种子真实性和品种纯度鉴定Gao

水稻种子的纯度鉴定

题目：水稻种子纯度鉴定 指导教师：刘开庆、郭丽红 学院：昆明学院 专业班级：生科系07生科班 学号：S007084111 姓名：田洁 日期：2009年7月1日 [摘要]植物的生长发育，除需要充足的阳光和水分外，还需要矿质营养，否则植物就不能很好的生长发育甚至死亡。应用溶液培养技术，可以观察矿质元素对植物生活的必需性；用溶液培养做植物的营养实验，可以避免土壤里的各种复杂因素。 [关键词]微量元素；矿质元素；植物 引言 种子纯度是评定种子等级的主要依据，是种子检验工作的重点项目。近年来，电泳技术在种子纯度鉴定上开始应用。

用该项技术鉴定简便，快捷，准确且成本低。本实验正是运用酯酶同工酶技术进行鉴定。 正文 一．实验原理 同工酶是指植物体内肽链结构不同，分子大小不同，但活化部位相同，催化同一生化反应的酶谱带是指同一种酶的各种同工酶。在一定的电场作用下发生泳动，通过一定的化学染色而出现的图像。一个品种的遗传基础是一定的，其同工酶谱带应具有一定的特征。本实验的基本原理是不同的酯酶同工酶由于其分子量不同，分子结构不同和其所带的电荷数不同，在凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下，呈现不同的泳动速度而相互分离，再根据酯酶同工酶催化反应和相同的特点，使用相同的特点，使用同一显色方法，获得供试样用品谱带，以供分析鉴别。 一.器材与试剂 1.试验仪器电泳仪，双垂直电泳槽及配套的平板玻璃，文具铁夹，冰箱，离心机，研钵，离心管，微量进样器，实验室常用器皿。 2.实验材料水稻种子 3实验试剂20%SDS ，30%Acr-Bis ，10%APS ，1.5mol/L Tris-HCl(ph=8.8) ，0.5mol/L Tris-HCl(ph=6.8 ，5*电极缓冲液，脱色液（200ml）*2 ，染色液（20 0ml），分离胶，浓缩胶分析天平， 三.实验步骤 1．样品提取 2．胶室的制作和凝胶的配制

第七章 田间检验与种子纯度的种植鉴定

第七章田间检验与种子纯度的种植鉴定 （本章属田间检验员专业技术知识） 本章讲4节：§1.品种特征特性 §2.田间检验 §3.田间小区种植鉴定 §4.种子质量纠纷田间现场鉴定 第一节田间检验及种子纯度种植鉴定依据的性状 （品种特征特性） 鉴定品种真实性和纯度，首先应了解被鉴定品种的特征、特性，来鉴别本品种和异品种。 品种性状可分为主要性状、次要性状、特殊性状和易变性状4类。 主要性状：指品种所固有的不易变化的明显性状，如小麦的穗形、芒长等。 次要性状(细微性状)：指细小、不易观察但稳定的性状。如小麦护颖的形状、颖嘴。 特殊性状：指某些品种所特有的性状。如水稻中的紫米（有籼粳之分）、香稻（气味）等。。 易变性状：指容易随外界条件的变化而变化的性状.如生育期(与积温有关：郑单958 95～120d)、分蘖多少（与种植早晚有关）。鉴定时应抓住品种的主要性状和特殊性状，必要时考虑次要性状和易变性状。 鉴定品种的具体性状都是依据器官的大小、颜色、形状等鉴定。 下面讲山东省大面积种植的主要农作物： 一、小麦（同p100） （一）．植株性状 1.芽鞘色：绿色和紫色（区分品种纯度明显的性状） 2.幼苗生长习性：匍匐；直立；半匍匐（冬麦越冬前观察）

3.幼苗颜色：淡绿、绿色、深绿色（分蘖盛期观察） 4.柱高：61～80cm为矮；81～100cm为中等；101～120cm为高秆。 5.株型：抽穗后根据主茎与分蘖的松散程度分为三类： 紧凑: 主茎与分蘖垂直夹角＜15℃ 松散：主茎与分蘖垂直夹角＞30℃。介于二者之间为中等。（二）．穗部性状 (1)穗长(cm不含芒)： 6.1～8.0为短；8.1～10.0为中等；10.1～12.0为长. （2）穗形：纺锤形（两头尖，中间稍大）；棍棒形（上大、下小）； 圆锥形（下大、上小）；长方形（上中下基本一致）； 椭圆形（穗短、中部宽、两端稍小）。 （3）芒：稃尖完全不延长为无芒。有直芒或曲芒为有芒。 （4）芒长：长芒＞40mm,短芒＜40mm. （5）穗粒数：＜25为少；26～35为中；36～45为多；＞45为特多。

