枳抗逆基因PtrZPT2-2的克隆与表达分析

园艺学报 2014，41（1）：9–16 http：// www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@https://www.360docs.net/doc/ee4639451.html,

刘德春*，吴启*，王玥辰，刘山蓓，刘勇**

（江西农业大学农学院园艺系，南昌 330045）

摘要：通过电子克隆和RT-PCR法从枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]中克隆到1个C2H2型锌指蛋白家族基因，命名为PtrZPT2-2。该基因编码159个氨基酸残基，预测蛋白分子量为17.28 kD，等电点为

9.51。PtrZPT2-2包含两个C2H2型锌指结构域，在其C–末端含有一个转录抑制结构域EAR/DLN-box

（DLNL）。PtrZPT2-2与其他植物参与各种非生物胁迫反应的C2H2型锌指蛋白有较高的一致性。系统发

育树分析表明PtrZPT2-2与杨树PtaZFP2，矮牵牛ZPT2-12、ZPT2-13，拟南芥ZAT12、ZAT7亲缘关系较

近。半定量PCR分析表明，低温、高盐、干旱胁迫和ABA处理下枳叶、茎、根中PtrZPT2-2均被诱导上

调。PtrZPT2-2可能在枳适应低温、高盐、干旱等非生物胁迫和ABA响应中起着重要作用。

关键词：枳；C2H2型锌指蛋白；PtrZPT2-2

中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0009-08 Cloning and Expression Analysis of PtrZPT2-2 from Trifoliate Orange （Poncirus trifoliata）

LIU De-chun*，WU Qi*，WANG Yue-chen，LIU Shan-bei，and LIU Yong**

（Department of Horticulture，College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Abstract：In the present study，a novel C2H2-type zinc finger protein gene，PtrZPT2-2，was cloned from trifoliate orange by in silico and RT-PCR approaches. The PtrZPT2-2 encodes a protein of 159 amino acid residues with a predicted molecular mass of 17.28 kD and an isoelectric point of 9.51. The PtrZPT2-2 protein contains two C2H2-type zinc finger domains，and a putative transcription repression domain （EAR/DLN-box）at the C-terminus. Phylogenetic analysis showed that the PtrZPT2-2clustered with PtaZFP2，ZPT2-12，ZPT2-13，ZAT12 and ZAT7. PtrZPT2-2 shared high identity with other C2H2-type zinc finger proteins involved in abiotic stress responses. Semi-quantitative PCR analysis showed that expression of PtrZPT2-2 was upregulated by cold，salt，drought and ABA treatments in leaves，stems and roots of trifoliate orange seedlings. Our data suggested that PtrZPT2-2 is a new member of the C2H2-type zinc finger protein genes and may play an important role in response to cold，salt，drought and ABA stresses in citrus.

Key words：trifoliate orange；C2H2-type zinc finger；PtrZPT2-2

收稿日期：2013–08–26；修回日期：2013–11–08

基金项目：国家自然科学基金项目（31260468）；江西省自然科学基金项目（20114BAB214006）；江西农业大学科学研究基金项目（CX201101）

* 共同第一作者

** 通信作者Author for correspondence（E-mail：liuyongjxau@https://www.360docs.net/doc/ee4639451.html,；Tel：138********）

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低温、干旱和高盐等植物生长中经常遭受的非生物胁迫严重限制了植物的生长发育、产量及地理分布。为了抵御外界的非生物胁迫，经过长期的进化，植物形成了对各种非生物胁迫的应答机制，这种应答机制都是通过相关胁迫功能基因表达的变化来实现。转录因子是一类可以调控下游胁迫功能基因表达的蛋白，在植物非生物胁迫应答机制中起重要作用（Chinnusamy et al.，2004；Nakashima et al.，2009）。

