人骨髓间充质干细胞分化潜能的探讨

第二军医大学

博士学位论文

人骨髓间充质干细胞分化潜能的探讨

姓名：陶欣荣

申请学位级别：博士

专业：细胞生物学

指导教师：胡以平

20050501

入骨髓ｌ司充质千细胞分化潜能的探讨

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰一过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论：

作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。

学位论文作者签名：陶ｆ１７天尔签字日期：ｊ一。ｒ年岁月２）日

学位论文使用授权书声明

本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）

学位论文作者签名：确ｆｆ天承导师签名：磊橱∽亿豸。

ｊ

签字日期：如。ｒ年ｒ月）弓日签字日期：蛊佃缉ｆ月乒２日’

英文缩写ＭＳＣｓ

ＨＳＣｓ

ＣＦＵ—ＦｓＦＡＣＳ

ＢＰ

ＥＧＦＰ

ｃ－ｍｅｔ

ＳＤＦ一１Ｑ０ｃｔ一４

ＰＰＡＲＶ

ＯＳＭ

ＨＧＦ

ＦＧＦ．４

ＣＫ

ＡＬＢ

心飞

ＭＡＰ２

Ｔａｕ

ＧＦＡＰ

ＮＦ．Ｍ

ＮＳＥ

Ｂ．ＴｕｂⅡＩＦＢＳ

ＰＢＳ

ＤＭＳＯ

ＢＭＥ

缩略词表

英文名称

ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ

ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ

ＣｏｌｏｎｙＦｏｒｍｉｎｇＵｎｉｔ－ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ

ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇ

ｂａｓｅｐａｉｒｓ

ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ

ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒ

ＳｔｒｏｍａＩＣｅｌｌ—ＤｅｒｉｖｅｄＦａｃｔｏｒ－１ａ

ｏｃｔａｍｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ４

ＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ－ＡｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒ

ＯｎｃｏｓｔａⅡｎＭ

ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ

ＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ－４

Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ

ＡＩｂｕｍｉｎ

ａ１－ａｎＵｔｒｙｐｓｉｎ

Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２

ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＴａｕ

ｇｌｉａｌａｃｉｄｉｃｆｉｂｄｌｌａｒｙｐｒｏｔｅｉｎ

ｎｅｕｍｆｉｌａｍｅｎｔ－Ｍ

ｎｅｕｒｏｎ?ｓｐｅｃ珩ｃｅｎｏｌａｓｅ

Ｂ－ｔｕｂｌｉｎⅢ

ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ

Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ

ＤｉｍｅｔｈｙｌＳｕｌｆｏｘｉｄｅ

Ｂ—ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ

中文名称

阃充质干细胞

造血于细胞

集落形成成纤维细胞

流式细胞仪

碱基对

绿色荧光蛋白

肝细胞生长因子受体

基质细胞衍生因子１ａ

八聚物结合蛋８４

过氧化物酶体增殖物激活受体

制瘤素Ｍ

肝细胞生长因子

成纤维生长因子４

细胞角蛋白

白蛋白

ａ卜抗胰餐自酶

微管相关蛋８２

微管相关蛋ＥｔＴａｕ

胶原纤维酸性蛋白

神经丝蛋白

神经元特异性烯醇化酶

Ｂ一微管蛋白Ⅲ

胎牛血清

磷酸盐缓冲液

二甲亚砜

ｐ一巯基乙醇

ＢＨＡ

ＢＣＩＰ，

ＮＢＴ

ＣＣｌ４

ＲＴ．ＰＣＲ

Ｈ＆Ｅ

ＳＣｌＤ

ＳＰＦｂｕｔｙｌａｔｅｄｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ

５－Ｂｒｏｍｏ－４－?Ｃｈｌｏｒｏ－?３??ＩｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅＩ

Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｓａｌｔ

Ｃａｒｂｏｎｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ

Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ

ｒｅａｃｔｉｏｎ

Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎ

Ｓｅｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ

ＳｐｅｃｉｆｉｃＰａｔｈｏｇｅｎＦｒｅｅ

叔丁基对羟基茴香醚

５．溴一４一氯．３一吲哚磷酸，

氮蓝四唑盐

四氯化碳

逆转录聚合酶链反应

苏木精和曙红

重度联合免疫缺陷

无特殊病原体

陶欣茉博上论文人骨髓问充质干细胞分化游能的探讨

中文摘要

人骨髓间充质干细胞（ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｈＭＳＣｓ）是骨髓中的一类与造血干细胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＨＳＣｓ）不同的，具有向骨、软骨、脂肪、肌肉等多种组织细胞分化能力的成体干细胞，它在体外可以大量增殖，并具有克隆形成的能力。它就是人们很早就知道的骨髓基质细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）。由于其具有多向分化的潜能，在体外又较容易培养扩增，加之具有潜在的细胞治疗价值，故引起了生物学界和医学界的关注。

然而，相对于ＨＳＣｓ来说，人们对ＭＳＣｓ生物学特性的认识要滞后得多，就连其表型特征和分化潜能的认识也尚不一致。造成这种情况的主要原因可能有：１）个体发育的不同阶段，ＭＳＣｓ的表型和功能有差异；２）骨髓中存在不同分化等级的ＭＳＣｓ；３）骨髓中不同空间位置的ＭＳＣｓ存在差异：４）不同实验室分离ＭＳＣｓ的方法不同，分离后体外培养的条件也不一样，以致所获得的ＭＳＣｓ也不同；５）用于研究ＭＳＣｓ分化潜能的体外诱导和体内移植的体系不一致。因此，ＭＳＣｓ迄今尚无公认的、高度特异性的分子标记，也没有较为标准的分离和培养方法。ＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅＡＪ（１９７０）和ＧｒｏｎｔｈｏｓＳ（２００３）等人的研究发现体外培养的单个骨髓基质细胞贴壁生长后可以形成克隆，称为集落形成成纤维样细胞（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，或ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ－Ｆ），一般所说的骨髓问充质干细胞很可能就是其中的某种或某些类型的细胞群体。

基于这样一个研究背景，本课题试图直接从人骨髓中分离较为原始的骨髓间充质千细胞，以期对ＭＳＣｓ的基本生物学特性能够有一个比较全面的认识。本文的目的在于：’）建立克隆化的人骨髓间充质干细胞系，并建立适合其生长和增殖的体外培养条件；２）鉴定它的基本生物学特性；３）研究其向外胚层神经细胞和内胚层肝脏细胞分化的潜能。

本实验以年龄为１７ｙ－６５ｙ的正常人骨髓为材料，利用ｈＭＳＣｓ贴壁生长和具集落形成能力的特点，得到了多个克隆化的细胞系。对其中的一个可稳定传代的细胞系（ｈＭＳＣｓ－２００２－３）的基本生物学特性进行了系统的研究，探讨了骨髓ｈＭＳＣｓ在体内和体外的分化潜能，以及其在损伤肝和神经系统中的植入和分化命运。所获得的主要结果如下：

（１）ｈＭＳＣｓ－２００２－３具有问充质干细胞基本的生物学特性。选取骨髓细胞原代培养物

陶欣荣博士论文人骨髓问克质千细胞分化潜能的椿讨

中贴壁生长的，具集落形成能力的成纤维样细胞，挑取来源于单个细胞的最早出现和较大的细胞集落，并进行逐步扩大培养，得到了多个克隆化的细胞系。对其中的一个可稳定传代的细胞系（ｈＭＳＣｓ一２００２—３）的生物学特性进行了系统的研究。相差显微镜下该细胞系中的细胞为均一的小梭形细胞、细胞核较大、核仁明显，有１—２个核仁，胰酶消化后细胞直径为１０一１５“ｍ，大丽扇的细胞很少。在适合其生长和增殖的体外培养条｛牛（ＤＭＥＭ—ＬＧ培养液中添加１０％经过筛选的胎牛血清、低密度种植，细胞生长至７０～８０％汇合时传代）下，该细胞系中的细胞在体外扩增至６０ＰＤ时仍保持良好的生长状态，细胞生长汇合达１００％时为旋涡状或平行排列。取第８代的纫胞，绘制缨胞的生长蓝线，计算出缨胞倍增时间为２９．５±２．３ｈ。经液氮冻存１８月后复苏，该细胞仍保持良好的生长状态，为均～的小梭形细胞。