琼脂糖凝胶电泳标准操作流程

琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA 、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA 分子的迁移速度不同。如环形DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA ）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA > IDNA >ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA 分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA 构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB ）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA 复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker （分子量标准）（TaKaRa）；D2000（TianGen）；

初探种子纯度检验方法

初探种子纯度检验方法 近几年来，随着生化分析和分子生物学技术的迅速发展，作物种子纯度检验方法已由外观形态发展到生理生化水平和分子水平上的鉴定。 一、蛋白质电泳技术检验法 是指利用电泳技术对备检样品的种子或幼苗的蛋白质 进行分离、染色，形成蛋白质电泳谱带的差异，并与标准品种相比较，从而鉴定品种的真实性和纯度的一种方法。不同作物品种，基因不同，基因的直接表达产物---蛋白质在种类、数量、结构等方面亦不同。该法即是利用蛋白质的多态性来反映不同品种DNA组成上的差异，从而进行品种鉴定。该法快速、可靠，不受环境影响。 1.种子贮藏蛋白电泳法种子中所含的贮藏蛋白质可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。每一类蛋白质的比例因物种而异，但在品种鉴定上多是根据醇溶蛋白（禾谷类）和球蛋白（豆类）的多样性。不同蛋白质所带电荷不同，在电场中泳动的速度也不同，电泳之后，通过染色显示蛋白质条带的数目、位置和颜色深浅，便构成品种的"指纹" 特征，可用于品种鉴定。所用电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉胶电泳及等电聚焦电泳等。另外，蛋白质电泳图谱易受

种子（或幼苗）发育阶段及表达器官的影响，有时不够稳定，影响了图谱分析，从而影响了鉴定结果的准确性。 2.同工酶电泳法同工酶是指来源相同，催化相同反应而结构不同的酶分子类型，具组织、发育和品种间特异性。该法是指利用电泳技术（包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉胶电泳等）来分离各种酶的同工酶，通过比较同工酶谱，来确定作物种子的纯度。目前，在作物种子纯度鉴定中，最常用的、多态性较强的是脂酶和过氧化物酶，所用方法多为聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 2.1同工酶具组织、发育的特异性：不同组织、不同发育时期，同工酶的数量和组成不同。利用同工酶鉴定种子纯度所用材料多为幼苗，而将种子萌发为幼苗不光费时，还往往因为种子在萌发进程上的不一致而导致检验结果偏差较大。 2.2因酶易失活，故技术上有一定难度。 2.3谱带位点与凝胶浓度、提取液配方、电泳程序等有关。 二、形态捡验法 形态学方法是检验人员借助放大镜、解剖镜等工具，依据某一作物品种不同于其他品种的特定的外观形态特征来进行鉴定的方法。 1.田间小区种植检验法（成株期形态检验法）该法是将

PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测

实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的

种子企业应用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度

利用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度在企业中的应用黄殿成1王飞2刘建功1,2 刘金海1 周关印1,2 李根源1 张西岭1 (1中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455001；2中棉种业科技股份有限公司，郑州450001) 中文摘要：本文阐述利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理，剖析中棉种业科技股份有限公司利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的实践过程，指出利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度在企业中发挥的作用。 品种真实性和种子纯度是种子质量最重要的指标。传统的通过田间小区种植利用形态特征鉴定种子纯度的方法，具有周期长、易受环境和人为因素影响、属于事后控制等缺陷，与种子企业需要快速检验结果的要求不相适应，难以有效消除种子企业的质量风险。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的技术逐步成熟，中棉种业科技股份有限公司（以下简称中棉种业）在利用分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度的反复实践中，逐步形成了自己的检验规程，在企业经营中发挥了较好作用。 1 利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理 生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列和散布重复序列。其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、串联排列而成的。目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成(如编码rRNA和组蛋白基因)；另一类是由无功能的序列组成。根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列不完全相同，可表现出多个位点的多态性。基于这一想法，人们发 1 基金项目：中国农业科学院科技创新工程项目，项目编号CAAS-ASTIP -201X-CCRI 通信作者：张西岭