锌指蛋白（zinc finger protein，ZFPs）是一类具有“手指状”结构域的转录因子，其特征是通过结合Zn2+来稳定一种很短的可自我折叠成“手指状”的蛋白结构。根据半胱氨酸（cysteine，C）和组氨酸（histidine，H）残基的数量和位置可将锌指蛋白转录因子分为C2H2、C2HC、C2C2等亚类，其中C2H2型锌指蛋白研究较多（Wolfe et al.，2000；Laity et al.，2001）。植物C2H2型锌指蛋白具有两个比较独特的结构特征：一是相邻两个锌指间的氨基酸数量较多，而且有较大的变化，而大部分动物锌指蛋白的两个锌指间的氨基酸数较少；二是在锌指结构域中，与DNA的结合处存在一段高度保守的氨基酸序列QALGGH（Klug & Schwabe，1995）。

前人研究发现许多C2H2型锌指蛋白基因都与植物抗逆性相关，如大豆SCOF-1在冷胁迫下被诱导表达（Kim et al.，2001）；矮牵牛ZPT2-3在寒冷和干旱时被诱导表达（Sugano et al.，2003）；蒺藜苜蓿MtZFP1被证明参与脱落酸（ABA）、细胞分裂素、茉莉酮酸甲酯介导的应激反应（Xu & Ma，2004）；大豆SCTF-1基因转入烟草后能够显著提高转基因烟草的耐冷能力（宋冰等，2012）；水稻ZFP182参与植物ABA诱导的抗氧化防御机制，并且ZFP182的表达在ABA信号转导途径中受蛋白激酶MAKPs的调控（Gao et al.，2012）；大豆GmC2H2基因的表达主要集中在根部，并受低温和ABA的诱导，将该基因转化拟南芥，转基因拟南芥抗逆性明显提高（单曙光等，2011）；野生大豆GsZFP1基因在叶片中可以被ABA、高盐和低温诱导表达，在根中被ABA、低温和干旱诱导，另外在拟南芥中超量表达该基因可以增加CBF1、CBF2、CBF3、NCED3、COR47、RD29A、RAB18、P5CS、RD22等胁迫响应基因的表达量，并且提高了转基因植株抵御低温、干旱和高盐等环境胁迫的能力（Luo et al.，2012；Tang et al.，2013）；Gao等（2012）将菊花锌指蛋白基因CgZFP1转入拟南芥中，发现在高盐和干旱胁迫下一些涉及渗透调节、氧化应激反应和离子平衡的基因在转基因拟南芥中表达增强，证明了CgZFP1在植物高盐和干旱胁迫响应中起着重要的调控作用。

许多柑橘品种都不耐寒，低温常严重影响其产量。因此，抗寒性是柑橘育种重要的指标。枳是常用的柑橘砧木，极耐寒，经冷驯化后可耐–26 ℃低温，对干旱、高盐等逆境胁迫也有一定的抗性，若从中克隆一些抗逆基因导入栽培品种中，较其他植物外源抗逆基因更容易获得抗逆新品种。本研究中从柑橘的抗逆种类枳中克隆出了一个新的C2H2型锌指蛋白基因，并使用半定量PCR的方法检测了PtrZPT2-2在低温、干旱、高盐和ABA胁迫下的表达模式，为研究柑橘抗逆分子机制提供了新的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与逆境胁迫处理

2012年7月，将枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf. ]种子播种于含有7 g · L-1琼脂，40 g · L-1蔗糖，pH 5.8的MT培养基中，置于江西农业大学农学院园艺系实验室培养箱（25 ℃ ± 1 ℃，16 h光照，12 000 lx，8 h黑暗）中培养。幼苗长到约30 cm时，移植到Hongland培养液中预培养5 d，然后分别进行低温、高盐、干旱和ABA处理。低温处理：幼苗转移到4℃培养箱中培养；盐处理：幼苗转移到含有250 mmol · L-1 NaCl的Hongland营养液试管中；干旱处理：幼苗转移到含有20% PEG6000

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的Hongland营养液试管中；ABA处理：幼苗转移到含有100 μmol · L-1 ABA的Hongland营养液试管中。幼苗（每个处理10个植株）的叶、茎、根分别在处理后不同时间点（0、0.5、1、3、6、12、24、48和72 h）取样，液氮处理后–80 ℃超低温冰箱保存。