液氮冻存１年后复苏的细胞，克隆形成实验结果显示该细胞仍具有很高的克隆形成能力。

染色体记数分析结果显示，细胞中的染色体数目为４６条。流式细胞术捡测ＤＮＡ含量，结果显示该细胞为正常的二倍体细胞。将２×１０７个细胞植入到ＳＣＩＤ４，鼠腹股沟皮下组织，观察３个月，未检查到肿瘤发生。

本实验对该细胞在体外向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的分化潜能分别进行了鉴定。在成骨诱导培养液（含１０彳ｍｏｌ／Ｌ地塞米松，Ｏ．２ｍｍｏｌ／Ｌ维生素Ｃ，１０ｍｍｏｌ／ＬＢ?甘油磷酸，１０％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ—ＬＧ）的诱导分化条件下，细胞诱导５天时就可以检测到向成骨细胞分化早期的特征性酶：碱性磷酸酶的表达；诱导１０天时免疫细胞化学染色分析Ｉ型胶原为阳性；诱导１４天时细胞化学方法染色（茜素红．Ｓ染色）显示细胞外基质中有钙化点；而未分化的细胞均束检测到。诱导７天时ＲＴ－ＰＣＲ就可以检测到与成骨细胞外基质中羟磷灰石沉积相关的骨桥蛋白（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）基因的表达，诱导１４天时ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ基因呈强表达，而未分化的ｈＭＳＣｓ则不表达。以上结果表明，该细胞在体外适当的条件下可以分化为成骨细胞。在脂肪细胞诱导培养液（含１ｕｍｏｌ／Ｌ地塞米松，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ３一异丁基．１．甲基黄嘌岭，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ碍ｌ哚美辛，１０ｕｇ／ｍｌ胰岛素，ＩＯ％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ－ＨＧ）和脂肪细胞维持培养液（含１０ｕｇ／ｍｌ胰岛素，１０％ＦＢＳ，ＤＭＥＭ．ＨＧ）的诱导分化条件下，１０天时就可以在相差显微镜下观察到胞质中有发亮的脂滴，随着诱导时间的延长，细胞中的脂滴变大、增多，脂肪样的细胞也逐渐增加。向脂肪细胞诱导８天时，ＲＴ－ＰＣＲ就可以检测到调控向脂肪细胞分化的关键转录因子过氧化物酶增殖激活受体（ＰＰＡＲｙ２）的表达，诱导２１天时ＰＰＡＲｙ２基因呈强表达，而未分化Ｉ构ｈＭＳＣｓ则不表达。诱导２１天时的细胞用脂肪特异性结合的染料油红一Ｏ染色，结果大部分细胞的胞质中的脂滴都被染为红色。以上结果表明，该细胞在

体还可以向脂肪细胞分化。在无血清软骨诱导培养液（１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ。１３１，ＩＴＳ其中含５ｕ

ｇ／ｍｌ胰岛素、５ｕｇ／ｍ１人转铁蛋白、５ｎｇ／ｍｌ亚硒酸钠，Ｏ．１１１ｍｏｌ／Ｌ地塞米松：１ｍｍｏｌ／Ｌ丙酮酸钠；ＤＭＥＭ—ＨＧ培养液）的诱导条件下，细胞团在三维的培养体系中体积增大，第３天时体积最大，接下来体积无明显变化；而未诱导的细胞团第２天缩小。碱性甲苯胺蓝细胞化学染色结果显示诱导分化的细胞团细胞外基质中有氨基多糖；免疫细胞化学染色分析ＩＩ型胶原为阳性；而未分化的ｈＭＳＣｓ均未检测到。诱导７天时ＲＴ－ＰＣＲ就可以检测到细胞外基质中软骨特异性的聚集蛋白聚糖（ａｇｇｒｅｃａｎ）基因的表达，诱导２１天时ａｇｇｒｅｃａｎ基因呈强表达，而未分化的ｈＭＳＣｓ贝ＪＪ不表达。以上结果表明，细胞在体还可以向软骨细胞分化。这些结果有力地证明了，ｈＭＳＣｓ一２００２—３体外可以分化为３种不同的中胚层细胞（成骨、软骨、脂肪细胞），克隆化的ｈＭＳＣｓ一２００２－３细胞系无致瘤性，是正常的可稳定传代的问充质干细胞系。

（２）ｈＭＳＣｓ．２００２－３不表达造血干细胞的分子标记，表达基质细胞的分子标记。流式细胞术检测体外扩增４０ＰＤ的细胞，结果显示细胞不表达ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤｌ４、ＨＩ＿Ａ－ＤＲ，但表达ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＨＬＡ．１。ＲＴ－ＰＣＲ检测结果显示细胞表达ＯＣＴ－４、ＳＤＦ一１ｕ、ＣＤ４９ａ、ＣＫｌ９、ｃ－ｍｅｔ基因。以上结果表明，该细胞不表达造血干细胞的分子标记（ＣＤ３４、ＣＤ４５），也不表达ＩＩ类组织相容性抗原；表达基质细胞一些分子标记（ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ４９ａ、ＳＤＦ．１ａ），还表达多能性干细胞的标记ＯＣＴ－４。

（３）ｈＭＳｃｓ．２００２．３在向脂肪细胞分化过程中蛋白质表达谱有明显的变化。抽取诱导前和向脂肪细胞诱导分化后的细胞总蛋白，二维电泳（２ＤＳＤＳ－ＰＡＧＥ）的方法分析脂肪细胞诱导前、后蛋白的表达，结果显示未分化ｈＭＳＣｓ细胞与向脂肪细胞分化后的细胞，两者蛋白质表达谱有明显的差异。由于用于分析的蛋白质量有限，接下来的ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ分析，只鉴定了ａｃｔｉｎ和ｔｕｂｌｉｎ。结果显示向脂肪细胞诱导分化后ａｃｔｉｎ和ｔｕｂｌｉｎ的表达明显减少。该结果表明，可以通过分析ｈＭＳＣｓ诱导分化前后蛋白质表达谱的改变，鉴定间充质于细胞特异性的蛋白质。另外，蛋白质表达谱分析的方法可以用于ｈＭＳＣｓ细胞分化机制的研究。

（４）ｈＭＳＣｓ?２００２－３在适当的体外诱导条件下可以分化为外胚层神经样的细胞和内胚层肝细胞样的细胞。体外向神经细胞的诱导条件为：ＤＭＥＭ．ＨＧ培养液中添加２０％ＦＢＳ，５ｍＭ０－巯基乙醇或２％ＤＭＳＯ／０．２ｍＭ叔丁基对羟基茴香醚或ＤＭＥＭ．ＨＧ／２％ＤＭＳＯ

／０．２ｍＭＢＨＡ／２５ｍＭＫＣＩ／２ｍＭｖａｌｐｒｏｉｃａｃｉｄ／１０ｐ－Ｍｆｏｒｓｋｏｌｉｎ／１ｐＭ

ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ／５ｐｇ／ｍｌｉｎｓｕｌｉｎ。诱导５ｈ后细胞的形态发生明显改变，有些细胞的细胞质收缩，细胞体向外伸出双