第六章-品种真实性及品种纯度测定

第六章品种真实性及品种纯度测定 本章讲4节：§1、品种纯度检验的意义 §2、种子纯度的形态测定 §3、种子纯度的快速测定 §4、种子纯度的电泳测定 品种真实性(cultivar genuineness)和品种纯度(varietal purity)是构成种子质量的两个重要指标，是种子质量评价的重要依据。这两个指标都与品种的遗传基础有关，因此都属于品种的遗传品质。 品种纯度检验可分为田间检验、室内检验和小区种植检验3部分。本章主要介绍品种真实性及品种纯度的含义及室内常用的测定方法。 第一节品种纯度检验的意义 一、品种纯度的含义 品种纯度检验应包括两方面内容：种子的真实性和品种纯度。 在品种纯度检验之前，应先进行种子真实性鉴定，如果种子真实性有问题，品种纯度检验就毫无意义了。 1、种子的真实性：是指一批种子所属品种、种或属与文件描述(description)是否相符。这是鉴定种子样品的真假问题。 2、品种纯度：是指品种个体与个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数(或株、穗数)占供检验本作物样品数的百分率表示。 在纯度检验时主要鉴别与本种不同的异型株(off-type plant)。异型株:是指1个或多个性状(特征、特性)与原品种的性状明显不同的植株。 品种纯度检验的对象:可以是种子、幼苗(seedling)或植株。 因此，品种纯度检验可分为:田间检验、室内检验、田间种植鉴定。三者关系：以田间检验为主，田间检验与室内检验相结合，辅之田间种植鉴定。

二、品种纯度检验的意义（了解） 1、是保证品种优良遗传特性得以充分发挥的前提 研究表明，玉米种子纯度每降低1％，造成的减产幅度就会接近1％。在杂交稻种子生产中，亲本纯度每降低1％，制种田纯度就会下降6～7％，粮食生产就会减产l0％左右。 2、是正确评定种子等级、贯彻优种优价政策的主要依据。 玉米大田生产一般每穴播2粒；优质种子可单粒播种，如先玉335、郑单958等。 3、是防止品种混杂退化，提高种子质量的必要手段； 品种混杂、品种纯度降低，会明显降低作物产量和品质。品种纯度不高的种子播入田间后会导致作物生长发育不一致、植株高矮不齐、成熟迟早不同。种子纯度降低越多，影响产量的幅度也越大。 因此，品种真实性和品种纯度检验在种子生产、加工、贮藏及经营贸易中具有重要意义和应用价值。 在生产实践中，由于忽视种子真实性和品种纯度的鉴定，往往给农业生产造成不可弥补的损失。 （1）如杂交稻生产中，错把不育系当杂交种播种，造成颗粒无收。（2）刘恩训老师前些年搞玉米不育系育种，挂在墙上被人偷，结果不结粒。 （3）若把小白菜（青菜）当作大白菜播种，秋天就不结球。（4）倘若把生长期长的秋大白菜当伏菜种植，会出现因不耐热而 染病，且迟迟不能卷心，不能及早上市；反过来，倘若把伏菜当秋菜种植，就会出现早熟、产量低、不耐贮藏。（莱阳二蔬把伏菜当秋菜发，培了90 万）。 （5）若把耐旱小麦品种烟农18种在高肥水地快，会造成倒伏而减产；若把高肥水品种‘莱州137’种在旱薄地里，生物产量不够而减

琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段

实验十四琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段 一、原理 DNA分子在碱性环境中(PH8.3缓冲液)带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子质量及构型的不同在电泳时泳动的速率就不同，从而可以分出不同的区带。电泳后经gelview染色，在波长254nm紫外光照射下，单链DNA显红色荧光，双链DNA显绿色荧光。也可染RNA。 二、试剂： 1.琼脂糖 2.TBE缓冲液：0.89M Tris—0.89M H3BO3(硼酸)—0.02M EDTA，pH8.3；称取10.880 g Tris，5.520 g硼酸，0.740g EDTA·Na2·2H2O，溶于无离子水中，定容至200ml，用时稀释10倍。 3.溴乙啶贮存液：5g/L，纯水配制，不需消毒。贮棕色瓶于4℃保存。 4.DNA样品液：实验所提取的DNA或前面PCR产物 5.上样缓冲液：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝；或Loading buffer 6.无离子水 三、仪器： 微波炉，封口膜(胶)，电泳仪及槽，加样器、头(20ul)，紫外分析仪或凝胶成像仪 四、操作 1.制备琼脂糖溶液： 称取0.18克琼脂糖溶于30ml TBE缓冲液中，沸水浴或微波炉煮沸至琼脂糖完全溶解。将溶液冷却到60℃，加入gelview染料3ul(终浓度0.5μg/ml)。 2.制备凝胶板 用封口膜(胶)将凝胶槽缺口封住，置水平玻板或工作台面上，将梳子安放在槽的凹槽内，梳子底边须离开电泳架表面1mm左右。将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，胶厚约3mm，冷却30分钟。待胶凝聚后小心地取出梳子，将凝胶放入装有TBE缓冲液的电泳槽中，TBE缓冲液要浸没过凝胶面2mm-3mm。 3.加样 将样品(样品液∶上样缓冲液=5∶1)小心加入胶板的加样孔内，加样量不宜

玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法

辣椒种子纯度 SSR分子标记鉴定技术规程 编制说明 沈阳市农业科学院 2017年5月

《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》 标准编制说明 一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作； 2016年5月沈阳市农业科学院通过辽宁省农村经济委员会和沈阳市质量监督局向辽宁省质量技术监督局提交《项目建议书》，建议编制《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》标准。经审查及公示，项目被列入辽宁省地方标准制修订2017年度计划，立项编号为2016073，沈阳市农业科学院为项目承担单位。 项目立项后，项目承担单位成立了标准起草小组，落实了标准起草经费，提供了必要的工作条件。标准起草小组的成员有：杨双、张曼丽、刘延斌、李金凤、马东梅、潘菊、胡颖、孙嘉兴、李雪、宋伟。杨双为技术总负责；李金凤、马东梅负责标准样品收集；潘菊、胡颖负责技术资料检索；刘延斌、孙嘉兴、李雪负责标准技术参数确定。标准起草小组在批准立项的一个月内制定了具体的标准起草计划。按照计划，2016年12月前完成资料收集、相关调研及试验验证；2017年4月聘请省内农业专家对征求意见稿进行修改；5月完成意见整理、分析和处理，填写地方标准征求意见汇总表；5月申请专家审查。 二、标准编制原则和确定地方标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则）的依据。地方标准修订项目，还应列出和原标准主要差异情况；

辣椒(Capsicum annuum L.)是辽宁省八大蔬菜作物之一，省内广泛种植，随着辣椒杂交种的种植面积不断扩大，种子纯度问题显得尤其重要。在辣椒制种过程中，无论使用两系杂交或者三系杂交，杂交一代种子中易于混入母本种子。由于亲本的生产力弱，产量低，纯度不够的种子对辣椒生产造成影响。在辣椒生产过程中，常常出现因种子纯度不高造成产量降低、品质变劣，商品性不好，严重影响经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度检测工作显得尤其重要。目前鉴定辣椒种子纯度一般采用田间种植或室内酯酶同工酶电泳等方法，这些方法虽简便易行，但田间种植仅靠形态观察较难做到准确判断，且耗时长，同工酶检测也会因环境和发育时期而发生变化，导致电泳结果不易判读。建议制定基于DNA多态性，依托SSR分子标记技术，具有快速、准确、易操作等特点的鉴定辣椒种子纯度技术规程，适用于省内主栽的辣椒品种的纯度鉴定，提高商品种子质量，为质量监督管理部门提供参考，同时也为辣椒品种指纹图谱的建立和品种知识产权的保护打下基础。 SSR（Simple Sequence Repeat）是一类由几个（多为1-6个）碱基组成的基本单元串联重复形成，广泛存在于真核生物的基因组中。由于个体基因组中每个SSR位点的重复单元在数量上存在多态性，可用于鉴别不同个体。基因组中这些SSR位点的侧翼DNA片段通常都是保守性较强的单一序列，可以根据侧翼的DNA片段的碱基序列设计引物，进行PCR扩增，将单个SSR位点扩增出来。不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生多态性，可用来鉴别不同个体。