1.2枳RNA提取及第一链cDNA合成

用Trizol总RNA提取试剂盒（Invitrogen，美国）提取枳叶、茎、根总RNA。采用分光光度法鉴定RNA质量，DNaseⅠ（Promega，美国）处理去除剩余的基因组DNA。用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒（TaKaRa，日本）合成第一链cDNA，用于基因克隆和半定量PCR分析。

1.3 PtrZPT2-2基因克隆

通过检索HarvEST-Citrus数据库（http：//https://www.360docs.net/doc/ee4639451.html,/）找到与植物C2H2型锌指蛋白家族基因同源性很高的表达序列标签（EST）序列，数据库自动将这些EST序列拼接成一条一致性序列。基于该一致性序列利用引物设计软件Primer5设计合成1对基因特异性引物Ptrzpt2s（5′ACAAA AGACAGTTGAGACAGC3′）和Ptrzpt2a（5′CGAGGAAACGAACTCTATTAC3′），同时以枳叶片第一链cDNA为模板进行PCR扩增，获得PtrZPT2-2基因序列。PCR扩增程序如下：95℃5min；

℃。PCR产物经回收、纯

℃（35个循环）；72 10 min

℃，60 ℃（退火温度）30 s，72 2 min

95 30 s

化，与PMD18-T载体（TaKaRa，日本）连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，蓝白斑筛选后挑选白色阳性菌落，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.4生物信息分析

利用NCBI（http：//https://www.360docs.net/doc/ee4639451.html,/）中的ORF Finder程序预测PtrZPT2-2的开放阅读框，并获得氨基酸序列。使用Blast程序在GenBank搜素与PtrZPT2-2蛋白同源性高的植物蛋白序列。用Jalview软件进行蛋白多序列比对和一致性分析，MEGA4软件构建系统进化树，ExPASy ProtParam 在线分析工具分析PtrZPT2-2蛋白的理化性质、蛋白质分子量和等电点。

1.5 PtrZPT2-2的半定量PCR分析

以Ptrzpt2s和Ptrzpt2a为引物，半定量PCR检测枳叶、茎、根在低温、高盐、干旱和ABA处理后PtrZPT2-2的表达模式。以柑橘Actin基因为内参，Actin的扩增引物为Actins（5′CCGACCGTA TGAGCAAGGAAA3′）和Actina（5′TTCCTGTGGACAATGGATGGA3′）。利用2× easy Taq super mix （北京全式金生物技术有限公司）进行PCR反应。PCR反应体系包括11 μL H2O，12.5 μL 2× easy Taq super mix，0.5 μL正义引物，0.5 μL反义引物，0.5 μL模板cDNA。PtrZPT2-2基因PCR程序为：℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（25个循环）；72 ℃再延伸94

10 min。Actin基因PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min （25个循环）；72 ℃再延伸10 min。每处理样品设3个生物学重复，1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果与分析

2.1 PtrZPT2-2的克隆和序列分析

通过电子克隆和RT-PCR方法，从枳中克隆到1个新的基因，命名为PtrZPT2-2（GenBank登录号：KF258893）。测序和生物信息学分析结果表明：PtrZPT2-2 cDNA序列全长778 bp，含有477 bp

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的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），编码159个氨基酸的蛋白质，预测蛋白分子量为17.28 kD，等电点为9.51。对PtrZPT2-2编码的蛋白与其它类似蛋白的氨基酸序列进行一致性分析，结果表明与杨树（Populus tremula × Populus alba）PtaZFP2（GenBank序列号CAQ64474.1），拟南芥（Arabidopsis thaliana）ZA T12（CAA67232.1）、ZA T7（NP_190195.1），矮牵牛（Petunia × hybrida）ZPT2-11（BAA21920.1）、ZPT2-12（BAA21921.1）、ZPT2-13（BAA21922.1），ZPT2-1（CAA43111.1）等C2H2型锌指蛋白一致性依次为51.8%、50.90%、43.37%、37.37%、53.85%、52.69%、33.5%。

