猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合_曾巧英
中国农业科学 2005,38(4):821-825 Scientia Agricultura Sinica
收稿日期：2004-02-24
基金项目：国家“973”资助项目（G1999011906） 作者简介： 曾巧英（1968-），女，副教授，博士，主要从事畜禽病原微生物的分子致病机制及防制研究。Tel ：0931-*******; Fax: 0931-*******; E-mail ：
zqyziyi@https://www.360docs.net/doc/e81509275.html, 。陆承平为通讯作者, Tel/Fax: 025-*******；E-mail: lucp@https://www.360docs.net/doc/e81509275.html,
猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合
曾巧英
1，2
， 陆承平1
(1南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，南京 210095； 2甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）
摘要：猪链球菌2型（SS2）主要引起人和猪的脑膜炎，但其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)对构成血脑屏障的微血管内皮细胞有何致病作用迄今不明。为此分离仔兔脾微血管内皮细胞（SMEC），纯化后用SV40-T 抗原转化后用作试验的细胞模型。将单层SMEC 和电泳纯MRP 溶液共孵育，染色后，光镜观察，发现MRP 可诱导SMEC 发生两种典型形态学变化：致密细胞单层中出现巨大空洞而呈网状；空洞内有细胞融合，形成多核巨细胞，随后巨细胞核极度浓缩释出，巨细胞消失。研究结果表明， MRP 单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。
关键词：猪链球菌2型；溶菌酶释放蛋白；细胞融合；细胞凋亡；血管内皮细胞
Fusion of Microvascular Endothelial Cells Induced by
Muramidase-Released Protein of
Streptococcus suis Type 2
ZENG Qiao-ying 1, 2，LU Cheng-ping 1
( 1Key Laboratory of Animal Disease Diagnostic and Immunology, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095；2College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070 )
Abstract: Streptococcus suis type 2 (SS2) mainly causes meningitis of human and pigs. Muramidase-released protein (MRP) is one of the key virulence factors of SS2. However ，the pathogenic effects of MRP on microvascular endothelial cells (MEC) which makes up of brain blood barrier (BBB) is unknown to date. So the spleen microvascular endothelial cells (SMEC) from neonatal rabbit were isolated, purified, immortalized by SV40-T antigen, and used as cell model in present study. After co-incubation with electrophoretically purified MRP, two principal morphologic changes of SMEC confluent layer were revealed by light microscopy. Firstly, the confluent cell layer turned into a riddle-like structure full of giant hole. Secondly, cells were fused into syncytia which scattered in the hole, containing 10～30 nuclei. The nuclei were then released from the syncytia after an extreme condensation. And finally, the syncytia disappeared. Results of present study suggest that MRP alone is sufficient to destroy the brain blood barrier.