极或多极的长突起。２８小时后多数细胞形态上有改变，细胞伸出长长的多极分支的突起，有的细胞还可以看到生长锥和丝突样的结构。免疫细胞化学分析结果显示诱导后的细胞表达神经元细胞特异的ＮＳＥ、ＮＦ－Ｍ、Ｔａｕ。但细胞在体外的存活时间只有３．５天，最长存活７ｄ，然后死亡。体外向肝细胞的诱导条件为：ＩＭＤＭ／Ｆ１２培养液中添加２％ＦＢＳ，１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ－４，１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ，２０ｎｇｌｍｌＨＧＦ。２０ｎｇ／ｍｌＯＳＭ。１Ｉｌｍｏｌ／Ｌ地塞米松等因子。细胞形态出现改变，由原来的梭形变为多角形，出现小的连成片的细胞群，有些细胞为双核。ＰＡＳ糖原检测实验为阳性。免疫组织化学分析结果显示诱导后的一些细胞表达自蛋白，ＣＩ｛．抗胰蛋白酶，还有些细胞表达ＣＫｌ９、ＣＫｌ８。以上结果表明，ｈＭＳＣｓ在体外合适的诱导条件下，可以分化为神经样细胞和肝细胞样的细胞。

（５）ｈＭＳＣｓ．２００２．３移植到新生小鼠的脑中后，可以分化为神经细胞。标记有ｅＧＦＰ的ｈＭＳＣｓ，以前囟门为标记植入到新生３天Ｃ５７ＢＵ６Ｊ小鼠的侧脑里。植入０ｄ、９ｄ、１４ｄ取脑，４％多聚甲醛固定后冰冻切片。荧光显微镜下检测植入０天时的脑冠状切片，发现大部分的细胞可以植入到注射部位下的单侧脑室中；检测植入９天、１４天时的脑冠状切片，结果显示有些植入的细胞从注射部位还向脑组织的其它部位（注射部位的同侧和对侧）发生了不同距离的迁移。在侧脑室，皮层下纹状体，海马。皮层等部位均有分布。激光共聚焦显微镜下的照片显示，虽然大部分的轴突和树突被切断了，但是仍可以看到植入的细胞变为神经元样的细胞形态，胞体变为多角形，细胞伸出多极的树突样结构，还可以看到有些细胞发出的轴突样结构。运用绿色荧光蛋白与间接免疫荧光双重标记的方法来检测脑组织中植入的ｈＭＳＣｓ分化情况，激光共聚焦显微镜下共定位双重标记的植入细胞，结果显示移植的细胞大部分表达神经元细胞特异的１３－Ｔｕｂ¨ｎⅢ、ＭＡＰ２、Ｔａｕ标记蛋白，少部分细胞表达神经胶质细胞特异的ＧＦＡＰ。ｈＭＳＣｓ在新生小鼠脑内可以存活２周（冰冻切片只检测到植入细胞２周时）且状态非常好，能参与到神经系统正在发育的小鼠脑组织里。移植细胞的小鼠可以一直存活，没有观察到饮食和行为异常的现象（实验只观察到植入细胞６个月时）。以上结果表明，ｈＭＳＣｓ植入后受到脑组织特定的微环境影响，在体内可以分化为神经元细胞和神经胶质细胞。

（６）ｈＭＳＣｓ－２００２－３移植到０Ｃ１４损伤的ＳＯｌＤ小鼠肝脏中，可以分化为肝细胞。另一方面，标记有ｅＧＦＰ的ｈＭＳＣｓ经脾植入到ＣＣｌ４急性损伤的ＳＣＩＤ小鼠肝脏中。移植后２Ｗ。５ｗ。８ｗ取肝脏组织，４％多聚甲醛固定后冰冻切片，荧光显微镜下放大４０倍观察植入ｈＭＳＣｓ的ＳＣＩＤ４、鼠肝脏的冰冻切片，发现肝组织中有散在分布的绿色荧光标记的细胞簇，进一步用

陶欣荣博士论文人骨髓问充质干细胞分化潜能的探讨

激光共聚焦显微镜观察发现，可以清晰地看到细胞形态已经发生明显的变化，细胞变为肝细胞样，有些细胞为双核。在中央静脉四周和门管区都发现有绿色荧光标记的细胞簇，每簇中有１～８个绿色荧光标记的细胞。按观察到的每个绿色细胞簇含有的细胞个数，来显示增殖细胞所占有的比例。统计结果表明，植入２ｗ时２个细胞以上为一簇的占多数（７９．４％）。由此可见，植入２ｗ对大部分存活的植入细胞在ＳＣＩＤ：Ｊ，鼠肝脏中已经增殖。ｈＭ￥Ｃｓ可以在ＳＣＩＤ：Ｊ、鼠肝脏中植入并长期存活达８周（冰冻切片检测到８周）。同样运用绿色荧光蛋白与间接免疫荧光双重标记的方法来检测肝组织中植入的ｈＭＳＣｓ分化情况，激光共聚焦显微镜下共定位双重标记的植入细胞，结果显示外源移植的ｈＭＳＣｓ细胞，在ＣＯｌ４损伤ＳＣＩＤ：ｂ鼠肝内，还表达白蛋白和Ｑ１－抗胰蛋白酶（均为肝脏实质细胞的分子标志）。Ｍａｓｓｏｎ三色法（对胶原纤维染色）和Ｈ＆Ｅ染色结果显示，ＣＣｌ４损伤２ｗ时，ＳＣＩＤ：Ｊ、鼠肝组织中央静脉周围的肝细胞有轻微的坏死、炎细胞增生和轻微的胶原纤维增生。损伤５ｗ和８ｗ时，ＳＣＩＤ小鼠肝细胞大面积坏死、纤维增生明显。由此推测，应用于本实验的ＳＣＩＤ：Ｊ、鼠肝脏损伤模型，其体内的环境还是较适合外源细胞的植入和增殖，但外源植入细胞的治疗作用，可能还需更长时间的观察和进一步研究结果的证实。以上结果有力地证明了，ｈＭＳＣｓ在损伤的肝脏中不仅可以长期存活、增殖，而且能分化为成熟的肝细胞。

综合以上结果，本项研究首次利用间充质千细胞贴壁生长、具集落形成能力的特点，用改进了的真接法建立了克隆化的人骨髓间充质干细胞系，该细胞系中的细胞在体外合适的条件下长期传代、稳定增殖并保持未分化状态。体内、外分化潜能的实验结果首次证明了，克隆化的ＣＦＵ—Ｆ中的人骨髓间充质千细胞在不同的体内特定微环境里，分化的去向有明显的差异，其可以分化为神经细胞和肝细胞。由于其在体外长期培养、扩增后仍具有多向分化的潜能，因此显示了ｈＭＳＣｓ成为肝功能衰竭、肝脏代谢性疾病和神经系统疾病细胞治疗的种子细胞的可能性。本研究结果为人骨髓间充质千细胞的分离培养及在体外维持未分化状态的条件提供了有价值的实验依据，本研究结果还为ｈＭＳＣｓ参与损伤肝重建与修复治疗的研究奠定了基础。

关键词：问充质干细胞：人骨髓；ＣＦＵ－Ｆ；细胞系；克隆；细胞分化；细胞移植

陶欣荣博士论文人骨髓问充质干细胞分他潜能的探讨

ＡＢＳＴＲＡＣＴ

Ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ｈＭＳＣｓ）ａｒｅｎｏｎ—ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，

ｔｉｓｓｕｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｆａｔｔｃａｐａｂｌｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｉｎｔｏｍａｔｕｒｅｃｅｌｌｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ

ｂｏｎｅ．ｃａｒｔｉｌａｇｅ，ｍｕｓｃｌｅ．ＴｈｅｈＭＳＣｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｒｅａｌｓｏｃａｌｌｅｄｍａｒｒｏｗ

ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ．Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ。ｔｈｅｍｕＲｉｐｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｏｆｈＭＳＣｓｃｏｕｐｌｅｄ