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取： 质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。 （1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理： 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。 （2）四种溶液作用及原理： ①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 ②Solution II的作用：提供碱性条件，pH高达12.6，使大肠杆菌瞬间裂解，促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、核膜发生破裂，充分溶解膜蛋白。同时，磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III的作用：为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分离开来；另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性，使pH降至中性，因为长时间的碱性条件会打断DNA；基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA 的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA

琼脂糖凝胶电泳实验报告

实验一：琼脂糖凝胶电泳对DNA提取 实验目的：学习使用水平式琼脂糖凝胶电泳进行DNA的提取。 实验原理：琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用生物染料嵌入DNA分子后在紫外下显色。 1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖——磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。 2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。 3）生物染料在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，生物染料从正极向负极移动，就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在生物染料足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。 实验材料：微量移液器(2μl和4μl)，高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉等。TAE电泳缓冲液，琼脂糖凝胶，PCR 扩增样品 实验步骤： 1胶液的制备：称取琼脂糖,置于200ml锥形瓶中, 加入20ml TAE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，沸腾。取出摇匀。加热时应盖上封口膜, 以减少水份蒸发。 2胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子。 3向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中小心地倒入胶槽内, 使胶液形成均匀的胶层。检查有无气泡。 4室温下约20分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，注意不要损伤梳底部的凝胶，清除碎胶。将凝胶放入电泳槽中。 5加入电泳缓冲液（TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。

玉米种子纯度检验技术

种子纯度检验是质量检验的中心，是对一批玉米种子中个体与个体之间在特征特性方面典型一致性程度的检验和种子真实性的鉴定。一般有田间检验、室内检验和种植检验三种。 1.品种纯度田间检验 田间检验是三大检验的重中之重。种子质量的高低主要是在田间生产过程中形成的，做好制种田间检验对于确保种子质量显得格外重要。要想做好田间检验，要做到以下几点： ①掌握被检品种组合亲本各生育期的特征特性，收集有关地区主要品种组合同名异源亲本种子、植株标准样品、有关资料和图册。 ②掌握最佳田检时期。一般分苗期、花期和成熟期三期进行，花期是关键。苗期检验性状为幼苗叶色、叶鞘颜色、叶型，花期为株高、茎秆粗细、叶片形状、叶片数及上冲程度、花药色、花丝色、雄穗护颖颜色及主轴长度、分枝多少等，成熟期为穗位高低、双穗率、穗型、穗轴颜色、粒型、粒色、果穗苞叶长度等。 ③掌握安全隔离。无论是空间隔离、时间隔离或障碍物隔离，一定要控制外来花粉干扰，防止生物学混杂。 ④掌握正确的田检方法。在对基本情况了解的前提下，要正确划分检验区和设点取样。一个检验区的最大面积为33.3公顷；0.7公顷以下5点取样,0.7～6.7公顷为8点取样, 6.7～13.3公顷为11点取样,13.3～33.3公顷为15点取样。每点最株数不低于200株。取样点分布方式因地块形状和大小可选择棋盘式、梅花式或方格式等，但取样点距地块边缘必须在5米以上。 2.品种纯度室内检验 种子在收获、脱粒、加工等过程中都有可能造成机械混杂，因此，在田检基础上必须进行品种真实性和一致性检验。室内检验杂交玉米种子纯度常用的方法主要有籽粒形态法、幼苗形态法和电泳法。 ①种子形态鉴定法是根据粒色、粒型、粒质、顶部凹陷和饱满状况、胚的形状与大小、籽粒表面圆滑程度、棱角的有无、稃色和花丝遗迹等特征进行鉴定的。其特点是快速、简单、经济。但因主要依据籽粒外部形态特征，由感官鉴别，对一些外部形态差异不大的品种鉴别准确性较差，在应用上存在一定的局限性。 ②幼苗形态鉴定法主要是以幼苗表现出的不同特征为依据面进行的检验，可根据芽鞘的颜色和长短、叶色、叶型、叶上茸毛的多少，中胚轴和近根处颜色、次生根的粗细、长短和多少等综合鉴别。幼苗形态鉴定可与发芽率鉴定一并进行，方法简单易行。但受环境因素及籽粒大小饱满程度的影响较大，容易引起较大的误差。不过，几是杂交的籽粒都具有杂种优势，其长势旺盛，如茎根比未杂交的粗壮，长得也快，次生根也多，用区别杂粒与自交粒还是很适用的。 细幼苗形态鉴定可与籽粒形态鉴定结合进行。在籽粒形态鉴定的基础上，将形态特征一致的籽粒进一步进行幼苗形态鉴定，可减少鉴定误差，提高鉴定的准确性。据种子站多年试验，籽粒形态与幼苗形态两者结合鉴定，一是适宜的品种范围广些；二是准确度也有较大提高，鉴定结果与田