Key words: Streptococcus suis type 2; Muramidase -released protein; Apoptosis; Cell fusion; Microvascular endothelial cells
猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2, SS2）是重要的人畜共患病病原体，主要感染人和仔猪，实验动物中，豚鼠、Balb/c 小鼠和兔均易感[1]。典型症状是脑膜炎，亦有败血症及突发性死亡，人感染后，即使在早期给予大剂量抗生素治疗，亦不能避免耳聋、失明、运动失调等严重的神经性后遗症的发生[1,2]，故引起世界范围内对该病的高度重视，SS2引致脑膜炎的机制一直是研究的焦点。SS2引致脑膜炎，需和构
成大脑血脑屏障（brain blood barrier, BBB ）的脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells ，BMEC ）和脉络丛上皮细胞直接作用，国外已采用多种细胞模型在细菌细胞水平上研究了SS2和两类细胞的相互作用，如人源BMEC 、静脉血管内皮细胞（HUVEC ）和主动脉血管内皮细胞（HAAEC ）、人肺癌A549、人宫颈癌HeLa 、 狗肾MDCK 、猪肾PK-15及猪肾 LLC-PK1[1,2]，结果是，SS2只能黏附不能侵
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袭或侵袭力极低，仍不能解释SS2穿越BBB的机制。136kD的溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein，MRP）是SS2的胞壁大分子糖蛋白，是SS2重要的毒力因子[1,3,4]，究竟MRP在SS2的致病过程中对微血管内皮细胞（MEC）有何作用，尚未见报道。因此，本试验分离、纯化、并用SV40-T抗原转化仔兔脾微血管内皮细胞（spleen microvascular endothelial cells，SMEC），以此为细胞模型研究MRP 对MEC的作用，旨在从细胞水平上探明SS2致脑膜炎过程中，MRP对大脑血管内皮细胞的作用。
1 材料与方法
1.1 仔兔SMEC的分离培养
1.1.1配制细胞消化液用纯水配制100 mg·ml-1 collagenase/dispase （Bolinman）储存液，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。试验前用RPMI1640基础液稀释至终浓度为1mg·ml -1的工作液，并加入终浓度为10 μmol·L-1 Ca2+，50 mmol·L-1 Hepes （pH7.4），20 U·ml -1 DNaseI （Bolinman），0.15 μg·ml-1 TLCK （Sigma）。
1.1.2配制细胞营养液在RPMI1640基础液中加入10%新生犊牛血清（NCS）、5%胎牛血清（FBS）（Gibco）、100 U·ml -1青霉素、100 μg·ml -1链霉素， 100 μg·ml -1的内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth factor, ECGF, Sigma），5 μg·ml -1的胰岛素，即为完全营养液。
1.1.3 SMEC的分离及纯化取10日龄仔兔（江苏省农科院实验动物中心，新西兰白兔，清洁级）的脾，置RPMI1640（Gibco）基础液中洗涤，剪碎，加入适量细胞消化液，置37℃酶解1～2 h，收集单细胞，用完全营养液稀释，接种于经鼠尾胶原包被的24孔细胞培养板，细胞密度为2×104～5×104个细胞/孔，置5% CO2、饱和湿度、37℃培养，并机械法和酶差异消化法除去少量成纤维细胞，纯化SMEC。纯化后培养于6孔细胞板，2×105个细胞/孔，90%满度时，用基础营养液洗涤后，待加质粒DNA转化。
1.1.4BVEC的转化带有绿色荧光蛋白标记的SV40-T抗原穿梭表达质粒pCR3.1系南京医药科技大学朱建中副教授惠赠。用Maxi质粒提取试剂盒（Promega）按其说明提取纯化，取10～20 μg质粒DNA溶于100 μl RPMI1640基础液中，取20 μl脂质体稀释于80 μl RPMI1640基础液中，混匀，置室温15 min后，轻轻滴加在细胞上，培养18 h后，弃去转染液，换上完全营养液继续培养。72 h后荧光显微镜下进行检测。
1.2 MRP对SMEC的作用