ｗｉｔｈｔｈｅｅａｓｅｏｆｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｉｎｇｈａｓｓｐｕｒｒｅｄｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅｉｎｔｅｒｅｓｔｓｉｎｂｅｔｔｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆｈＭＳＣｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｅｓｐｉｔｅｔｈｅｓｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＨＳＣｓ）ｏｕｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｈＭＳＣｓｂｉｏｌｏｇｙｒｅｍａｉｎｓｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ．Ｉｎｆａｃｔ，ｈＭＳＣｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄｉｎｄｉｆｉｂｒｅｎｔｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｏｒＭＳＣｓｊｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｆｉｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓａｒｅｖａｒｉｏｕｓｊｎｔｈｅｉｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｔｈｅｒｅａｒｅｍａｎｙｆａｃｔｏｒｓｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇｔｈｅｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ，ｈＭＳＣｓａｎｄｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．Ｆｉ噶ｔ．ｄｕｄｎｇｔｈｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｈＭＳＣｓｈａｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｓｅｃｏｎｄ，ｔｈｅｒｅａｒｅｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＭＳＣｓｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ，ｄｉｆｆｅｄｎｇｂｙｔｈｅｓｔａｇｅｏｆｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｉｒｄ，ＭＳＣｓａｔｄｉｆｉｅｒｅｎｔｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍａｙｂｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｆｏｕｒｔｈ。ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｓｏｌａｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｍａｙａｆｆｅｃｔｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅＭＳＣｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ。ｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｐａｒａｄｉｇｍｕｓｅｄｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖ／ＶＯｍａｙａｆｆｅｃｔｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．１－ｏｄａｔｅ．ｔｈｅｒｅｉｓｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｒｋｅｒｏｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｍａｒｋｅｔｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｈＭＳＣｓｅｉｔｈｅｒｉｎｖｉｖｏｏｒｉｎｖｉｔｒｏ，ａｎｄｔｈｅｒｅｉｓｎｏｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｐｒｏｃｅｄｕｒｅｔｏｉｓｏｌａｔｅｈＭＳＣｓ．ＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅＡＪ。１９７０ａｎｄＧｒｏｎｔｈｏｓＳ．２００３ｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈａｔｓｉｎｇｌｅ－ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａＩｃｅｌｌａｄｈｅｒｅｎｔｔｏｐｌａｓｔｉｃｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈｃａｎｆｏｒｍｃｏｌｏｎｙｏｆｃｅｌｌｓｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｖｉｔｒｏ．ｃａｌｌｅｄｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｏｒｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃｕｎｉｔｓ（ＣＦＵ－Ｆ）．Ｔｈｅｙｆｕｒｔｈｅｒｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｇｒｏｗｔｈｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｄｈｅｒｅｎｔｃｏｌｏｎｉｅｓａｒｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓａｎｄｏｎｌｙｃｅｌｌｓｆｉｏｍｓｏｍｅｃｏｌｏｎｉｅｓｍａｙｂｅｍｕｌｔｉ—ｐｏｔｅｎｔｉａｌｈＭＳＣｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｌｉｋｅａｌｌｔｈｅｏｔｈｅｒＣｕｒｒｅｎｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ－ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎｙｉｅｌｄｓａｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅｐｌａｓｔｉｃａｄｈｅｒｅｎｔｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｗｉｄｅｌｙｖａｒｙｉｎｇｇｒｏｗｔｈｋｉｎｅｔｉｃｓ．ｃｅｌｌｍａｒｋｅｒｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ．

陶欣荣博上论文人骨髓间充质｛二细胞分化潜能的探讨ｌｉｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｓｅＣＦＵ—Ｆ，ａｎｄｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｏｋｅｅｐｈＭＳＣｓａｔｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｓｔａｔｅ。ＷｅｔｈｅｎｗｅｎｔｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅｓｅｈＭＳＣｓｃｅｌ｜Ｉｉｎｅｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｃｌｏｎｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｆｉｎａｌｌｙ，ｗｅｅｖａｌｕａｔｅｄｔｈｅｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｉｓｈＭＳＣｓｉｎｔｏｈｅｐａｔｉｃａｎｄｎｅｕｒａｌｌｉｎｅａｇｅｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏ．ｈＭＳＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｈｅａｌｔｈｙｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｂｙｆｉｒｓｔｔａｋｉｎｇａｄｖａｎｔａｇｅｏｆｔｈｅｉｒｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌａｄｈｅｒｅｎｃｅｔｏｔｈｅｐｌａｓｔｉｃｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈ．Ｔｈｅｎ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｃｌｏｎｅｓｏｆｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｓｗｈｉｃｈａｒｅｒａｐｉｄｌｙａｄｈｅｒｅｎｔａｎｄｌａｒｇｅｒｉｎｓｉｚｅｗｅｒｅｐｉｃｋｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅｐｉｐｅｔｔｅｔｉｐｓｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＣｌｏｎａｌｃｅｌｌＩｉｎｅｓｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａ舱ｒｅｘｐａｎｓｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅｓｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｅｒｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ．ＯｎｅｃｅｌＩＩｉｎｅｔｈａｔｈａｓｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｈＭＳＣｓａｎｄＷａｓａｂｌｅｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｈｅｐｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅｃｅｌｌｓａｎｄｎｅｕｒｏｎ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｆｕｒｔｈｅｒａｎａｌｙｚｅｄｂｙｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｉｒｆａｔｅｓｉｎｉｎｊｕｒｅｄｌｉｖｅｒａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｂｒａｉｎ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｆｌｏｗｅｄ：

（１）ＳｏｍｅｉｓｏｌａｔｅｄｃｌｏｎａｌｃｅｌｌｌｉｎｅｓｈａｖｅｂａｓｉｃｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｉｌｓＵｎｄｅｒｐｈａｓｅ?ｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓａｒｅｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙｓｍａｌｌｓｐｉｎｄｌｅ－ｓｈａｐｅｄａｎｄｌｉｔｔｌｅｂｒｏａｄｅｒｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｅｎａｍｏｎｇｔｈｅｍ．Ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｗａｓｄｒａｗｅｄａｔｐａｓｓａｇｅｓ８ａｎｄｔｈｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｏｕｂｌｉｎｇ（ＰＤ）ｔｉｍｅｗａｓ２９．５±２．３ｈｂｙｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ．ＳｅｖｅｒａｌｌｉｎｅｓｏｆｅｖｉｄｅｎｃｅｓｕｇｇｅｓｔｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓａｒｅｈＭＳＣｓ．Ｆｉｒｓｔ，ｅｖｅｎａｆｔｅｒｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｅｏｖｅｒ６０ＰＤ，ｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｈａｖｅｔｈｅｃａｐａｃｉｔｙｆｏｒｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ．Ｓｅｃｏｎｄ．ｔｈｅｙｍａｉｎｔａｉｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｔｏｇｉｖｅｒ．ｉｓｅｔｏｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｌｉｎｅａｇｅｐｒｏｇｅｎｙ（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｓ，ａｄｉｏｐｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｃｅｌｌｓ）．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ．ｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｈａｖｅｎｏｒｍａｌｋａｒｙｏｔｙｐｅ，ｄｉｐｌｏｉｄＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔ．Ｎｏｔｕｍｏｒｓｗｅｒｅｆｏｒｍｅｄｆｏｒ３ｍｏｎｔｈｓａｆｔｅｒｔｈｅｙｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓＩｙｉｎｔｏＳＣｌＤｍｉｃｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｗｅｗｉｌｌｃａｌｌｔｈｅｍｈＭＳＣｓｔｈｅｒｅａｆｔｅｒ．（２）ｈＭＳＣｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｖａｒｉｏｕｓｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｉｎｅａｇｅｃｅｌｌＳｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｃｅｌｌｓ．ｂｕｔｎｏｔｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＢｙｕｓｉｎｇＲＴ－ＰＣＲ．ｗｅｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｅｔｏｆｇｅｎｅｍａｒｋｅｒｓ：ＯＣＴ－４，ＳＤＦ－１ｑ．ＣＤ４９ａ，ＣＫｌ９，ａｎｄＣ－ｍｅｔ．ＢｙｕｓｉｎｇＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ），ｗｅｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｃｅｌｌｓｕｄａｃｅａｎＵｇｅｎｓ：ＣＤ４４，ＣＤ２９，ＣＤ９０，ＨＬＡ。１，ｂｕｔｎｏｔＣＤ３４，ＣＤ４５．ＣＤｌ４．ａｎｄＨＬＡ－０Ｒ，ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈＭＳＣｓｄｏｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓ

堕堕茎堡里婆苎叁壁塑塑壅堕王塑堕坌些堂堂堕堡塑ｍａｒｋｅｒｓｏｆｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＣＤ３４，ＣＤ４５）ａｎｄＨＬＡ一１．ｅｉｔｈｅｒ，ｂｕｔｄｏｅｘｐｒｅｓｓｅｘｐｒｅｓｓｍａｒｋｅｒｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ４９ａ、ＳＤＦ－１Ⅱ）ａｎｄＯＣＴ一４

（３）ｈＭＳＣｓｈａｖｅｏｂｖｉｏｕｓｐｒｏｔｅｏｍｅｃｈａｎｇｅｓａｆｔｅｒｔｈｅｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．ＰｒｏｔｅｏｍｅｏｆｔｈｅｈＭＳＣｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙ２ＤＳＤＳ—ＰＡＧＥ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｐｏｔｓｐａｔｌｅｒｎｒｅｖｅａｌｅｄｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｏｍｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｅｃａｕｓｅｏｆｌｉｍｉｔｅｄａｍｏｕｎｔｏｆｐｒｏｔｅｉｎｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔＭＡＬＤＩ－ＴＯＦａｎａｌｙｓｉｓｏｎｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｅａｃｔｉｎａｎｄｔｕｂｕｉｉｎ，ｗｈｉｃｈｄｅｃｒｅａｓｅｓｈａｒｐｌｙｄｕｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｉｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｕｓｉｎｇｔｈｅｈＭＳＣｓｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｐｒｏｔｅｏｍｅａｎｄａｓａｍｏｄｅｌｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．

（４）ＩｎｖｉｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈＭＳＣｓｃａｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｎｅｕｒａｌ。ｌｉｋｅｃｅｌｌｓａｎｄｈｅｐａｔｉｃ．１ｉｋｅｃｅｌｌｓ．ＴｏｉｎｄｕｃｅｈＭＳＣｓｉｎｔｏｎｅｕｒａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｗｅｕｓｅ５ｒａｍ１３２ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎ０１．ｏｒＯ．２ｍＭｂｕｔｙｌａｔｅｄｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ／２％ＤｉｍｅｔｈｙｌＳｕｌｆｏｘｉｄｅｏｒ

ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ．Ａｆｔｅｒ５ｈｏｕｍｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｈＭＳＣｓｓｔａｒｔｔｏｅｘｈｉｂｉｔｎｅｕｒｏｎ—ｌｉｋｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ。ｅｘｔｅｎｄｉｎｇｌｏｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｉｎｔｙｐｉｃａｌｇｒｏｗｔｈｃｏｎｅｓａｎｄｆｉｌｏｐｏｄｉａ．ＦｕＲｈｅｒｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｍｏｓｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｍａｎｙｎｅｕｒｏｎｍａｋｅｒｓ：ｎｅｕｒｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅ。ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ－Ｍ，ａｎｄｔａｕ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｍａｉｎｔａｉｎｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍａｊｏｒｉｔｙｏｆｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅａｄａｆｔｅｒ３－５ｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ｎｏｌｏｎｇｅｒｔｈａｎ７ｄａｙｓ．ＴｏｉｎｄｕｃｅｈＭＳＣｓｉｎｔｏｈｅｐａｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｗｅｕｓｅＦＧＦ－４．ＥＧＦ，ＨＧＦ．ＯＳＭ．２％ＦＢＳｉｎｌＭＤＭ，Ｆ１２ｍｅｄｉｕｍ．Ａｆｔｅｒ２１ｄａｙｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｈａｐｅｏｆｈＭＳＣｓｃｈａｎｇｅｓｆｒｏｍｓｐｉｎｄｌｅ?ｓｈａｐｅｔｏｃｕｂｏｉｄ－ｓｈａｐｅｗｉｔｈｓｍａｌｌｅｒｎｕｃｌｅａｒｔｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｒａｔｉｏ．Ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｅｉｌｓｃｏｕｌｄｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄ．ＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＲＴ—ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｈｅｐｔｉｃｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｒｋｅｒｓ：ｗｈｉｌｅｓｍａｌｌｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｅｓＣＫｌ９ａｎｄＣＫｌ８，ｓｏｍｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＪａｔｅｄｃｅｌｔｓｅｘｐｒｅｓｓａｌｂｕｍｉｎ．ａｌ。ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ，Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｃｉｄｉｓｈｉｆｆ（ＰＡＳ）ｓｔａｉｎｉｎｇｒｕｓｈｅｒｒｅｖｅａｌｅｄａｂｕｎｄａｎｔｇｌｙｃｏｇｅｎｓｔｏｒｅｓｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｏｆｓｏｍｅｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｉｌｓ．ｗｈｉｃｈｉｓａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｈｅｐａｔｉｃｃｅｌｌｓ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｔｈｅｃｌｏｎａｌｃｅｌｌｌｉｎｅｏｆｈＭＳＣｓｃａｎ

陶欣荣博士论文人骨髓问充质干细胞分化潜能的探讨ｄ＿ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅＩｎｔｏｎｅｕｒｏｎ—ｌｉｋｅａｎｄｈｅｐａｔｉｃ－ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｉｎｖ／ｔｒｏ．

（５）ＩｎｖｉｖｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈＭＳＣｓｃａｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎ

ｃｅｌｌｓｉｎｎｅｏｎａｔａｌｍｏｕｓｅｂｒａｉｎ．ＷｅｆｕｒｔｈｅｒａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｈＭＳＣｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ

ｉｎｖｉｖｏ．ｈＭＳＣｓｗｅｒｅｍａｒｋｅｄｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）

ｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｌａｔｅｒａｌｖｅｎｔｒｉｃｌｅｏｆｂｙｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｗｅｒｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ

ｎｅｏｎａｔａｌｍｉｃｅｂｒａｉｎ．Ａｔ０ｄａｙ，９ｄａｙｓａｎｄ１４ｄｐｏｓｔ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｍｉｃｅｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｂｒａｉｎｓｗｅｒｅｆｉｘｅｄｗｉｔｈ４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ．ＥｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｒｙｏｓｔａｔｓｅｃｔｉｏｎｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｈＭＳＣｓｃａｎｅｎｇｒａｆｔｉｎｔｏｂｒａｉｎ，ａｎｄｍｉｇｒａｔｅｆｒｏｍｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｉｔｅｔｏｓｔｄａｔｕｍ．ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．ｔｈｅｃｏｒｔｅｘ，ｅｖｅｎａｒｅａｓｏｆｂｒａｉｎｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌｔｏｔｈｅｓｉｄｅｏｆｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｅｘａｍｉｎｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓｏｆｔｈｅｓｅＥＧＦＰ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｈＭＳＣｓ．Ｂｙｕｓｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｗｅｗｅｒｅａｂｌｅｔｏＣＯ—ｌｏｃａｌｉｚｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄＥＧＦＰ—ｌａｂｌｅｄｈＭＳＣｓｈａｖｅＢ－ＴｕｂｌｉｎＩⅡ、ＭＡＰ２、ｒａｕｓｔａｉｎｉｎｇａｌｔｈｏｕｇｈｓｏｍｅｈａｖｅＧＦＡＰｓｔａｉｎｉｎｇ．ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｔｈｅｓｅｈＭＳＣｓｃａｎｒｅｓｐｏｎｄｔｏｂｒａｉｎｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎｓａｎｄａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．