PtrZPT2-2和其它植物C2H2型锌指蛋白的氨基酸序列的多重比对分析结果（图1）表明：PtrZPT2-2蛋白序列含有两个保守的锌指蛋白结构域，每个结构域都包括一个植物特有的QALGGH 序列。另外，在PtrZPT2-2蛋白C–末端还含有一个起转录阻遏作用的DLN-box/EAR结构域（DLNL）。

图1 枳PtrZPT2-2与其他植物类似蛋白氨基酸序列比对

PtaZFP2：杨树（CAQ64474.1）；ZAT12：拟南芥（CAA67232.1）；ZAT7：拟南芥（NP_190195.1）；

ZPT2-11：矮牵牛（BAA21920.1）；ZPT2-12：矮牵牛（BAA21921.1）；ZPT2-13：

矮牵牛（BAA21922.1）；ZPT2-1：矮牵牛（CAA43111.1）。

Fig. 1 Sequence alignment between trifoliate orange PtrZPT2-2 and other PtrZPT2-2-like proteins from different plant species PtaZFP2：Populus tremula × Populus alba（CAQ64474.1）；ZAT12：Arabidopsis thaliana（CAA67232.1）；

ZAT7：Arabidopsis thaliana（NP_190195.1）；ZPT2-11：Petunia × hybrida（BAA21920.1）；

ZPT2-12：Petunia × hybrida（BAA21921.1）；ZPT2-13：Petunia × hybrida（BAA21922.1）；

ZPT2-1：Petunia × hybrida（CAA43111.1）.

利用MEGA4软件构建了植物C2H2型锌指蛋白的系统进化树（图2）。系统进化树显示，PtrZPT2-2与杨树PtaZFP2、矮牵牛ZPT2-12、ZPT2-13、拟南芥ZAT12、ZAT7等蛋白亲缘关系较近。

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图2PtrZPT2-2与其它植物锌指蛋白系统进化树

Fig. 2 Phylogenetic tree of close homologues of the PtrZPT2-2 and other zinc finger proteins

2.2 PtrZPT2-2的半定量表达分析

在叶片中，4 ℃低温处理0.5 h后，PtrZPT2-2表达开始增强，此后基本维持在同一水平，并在处理24 h后达到最大值，其后稍有降低；在茎中，低温处理3 h后，PtrZPT2-2表达量开始逐步上调，24 h后达到高峰，随后略有减弱；在根中，低温处理6 h后，PtrZPT2-2基因表达明显增强，随后维持在这一水平直到处理48 h后达到最大值，处理72 h后表达略有下降（图3，A）。

250 mmol · L-1 NaCl处理6 h前，叶片中PtrZPT2-2表达几乎没有变化，处理6 h后表达水平明显提高，并保持这一水平直到处理48 h后达到最大值，随后表达稍有减弱，但仍远高于处理前期；在茎中，PtrZPT2-2响应盐处理的时间较早，处理1 h后，表达就明显增强，之后保持这一水平直到处理24 h后表达再度增强，并在处理72 h后达到最大值；在根中，盐处理0.5 h后表达即开始增强，6 h后再度提高，并在处理24 h后达到最大值，以后一直维持这个水平（图3，B）。

在20%PEG6000模拟干旱处理12 h前，PtrZPT2-2表达在叶片中一直处于较弱的水平，处理12 h后表达明显增强，此后一直维持在这一水平；在茎中，PEG6000处理前期（0.5 ~ 6 h）PtrZPT2-2表达量几乎没变化，处理12 h后，表达显著增强，并在处理48 h后达到最大，之后一直维持这一

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表达水平；在根中，PtrZPT2-2对PEG6000的响应较早，处理3 h后，表达就明显增强，处理6 h 后，表达再度增强，此后一直维持这一水平直到处理72 h后表达达到最大值（图3，C）。