质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定

质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定 组员：孙慜、孙苏、谢拓燕、郑倩倩、王佳玲【实验目的】 1、了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理 2、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 【实验原理】 ①DNA的限制性内切酶酶切原理（1） 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA，但不能切单链DNA。它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5‘- G↓AATTC-3‘), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3‘); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5‘…G↓AATTC…3‘→5‘… G AATTC…3‘ 3‘…CTTAA↑G …5‘→3‘… CTTAA G…5‘ DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 ②琼脂糖凝胶电泳条带的观察：（2） 通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview 溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。 ③质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分离：（2） DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH 溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离。 未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在： 1、超螺旋DNA： 尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。

鉴定水稻品种纯度的主要性状

鉴定水稻品种纯度的主要性状 鉴定水稻品种纯度，应在幼苗期、抽穗期、腊熟期等不同生育期进行。鉴定的性状主要有三个方面，即植株性状、穗部性状与谷粒性状。 一、植株性状 1、茎秆：株高、茎的粗细。 2、叶片：又分为一般叶片与剑叶。叶片：叶色深浅，叶片宽狭，长短；叶片茸毛多少。剑叶：剑叶长短、宽狭、剑叶与茎角度大小，剑叶与穗的距离。 3、植株各部分色素：植株各部分色素一般为绿色，另一种为紫色；凡叶鞘表现为紫色的品种，往往于叶耳、叶舌、叶节、稃尖、柱头、护颖等性状有一定相关性，但紫色深、浅因品种而异。 二、穗部性状 1、穗形：穗的着生姿态：分密穗形于疏穗形两种。 着粒密度：以单位长度（寸）内的粒数表示。每寸小穗粒数在18粒以下者为着粒稀，18—26粒为着粒密度中等，26粒以上为着粒密。 穗长：分三级。穗长8寸以上着为长穗，6—8寸者为中穗，6寸以下者为短穗。 穗颈粗细：分粗、中、细等。 2、芒：芒的有无和长短：分长芒（全穗谷粒均有芒，且芒长在3厘米以上），短芒（部分谷粒有芒，且芒长在3厘米以下），无芒等。 芒色：分黄、浅红、褐红、紫褐色等。 三、谷粒性状： 1、谷粒性状：以谷粒的长、宽比作为衡量标准。 籼稻：分细长粒（长为宽的3倍以上），中长粒（长为宽的2—3倍），短粒（长为宽的2倍以上）。 粳稻：分大粒（长为宽的1.8倍以上）中粒（长为宽的1.6—1.8倍）短圆粒（长为宽的 1.6倍以下）。 2、谷粒颜色： 稃色：分淡黄、黄、金黄、赤褐、黑褐等色。 稃尖色：分黄、赤、赤褐、淡褐、淡紫、深紫色等色。 3、护颖性状： 护颖色：分黄、赤、赤褐、黑褐等色。 护颖长短：分长、中、短等。 4、谷粒大小：以千粒重表示，30克以上的为最大粒，27—29克的为大粒，24—26克的为中粒，21-23克的为小粒，20克以下的为最小粒。