（６）ＩｎｖｉｖｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈＭＳＣｓｃａｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｉｎＣＣｌ４ｉｎｊｕｒｉｅｄＳＣＩＤｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒ．ｈＭＳＣｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＥＧＦＰｗｅｒｅａｌｓｏｓｕｒｇｉｃａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓｐｌｅｅｎｏｆｒｅｃｉｐｉｅｎｔＳＣＩＤｍｉｃｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｃａｒｂｏｎｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｃｒｙｏｓｔａｔｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｒｅｃｉｐｉｅｎｔｌｉｖｅｒｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｄｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔ．ＴｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＧＦＰｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｔ２，５ａｎｄ８ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｈａｐｅｏｆｃｅｌｌｓｃｈａｎｇｅｄｆｒｏｍｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｉｎｔｏｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ?ｌｉｋｅ．Ｓｏｍｅｏｆｔｈｅｍｂｅｃｏｍｅｂｉ—ｎｕｃｌｅａｔｅｄ．ＣｌｕｓｔｅｒｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｂｏｔｈｃｅｎｔｒａＩｖｅｉｎａｎｄｐｏｒｔａｌａｒｅａｓ．ＳｔａｔｉｓｔｉｃａＩｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｌｈａｔｃｌｕｓｔｅｒｓｗｉｔｈ２ｃｅｌｌｓｏｒｍｏｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄｔｈｅｍａｊｏｒｉｔｙ（７９．４％）ｏｆｃｅｌｌｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎａｔ２ｗｅｅｋｓｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅｄａｔａｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｃｅｌｌｓｃａｎｅｎｇｒａｆｔｌｏｎｇｔｉｍｅ（ｏｂｓｅｒｖｅｄ８ｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｏｎ）ａｎｄｍｏｓｔｏｆｓｕｒｖｉｖａｌｃｅｌｌｓｈａｖｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｉｎｔｈｅｉｎｊｕｒｉｅｄｌｉｖｅｒ２ｗｅｅｋｓｐｏｓｔｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｉｍｍｕｎｏ—ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｔｈａｔｔｈｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓ：ａｌｂｕｍｉｎａｎｄａｌ—ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎｉｎｉｎｊｕｒｉｅｄＳＣｌＤｍｉｃｅ

ｌｉｖｅｒ．ＭａｓｓｏｎｓｔａｉｎｉｎｇｗｉｔｈｃｏｌｌａｇｅｎａｎｄＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）ｓｔａｉｎｉｎｇｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅａｒｅｌｉｇｈｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｎｅｃｒｏｓｉｓａｒｏｕｎｄｐｏｒｔａｌ，ｍａｎｙｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｅｍｅｒｇｉｎｇａｎｄｌｉｇｈｔｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎａｃｕｔｅ００１４－ｉｎｊｕｒｉｅｄＳＣＩＤｍｉｃｅｌｉｖｅｒｓａｔ２ｗｅｅｋｓｐｏｓｔｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｅｉｎｊｕｒｙｉｎｃｒｅａｓｅｈｅａｖｉｌｙｗｉｔｈａｌａｒｇｅａｒｅａｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｎｅｃｒｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆｆｉｂｒｏｓｉｓｇｒｅｗｈｅａｖｉｌｙａｔ５ｗｅｅｋｓａｎｄ８ｗｅｅｋｓ．ＩｔｓｅｅｍｓａｓｉｆｔｈｅｉｎｊｕｒｉｅｄｌｉｖｅｒｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｗｅｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｈＭＳＣｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙｎｅｅｄｌｏｎｇｅｒｔｉｍｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙ．ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｇａｖｅｓｔｒｏｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔｈＭＳＣｓｃｏｕｌｄｎｏｔｏｎｌｙｓｕｒｖｉｖｅｌｏｎｇｔｉｍｅａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｉｎｔｈｅｉｎｊｕｒｉｅｄｌｉｖｅｒｂｕｔａｌｓｏｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｔｅｉｎｔｏｍａｔｕｒｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．

Ｔｏｏｕｒｋｎｏｗｌｅｄｇｅ，ｔｈｉｓｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｓｔｕｄｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇａｓｉｍｐｌｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｔｏｉｓｏｌａｔｅａｃｌｏｎａｌｍｕｌｔｉ—ｐｏｔｅｎｔｉａｌｈＭＳＣｌｉｎｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ．Ｗｅｈａｖｅａｌｓｏ．ｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｈＭＳＣｓｆｒｏｍａｄｕｌｔｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｂｙｓｉｍｐｌｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｈａｖｅｔｈｅａｂｉｌ时ｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｐｒｅｇｅｎｙｏｆｏｔｈｅｒｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｌａｙｅｒｓｓｕｃｈａｓｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｎｅｕｒａｌｃｅｌｌｓ．ＷｅａｌｓｏｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｔｈａｔｔｈｅｓａｍｅｈＭＳＣｓａｓｓｕｍｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆａｔｅｕｎｄｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｉｎｖｉｖｏ．Ｂｙｕｓｉｎｇａｎｉｎｊｕｒｅｄｌｉｖｅｒｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌ，ｗｅｗｅｒｅａｂｌｅｔｏｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｔｈａｔｔｈｅｓｅｈＭＳＣｓｎｏｔｏｎｌｙｈａｖｅｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｓｕｒｖｉｖｉｎｇａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｂｕｔａｌｓｏｃａｎｄｉｆｆｅｒａｔｉａｔｅｉｎｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍａｔｕｒｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｏｅｓ．ＩｔｉｓｗｏｒｔｈｎｏｔｉｎｇｔｈａｔｅｖｅｎａｆｔｅｒｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｉｎｇｔｈｅｒｅｈＭＳＣｓｓｔｉｌｌｍａｉｎｔａｉｎｔｈｉｓｍｕｌｔｉ—ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｗｉｌｌａｌｌｏｗｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｔｉｍｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｉｔｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｅｆｏｒｅｆｕｒｔｈｅｒｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｏｖｅｒａｌｌ．ｗｅｃｏｎｃｌｕｄｅｔｈａｔｈＭＳＣｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍａｙｂｅａｎｉｄｅａｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｕｒｃｅｆｏｒｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｉｅｓｆｏｒｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄｃｅｎｔａｌｎｅｕｒａｌｓｙｓｔｅｍｄｉｓｅａｓｅ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ．＂ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ；ＣＦＵ—Ｆ：ｃｅｌｌｌｉｎｅ；ｃｌｏｎｅｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｔｉｏｎ；ｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔ

１３

前言

入骨髓问充质干细胞是骨髓中的一类与造血干细胞的不同的，具有向骨、软骨、脂肪、肌肉等多种组织细胞分化能力的成体干细胞，它在体外可以大量增殖，并具有克隆形成的能力。

研究表明，个体发育时充质干细胞也经历了一系列的发育和分化过程。在人和鼠胚胎发育胚体形成阶段，背主动脉区为原始造血部位，其下主动脉．生殖腺嵴一中肾管区（ａｏｒｔｏ—ｇｏｎａｄａｌ－ｍｅｓｏｎｅｐｈｆ．ｃ，ＡＧＭ）有很多基质样细胞，从ＡＧＭ区分离的基质缨胞系可以支持胚胎或成体造血，其贴壁生长的特性以及体外培养扩增的条件与ＭＳｃｓ非常相似（如培养液垦需添加１０．２０％的ＦＢＳ），但对其表型和分化潜能研究铰少（ＣｏｒｔｅｓＦｅｔａｌ，，１９９９；ＭａｒｓｈａｌｌＣＪｅｔａ１．．１９９９）。ＣａｍｐａｇｎｏｌｉＣ（２００１）等研究发现，人妊娠前三个月胚胎的外周血中不仅含有较多的ＨＳＣｓ，还同时含有丰富的ＭＳＣｓ，一直延续到妊娠１２ｗ，之后胎血里的ＭＳＣｓ数目很快减少甚至消失。胎肝、骨髓里的问充质干细胞存在的数目，也象外周血里的ＭＳＣｓ一样，随着胚胎发育的进展，数目明显减少。研究结果还显示，胚胎里的ＭＳＣｓ与成体ＭＳＣｓ在生物学特性上非常相似，但与成体ＭＳＣｓ相比，胚胎期ＭＳＣｓ的ＣＦＵ．Ｆ形成能力和增殖能力强。１２ｗ后外周血中的ＭＳＣ迅速减少，但是有证据表明有很少的多潜能ＭＳＣ残存下来。从脐带血分离得到多潜能非造血干细胞的实验也映证了这～点（ＧｏｏｄｗｉｎＨＳｅｌａ１．，２００１：ＷｅｒｎｅｔＰｅｔａ１．，２００１），他们得到的细胞与ＭＳＣｓ很相似，不表达Ｉ类或ｌ｜类组织相容性抗原，表达ＣＤｌ３。ＣＤ４４，Ｒｅｘｌ和ＳＳＥＡ４。ＶｅｆｆａｉｌｌｉｅＣＭ（ＲｅｙｅｓＭｅｔａ１．．２００１）研究小组分离鉴定的ＭＡＰＣｓ（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔａｄｕｌｔｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ＭＡＰＣ），ＫｕｚｎｅｔｓｏｖＳＡ（２００１）等从外周血中分离鉴定的骨祖细胞，都提示生物体内存在循环的多潜能非造血干细胞。我们认为ＭＳＣｓ存在不同的发育等级，个体发育阶段中一些ＭＳＣｓ与造血干细胞共存，不仅支持造血，还可以迁移，形成其它组织里的细胞成分。而残存于成体里的该类细胞可能在整个生命过程中扮演着组织损伤和修复的重要角色。

事实上，成体骨髓中多潜能的于细胞的存在，还有待于进一步研究结果的证实。还有许多问题有待于迸一步研究结果的回答，如骨髓中何种特征的细胞具有多潜能？其多向分化的机制是怎样？这些在体内的多能性细胞，在体外长期培养扩增后回输到体内，是否还具有多潜能？

一、骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定的研究现状

相对于ＨＳＣｓ来说，人们对ＭＳＣｓ生物学特性的认识要滞后得多，对ＭＳＣｓ的表型特征和分化潜能的认识也不统一。造成这种情况的原因可能有：１）个体发育的不同阶段，ＭＳＣｓ的表型和功能有差异；２）骨髓中存在不同分化等级的ＭＳＣｓ；３１骨髓中不同空间位置的ＭＳＣｓ存在差异；４）不同实验室分离ＭＳＣｓ的方法不同，分离后体外培养的条件也不一样，以致于所获得的ＭＳＣｓ也不同；５）用于研究ＭＳＣｓ分化潜能的体外诱导和体内移植的体系不一致。因此，目前ＭＳＣｓ没有公认的、高度特异性的分子标记，也没有较为标准的分离和培养方法去获得ＭＳＣｓ。用来证明实验中得到的细胞是间充质干细胞的惟一金标准是其能向中胚层３种细胞（骨、软骨、脂肪细胞）分化的潜能。尽管近年来关于间充质干细胞有大量的文献报道，但对其生物学特性的认识还是很粗浅的，各个实验室的结果也不相同，没有一个统一的标准。

综合文献报道，分离间充质干细胞的方法很多，有根据细胞贴壁生长的特点采用直接贴壁分离法，有密度梯度分离法、有根据细胞表面标志使用磁珠吸附的方法、有根据细胞的大小分离的方法（ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭＦｅｔａＩ，，１９９９；ＣｏｎｇｅｒＰＡｅｔａ１．，１９９９；ＪｏｎｅｓＥＡｅｔａｌ。，２００２；ＨｕｎｇＳＣｅｔａｌ。，２００２）；分离得到的ＭＳＣｓ体外培养的条件也不同，分子特征也有差别。分离得到的多是不均一的细胞群（ＭｕｒａｇｌｉａＡｅｔａｌ．．２０００）。进一步的研究发现，单个ｈＭＳＣｓ细胞在体外培养的过程中，亚克隆里的细胞形态、增殖能力和分化潜能也不同（ＣｏｌｔｅｒＤＣｅｔａ１．，２０００。２００１）。虽然近几年研究鉴定了一些ｈＭＳＣｓ特异性标记，细胞表达ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤｌ６６；不表达典型的造血系统抗原ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＨＩ＿Ａ－ＤＲ．ＣＤｌ４Ｌ单核细胞，巨噬细胞），ＣＤ３１（内皮细胞），ＣＤｌｌａ（淋巴细胞），但是目前还没有发现高度特异性的抗原可以被用来分离ｈＭＳＣｓ。

ＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎＡＪ等在１９７０年就发现体外培养的单个骨髓基质细胞可以形成克隆，称为集落形成成纤维样细胞（６ｌｏｎｏｇｅｎｉｃｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，或ｃｏｔｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ—Ｆ）。而具有克隆形成能力的骨髓细胞是那些快速贴壁、增殖速度快、不同于巨噬细胞的骨髓基质细胞。随后有研究发现，不同的ＣＦＵ—Ｆｓ增殖产生的细胞集落，其中细胞的分子特征、分化潜能等特征也不一样：而且现有的研究结果提示，一般所说的骨髓间充质干细胞很可能就是其中的某种或某些类型的细胞群体。

基于这样一个研究背景，本实验以年龄为１７ｙ－６５ｙ的正常人骨髓为材料，利用间充质干细胞贴壁生长、具集落形成能力的特点，挑取较早出现和较大的单个ＣＦＵ．Ｆｓ细胞集落

陶欣荣博士论文人骨髓问充质干细胞分化潜能的探讨

中细胞，试图直接从成体人骨髓中分离较为原始的骨髓问充质干细胞，得到了多个克隆化的细胞系，建立了适合其生长和增殖的体外培养条件，迸一步研究了其在体内、外的分化潜能。

二、骨髓间充质千细胞多向分化潜能的研究概况

ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭＦ等（１９９９）发表了第一篇最为有说服力的关于人成体骨髓中存在多向分化潜能的间充质干细胞（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆａｄｕｌｔｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）的文章。该研究小组利用密度梯度的分离方法，从人骨髓中分离ｈＭＳＣｓ，体外克隆化的ｈＭＳＣｓ仍具有向骨、软骨和脂肪细胞分化的能力。随后ＶｅｒｆａｉｌｌｉｅＣＭ研究小组，发表了～系列的关于问充质干细胞多向分化潜能的研究结果。其中ＲｅｙｅｓＭ等（２００１）从骨髓中分离ＣＤ４５（－）／ＧＩｙＡ（－）的贴壁细胞，证明是中胚层组织的祖细胞（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ＭＰＣｓ），ＭＰＣｓ不仅可以形成肢体中胚层的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、基质细胞，还可以形成脏壁中胚层的内皮细胞。ＪｉａｎｇＹ等（２００２）在单个细胞水平，进一步证明了ＭＰＣｓ在体内和体外可以分化为内、中、外三个胚层的细胞，称为多潜能的成体干细胞（ＭＡＰＣｓ）。同年，ＪｉａｎｇＹ等从小鼠的骨髓、肌肉和脑组织里也分离到了多潜能的成体祖细胞。以上的研究表明，骨髓中存在多潜能的干细胞，但是它究竟是何种类型的细胞，目前还没有统一的认识。