1.2.1 MRP的提纯 SS2江苏分离株HA9801（MRP+）系姚火春等分离并保存[5]。大量培养HA9801，离心收集菌体，超声波裂解后提取细胞壁，用溶菌酶降解细胞壁后得MRP粗提物，后者经制备电泳仪（the rotofor system, BIO RAD）制得电泳纯MRP[6]，用0.1 mol·L-1 PBS（pH7.4）配制成0.4 mg·ml-1的原液，用0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃储存。
1.2.2MRP对SMEC的作用及光镜观察用RPMI1640完全营养液稀释MRP原液制成40 μg·ml-1工作液，给未长满和长满单层的SMEC（内置飞片）换上MRP溶液，置37℃分别孵育5、8 h（未满单层）和5、8、12、18 h（致密单层），到设定时间后，夹出飞片，PBS充分洗涤，用甲醇∶冰乙酸（3∶1）固定，Giemsa染色，镜检。用RPMI1640完全营养液同倍稀释配制MRP原液用的PBS（0.1 mol·L-1， pH7.4）作阴性对照。
2 结果与分析
2.1 仔兔SMEC的初代分离、纯化和转化
培养第5天光镜观察，SMEC呈梭状，在ECGF 的选择作用下，杂细胞较少，从组织碎块周围呈放射状向外延伸（图1-A）。用差速贴壁法和差速酶消化法对其进行纯化，传三代即可纯化（图1-B）。转化后荧光显微镜检测细胞内有特异的荧光发生，（图1 -C），扩大培养后（图1-D）将此转化细胞用于以后的试验中。
2.2 MRP对仔兔SMEC的作用
光镜观察未长满单层的SMEC在MRP作用8 h 后有低度融合，未融合细胞变圆，所有细胞的细胞核均强嗜酸，染成鲜红色（图2-A）。正常的SMEC致密单层（图2-B）在MRP作用下发生两种典型变化：其一是致密细胞单层中出现巨大空洞，使单层呈网状结构。SMEC单层从MRP作用8 h开始，变得疏密不均，有空洞形成，作用12 h，空洞的边界变得非常致密而见不到清晰的细胞形态，着色呈深紫色（图2-C）。其二是空洞内的细胞融合形成多核巨细胞，所含细胞核数目10～30个不等，巨细胞呈现出程序性变化过程。早期巨细胞，中心空泡化，细胞核聚集在空泡周围（图2-D）；中期，细胞核整齐排列在空泡周围，
4期曾巧英等：猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合823
空泡中可见嗜碱性（深紫色）的团块物质，巨细胞边界清晰，花朵样或不规则，胞浆着色极淡，微嗜碱；晚期，巨细胞的核极度浓缩，从细胞中被有序释出，但胞浆无明显浓缩；最后，巨细胞消失，在原巨细胞的位置只留下深紫色的嗜碱性团块残迹（图2-E）。3 讨论
病原微生物和细胞的相互作用是细胞微生物学研究的核心内容，是研究微生物致病机制的必要手段。SS2致脑膜炎过程中需穿过BBB，所以，SS2
及其毒
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力因子对MEC的作用成为其致病机理研究的突破点之一。国外已在SS2细菌细胞水平上研究了其对上皮及MEC的黏附作用 [1,2]，但毒力因子MRP难以大量纯化，因此有关MRP对细胞的作用尚未见研究报道。
本研究首次发现，纯化的MRP可诱导MEC融合形成多核巨细胞，使细胞单层空洞化呈网状，此作用可彻底破坏本来致密的细胞结构，从而使其失去屏障作用。SS2穿过BBB引致脑膜炎有两条主要通路：BMEC构成的血-脑通路和由脉络丛上皮细胞构成的血-脑脊液通路。从本研究结果推断，血脑通路是SS2致脑膜炎时突破大脑屏障的机制和通路之一。
MRP亦能诱导上皮细胞的融合（一般含2～10个细胞核）和高水平凋亡，虽然融合没有MEC剧烈，但其发生比MEC早约4 h[7]，因此SS2致脑膜炎过程中，脉络丛上皮应是SS2最早的突破口，而脑微血管内皮细胞发生细胞融合导致的空洞化较晚，但却是导致BBB完全崩溃的第二个细菌通路。
MRP能同时诱导上皮和MEC发生融合和单层空洞化，表明MRP单独足以摧毁BBB，从而引致脑膜炎发生。MRP、细胞外因子（EF）和猪溶血素（suilysin）均被认是SS2的主要毒力因子[1~3]，临床上MRP＋EF－suilysin－表型菌株具有和MRP＋EF＋suilysin－、MRP＋EF＋suilysin＋相同的致病力[4,8]的事实佐证了此推论。而SS2对上皮和血管内皮细胞均只能高水平黏附而不能侵袭或侵袭力极低[1,2]的试验结果，和本试验结果也一致，结合二者即可解释SS2突破BBB的机制之一，即SS2需首先大量黏附于细胞表面，然后MRP诱导细胞融合和细胞单层的空洞化，彻底摧毁细胞屏障，直接进入大脑，此时它不需要通过侵袭细胞来穿越细胞屏障的复杂过程。但有些MRP－菌株，即MRP－EF＋suilysin－和 MRP－EF+suilysin+菌株亦具有和MRP＋菌株相同致病力的事实则又提示，在MRP－SS2菌株中，还存在其它突破BBB的未知机制。猪溶血素强大的细胞毒性直接导致细胞坏死，使细胞屏障破裂[1]；SS2在体内诱导细胞因子产生，后者又诱导细胞间隙增大[1]或诱导SS2的细胞侵袭力提高[1,9]，都是可能的机制。由此可见，SS2突破BBB具有多因素、多途径、多机制的特点。
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(责任编辑林鉴非)