质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定

实验题目质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定 实验目的掌握质粒提取的原理与各种试剂的作用和琼脂糖凝胶电泳原理和操作 实验原理质粒存在于细菌，线粒体等，独立于染色体之外，能够稳定遗传并自我复制，是一个双链环装DNA。对数期大肠埃希菌含有质粒。溶液一可使细菌充分重悬，溶液二使细菌裂解，释放质粒和基因组DNA.溶液三起到中和作用，使得质粒DNA迅速复性，而基因组DNA因为分子巨大，复性时间长。离心后，质粒DNA留在上清液，而基因组DNA和细胞碎片沉淀在离心管。 琼脂糖凝胶电泳蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此泳动的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50bp的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可以确定DNA 在凝胶中的位置。 实验主要步骤 质粒DNA提取 1.取4ml细菌平均分两份加入离心管，以12000r/min离心1min，去除上清液 2.加100ul用冰预冷溶液I，移液枪打散细菌沉淀使其成为悬浮液 3.加入200ul溶液II，盖紧盖口，翻转五次，充分混合，避免振荡，置于冰上 4.加入150ul冰预冷溶液III，盖紧盖口，翻转离心管5次，温和摇匀直到粘稠的细菌裂解物出现，放于冰上5min 5.离心管以12000r/min离心5min 6.取上清液加入等量的酚：氯仿混合液，轻轻摇匀，以12000r/min离心7min 7.取上清液加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻摇匀，12000r/min离心5min，去除上清液，倒置在滤纸上干燥 8.用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min 9.用50ul无菌水溶解质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳： 1.制胶。将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化,混匀,冷却至55°℃,加入EB染料,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。 2.加入10ul的6×加样缓冲液到DNA样品,混匀,然后用移液枪取50u1样品加入样品孔中。(不要漫出加样孔) 3.接通电极,在120V电压下进行电泳20min-30min 4.当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离DNA片段的距离时,关闭电源。 5.已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察或照相。 实验结果

实验七小麦玉米品种田间纯度鉴定完整版

实验七小麦玉米品种田 间纯度鉴定 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】

实验七小麦、玉米品种田间纯度鉴定 一、目的 掌握小麦、玉米等主要农作物育种过程中品种纯度的鉴定方法。 二、内容说明 品种纯度，指品种一致性的程度。(在形态特征、生理特征性方面典型一致的程度，即供检样品中本品种的株（穗）数占供检该作物样品总株（穗）数的百分率)。它是种子质量的重要指标之一，是评定种子等级的主要依据。 品种纯度检验分田间检验和室内检验，田间检验以品种纯度为主，同时检验异作物、异品种、杂草、病虫感染率、作物生长发育情况等。 田间检验是以作物植株高度，叶片、穗部、芒、籽粒、护颖的性状和颜色，以及成熟迟早等差异为依据，进行分析鉴定。 田间品种纯度检验时期，以品种特点、特征、特性表现最明显的时期为宜。稻麦可分别于幼苗期、抽穗期开花期和蜡熟期检验。如果条件有限，至少应在蜡熟期检验一次。苗期检验结果供定级参考用，花期、成熟期的检验结果作为定级依据。如三次结果不同，要按最低的一次检验结果定级。 （补充）田间检验：一般在作物品种形态特征表现最明显的时期，如禾谷类作物黄熟期、大豆结荚期、薯类收获期进行检验。凡同一品种、同一种子等级和来源一致、栽培管理大体相同者，可作为一个检验区。每个检验区再选有代表性的地块，面积不少于检验区的5-10%，块数不少于3块，并均匀分布。在选好的代表性地块上设点取样，一般用梅花式、单对角线式、双对角线式或棋盘式取样法。代表性地块在5亩以上的，最少设点5个；在50亩以上的，每增加25亩增设样点一个。麦类每点取样20-40穗。玉米、高粱、谷子、糜黍、马铃薯每点取样20株。豆类每点取样10-20株。取样总数随代表性地块面积大小而定，一般以100-1000穗，或50-500株为限。 取样后，根据品种特征，鉴别本品种的株（穗）数、异品种的株（穗）数和其它作物株（穗）数，计算出该品种的田间纯度。 田间品种纯度（%）=本品种株（穗）数/供检总株（穗）数×100 种子纯度检验是质量检验的中心，是对一批种子中个体与个体之间在特征特性方面典型一致性程度的检验和种子真实性的鉴定。一般有田间检验、室内检验和种植检验三种。 1.品种纯度田间检验 田间检验是三大检验的重中之重。种子质量的高低主要是在田间生产过程中形成的，做好制种田间检验对于确保种子质量显得格外重要。要想做好田间检验，要做到以下几点： ①掌握被检品种组合亲本各生育期的特征特性，收集有关地区主要品种组合同名异源亲本种子、植株标准样品、有关资料和图册。 ②掌握最佳田检时期。一般分苗期、花期和成熟期三期进行，花期是关键。苗期检验性状为幼苗叶色、叶鞘颜色、叶型，花期为株高、茎秆粗细、叶片形状、叶片数及上冲程度、花药色、花丝色、雄穗护颖颜色及主轴长度、分枝多少等，成熟期为穗位高低、双穗率、穗型、穗轴颜色、粒型、粒色、果穗苞叶长度等。 ③掌握安全隔离。无论是空间隔离、时间隔离或障碍物隔离，一定要控制外来花粉干扰，防止生物学混杂。 ④掌握正确的田检方法。在对基本情况了解的前提下，要正确划分检验区和设点取样。一个检验区的最大面积为公顷；公顷以下5点取样,～公顷为8点取样, ～公顷为11点取样,～公顷为15点取样。每点最株数不低于200株。取样点分 布方式因地块形状和大小可选择棋盘式、梅花式或方格式等，但取样点距地块边缘必须在5米以上。 2.品种纯度室内检验（自学） 种子在收获、脱粒、加工等过程中都有可能造成机械混杂，因此，在田检基础上必须进行品种真实性和一致性检验。室内检验杂交玉米种子纯度常用的方法主要有籽粒形态法、幼苗形态法和电泳法。 ①种子形态鉴定法是根据粒色、粒型、粒质、顶部凹陷和饱满状况、胚的形状与大小、籽粒表面圆滑程度、棱角的有无、稃色和花丝遗迹等特征进行鉴定的。其特点是快速、简

