻轻混匀, 均成2管, 置冰上20~30分钟,3000 g 4℃离心5min,弃上清。 备注:5)和6)是为浓缩细菌. 细菌置于冰上,10min。 7)每管加1 ml 预冷的TB buffer,轻轻混匀,置冰上20~30分钟。 8) 3000 g 4℃离心5min,弃上清。 重复7)和8) 9)加入50 ul预冷的TB buffer,不要重悬或轻轻重悬,置4℃ 过夜备用。提高转化效率吗? 10) (可选)添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后, 超低温冷冻贮存备用(-70℃) 转化 1.50ul感受态+1ul质粒 2.冰浴30min。此时打开水浴锅预热。

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