如图3，D所示，ABA处理3 h后叶片中PtrZPT2-2表达开始增强，此后一直维持这一水平直到处理24 h后达到高峰，随后表达量降低（48 ~ 72 h）；在茎中，ABA处理前期（1 ~ 3 h）PtrZPT2-2表达较弱，处理6 h后，表达增强，并在处理24 h后达到最大值，随后逐渐减弱；在根中，PtrZPT2-2响应ABA速度较快，在处理根1 h后，表达即显著增强，此后一直保持这一水平（3 ~ 6 h），然后在处理12 h后达到最大值，随后逐渐减弱（48 ~ 72 h）。

总之，低温、高盐、干旱和ABA处理后，PtrZPT2-2在枳叶、茎、根中均表达上调，说明PtrZPT2-2可能在柑橘非生物胁迫反应中起着重要作用。

图3 胁迫处理后PtrZPT2-2在枳叶、茎、根中的表达

Fig. 3 Expression pattern of PtrZPT2-2 in leaves，stems and roots in trifoliate orange after different stress treatments

3 讨论

研究表明，C2H2型锌指蛋白基因在植物对非生物逆境胁迫应答中起重要作用。目前国内外有关研究主要集中在拟南芥、矮牵牛以及水稻等模式植物中。本研究中从枳中分离出了一个新的C2H2型锌指蛋白基因PtrZPT2-2，分析表明其含有两个锌指结构域，每个锌指结构域都包含有一个植物特有的保守序列QALGGH。有研究表明，QALGGH序列与植物C2H2型锌指蛋白的DNA结合活性有关（Takatsuji & Matsumoto，1996；Yoshioka et al.，2001）。另外，在PtrZPT2-2蛋白中还发现了1个保守的EAR/DLN-box（DLNL）。目前报道的含有EAR/DLN-box的C2H2型锌指蛋白大多数具有

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转录抑制活性，在植物对非生物胁迫的防御反应中起着关键的作用。例如拟南芥AZF1、AZF2、AZF3和STZ/ZAT10（Sakamoto et al.，2004；Kodaira et al.，2011），矮牵牛ZPT2-3（Sugano et al.，2003），烟草ZFT1（Uehara et al.，2005）等锌指蛋白。然而，也有些植物的锌指蛋白虽然有EAR/DLN-box，却表现出转录激活活性，如水稻ZFP179和小盐芥ThZF1（Xu et al.，2007；Sun et al.，2010）。因此，需要进一步的试验来确定PtrZPT2-2是否作为1个转录抑制因子存在。

系统发育进化树分析表明，PtrZPT2-2与杨树PtaZFP2，矮牵牛ZPT2-12、ZPT2-13，拟南芥ZAT12、ZAT7亲缘关系较近。杨树PtaZFP2与机械损伤、高盐、低温等环境胁迫有关（Coutand et al.，2009；Martin et al.，2009）。拟南芥ZAT12表达受包括低温、高盐、干旱、高温、伤害、过氧化氢、光照等多种非生物胁迫的诱导（Rizhsky et al.，2004；Davletova et al.，2005；Vogel et al.，2005）。拟南芥ZAT7参与了拟南芥盐胁迫响应过程（Ciftci-Yilmaz et al.，2007）。以往的研究表明，许多植物C2H2型锌指蛋白是由不同的非生物胁迫诱导表达的。例如，水稻ZFP182表达是受冷、NaCl和ABA 诱导（Huang et al.，2007）；水稻ZFP245表达由干旱、冷诱导，但不受盐和ABA诱导（Huang et al.，2009）；水稻ZFP179由NaCl、PEG6000和ABA处理诱导（Sun et al.，2010）。矮牵牛的锌指蛋白基因ZPT2-3在冷和干旱诱导下表达（Sugano et al.，2003）。因此推测PtrZPT2-2表达也可能受非生物胁迫调控。本试验结果显示，经低温、高盐、干旱和ABA胁迫处理后，PtrZPT2-2在枳叶、茎、根中均表达上调，说明该基因与柑橘抗逆胁迫响应有关。

综上所述，PtrZPT2-2的生物信息学分析以及表达特性的分析结果表明，PtrZPT2-2是植物C2H2型锌指蛋白家族基因的1个新成员，可能在枳响应低温、高盐和干旱胁迫的过程中起了重要的作用。

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