田间检验与种子纯度的种植鉴定

田间检验与种子纯度的种 植鉴定 Prepared on 22 November 2020

第七章田间检验与种子纯度的种植鉴定 （本章属田间检验员专业技术知识） 本章讲4节：§1.品种特征特性 §2.田间检验 §3.田间小区种植鉴定 §4.种子质量纠纷田间现场鉴定 第一节田间检验及种子纯度种植鉴定依据的性状 （品种特征特性） 鉴定品种真实性和纯度，首先应了解被鉴定品种的特征、特性，来鉴别本品种和异品种。 品种性状可分为主要性状、次要性状、特殊性状和易变性状4类。主要性状：指品种所固有的不易变化的明显性状，如小麦的穗形、芒长等。 次要性状(细微性状)：指细小、不易观察但稳定的性状。如小麦护 颖 的形状、颖嘴。 特殊性状：指某些品种所特有的性状。如水稻中的紫米（有籼粳之分）、香稻（气味）等。。 易变性状：指容易随外界条件的变化而变化的性状.如生育期(与积温有关：郑单95895～120d)、分蘖多少（与种植早晚有 关）。 鉴定时应抓住品种的主要性状和特殊性状，必要时考虑次要性状和易变性状。 鉴定品种的具体性状都是依据器官的大小、颜色、形状等鉴定。 下面讲山东省大面积种植的主要农作物： 一、小麦（同p100）

（一）．植株性状 1.芽鞘色：绿色和紫色（区分品种纯度明显的性状） 2.幼苗生长习性：匍匐；直立；半匍匐（冬麦越冬前观察） 3.幼苗颜色：淡绿、绿色、深绿色（分蘖盛期观察） 4.柱高：61～80cm为矮；81～100cm为中等；101～120cm为高秆。 5.株型：抽穗后根据主茎与分蘖的松散程度分为三类： 紧凑:主茎与分蘖垂直夹角＜15℃ 松散：主茎与分蘖垂直夹角＞30℃。介于二者之间为中等。 （二）．穗部性状 (1)穗长(cm不含芒)： ～为短；～为中等；～为长. （2）穗形：纺锤形（两头尖，中间稍大）；棍棒形（上大、下小）； 圆锥形（下大、上小）；长方形（上中下基本一致）； 椭圆形（穗短、中部宽、两端稍小）。 （3）芒：稃尖完全不延长为无芒。有直芒或曲芒为有芒。 （4）芒长：长芒＞40mm,短芒＜40mm. （5）穗粒数：＜25为少；26～35为中；36～45为多；＞45为特多。 二．玉米p103 （一）植株性状 1、第1叶鞘颜色：展开2叶前，观察第一叶叶鞘颜色：绿色、紫色。 2、第1叶尖端形状：在幼苗期观测第1叶尖端形状。 分为：尖、圆、匙形 3、叶片边缘颜色：观测第4展开叶。分为绿、紫红、紫。