研究表明，细胞的分离方法和培养条件对骨髓中多潜能间充质干细胞的获得与维持至关重要。ＪｉａｎｇＹ等建立的多潜能成体祖细胞（ＭＡＰＣ）被认为是间充质干细胞的亚系，ＭＡＰＣｓ是用ＣＤ４５．，ＧＩｙＡ．为标志及其贴壁生长的特性来分离的。ＭＡＰＣｓ在骨髓细胞里存在的比例是１，５ｘ１０３ＣＤ４５．ＧＩｙＡ．细胞或１，１０５骨髓单核细胞。其体外分离和培养的条件比较特殊，在纤维连接蛋白包被的细胞培养皿里贴壁生长，培养液里添加ＥＧＦ、ＰＤＧＦ和２％胎牛血清。实验证明ＭＡＰＣｓ与ＭＳＣｓ相比具强大的增殖能力，可以在体外扩增６０多个细胞倍增周期。传２５代的多潜能ＭＡＰＣ表达端粒酶，具多向分化潜能（可以分化为内、中、外三个胚层的细胞），且继续增殖至５０代。ＰｏｃｈａｍｐａｌｌｙＲＲ等（２００４）的研究结果也映证了培养条件对获得的ＭＳＣ表型特征有很大影晌。用没有添加血清、细胞因子的培养液，培养较早代次的人骨髓基质干细胞，２至４周后，筛选出的亚系接着在含１７％胎牛血清的培养液中培养，其与一直用有血清的条件培养筛选出的对照组相比，端粒长度长与对照组。

ＲＴ－ＰＣＲ及基因芯片分析结果表明，该细胞系是非常早期的祖细胞，表达ＯＣＴ－４及其它胚

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陶欣荣博士论文人骨髓间充质干细胞分化潜能的探讨

胎期细胞表达的基因。

对入骨髓间充质于细胞分化潜能的实验研究，主要在体内和体外两个方面进行。相对于间充质干细胞体外分化潜能的研究，其体内分化潜能的研究却很有限，其在体内分化的机制知道的更少。而只有研究清楚其在体内的特异微环境中的分化和功能状态，才能更好地将其应用于临床。如ＭＡＰＣｓ在体外可以分化为有功能的肝脏细胞，而未见向肝细胞分化的体内实验报道。

分析ＭＳＣｓ的分子表达谱发现，ＭＳＣｓ同时表达中胚层、内胚层、外胚层细胞的分子特征（ＷｏｏｄｂｕｒｙＤｅｔａ１．，２００２）。ＲａｔａｊｃｚａｋＭＺ（２００４）等研究发现，小鼠骨髓Ｓｃａ一１（＋）的单核细胞或人类ＣＤ３４（＋／．）ＡＣｌ３３（＋／－）ＣＸＣＲ４（＋）的细胞，在正常的生理状态下，以很少的数目存于外周血中，而一旦组织损伤后，骨髓中这些细胞就会被动员出来，这些细胞在外周血中水平会很快升高。这些结果提示．骨髓中的非造血千细胞在体内特异的环境中，如组织损伤的情况下，可能会在肌体不同的组织中分化为该组织中的细胞。

以上的研究结果提示，间充质干细胞的分化命运由细胞外部环境的信号与细胞内在的“程序”共同决定的。为研究同一种ｈＭＳＣｓ在不同胚层来源的组织中的分化命运，本研究将分离鉴定的ｈＭＳＣｓ标记上绿色荧光蛋白，移植到ＣＣｆ４损伤的ＳＣＩＤｔＪ、鼠肝脏中，同时又移植到新生３天的Ｃ５７Ｂ∽小鼠脑中，观察其分化的去向，以探讨ｈＭＳＣｓ分化的机制。

三、本课题的研究目的和意义

本课题的研究目的有：１）建立克隆化的人骨髓间充质干细胞系，并建立适合其生鹾和增殖的体外培养条件；２）鉴定它的基本生物学特性；３）研究其向神经细胞和Ｊｊ千脏细胞分化的潜能。

本实验获得的间充质干细胞系不仅为研究间充质干细胞的生物学特性提供一个良好的细胞模型，而且还可以用于研究细胞的分化机制。本研究结果为人骨髓间充质干细胞的分离培养及在体外维持未分化状态的条件提供了有价值的实验依据，还为ｈＭＳＣｓ参与损伤肝重建与修复治疗提供了有力的证据，ｈＭＳＣｓ将来有可能成为肝功能衰竭、肝脏代谢性疾病细胞治疗和神经系统疾病治疗的种子细胞。

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第一部分

克隆化的人骨髓间充质干细胞系的建立及其基本生物学特性的研究

人间充质干细胞的组织来源很多，但是从组织中ｈＭＳＣｓ的含量、取材的方便程度，分离扩增后可以紧接着用于细胞移植的角度，我们认为骨髓是ｈＭＳＣｓ将来临床应用最好的来源。人骨髓间充质干细胞存在许多亚系，各个亚系在形态、分化潜能、细胞移植后的归巢能力上不同【Ｉ叫Ｊ。因此，建立克隆化的ｈＭＳＣｓ细胞系并对其分化潜能和细胞的分子特征做鉴定是非常有意义的。

有研究表明，不同的分离方法与培养条件，对多潜能ｈＭＳＣｓ的获得与维持非常重要。如研究发现低密度种植可以维持其快速增殖，提高产量，最大限度地保持其多向分化潜能的干细胞特性ＨＪ：进一步研究发现，ｈＭＳＣｓ经无斑清条件培养筛选后，ＯＣＴ－４表达增强１６】；Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ研究小组获得的人骨髓多潜能的干细胞ＭＡＰＣｓ［７］是使用比较特殊的分离与培养的条件。本研究的目的是从成体人骨髓中分离间充质干细胞，利用ｈＭＳＣｓ贴壁生长和具集落形成能力的特性，试图直接从人骨髓中分离较为原始的骨髓问充质干细胞，以期对ＭＳＣｓ的基本生物学特性能够有一个比较全面的认识。挑取原代最早出现和较大的来源于单个细胞的集落形成单位（ＣＦＵ—Ｆｓ）中的成纤维样细胞，逐步扩大培养，建立了多个克隆化的细胞系。对细胞的分子特征和分化潜能的鉴定证明了建立的细胞系是间充质干细胞系，为下一步研究其跨胚层分化潜能奠定基础。

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实验材料

１．细胞分离的主要试剂及其制各

１，１Ｐｅｒｃｏｌｌ，购自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司。１．０７３９／ｍｌＰｅｒｃｏｌｌ的制备：５０ｍｌ无菌离心管中加入２２．０５ｍｌＰｅｍｏＵ，２．４５ｍｌＮａＣＩ（１．５Ｍ）和１０．５ｍｌＴｙｒｏｄｅ缓冲液，混匀后，２０，０００９，１５ｍｉｎ。４＂Ｃ贮存备用。

１．２ＦｉｃｏＵ（１．０７７９／ｍ１），购自上海生物工程有限公司。

１．３红细胞裂解液；１３９．６ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４ＣＩ，１６．９６ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，用１ｍｏｌｌＬＨＣＩ调ｐＨ至７．２。过滤灭菌，４℃保存。

２。细胞培养的主要试剂及其制各方法

２．１ＤＭＥＭ．ＬＧ液体培养基：购自ＧｉｂｃｏｌＢＲＬ公司。

２．２胎牛血清：购自Ｈｙｃｌｏｎｅ。

２．３青霉素，链霉素溶液（Ｐ／Ｓ１００×）：１００００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ青霉素和１００００ｕｌ／ｍｌ链霉孝的盐溶液，购自ＧｉｂｃｏｌＢＲＬ公司。

２．４２００ｒａＭＧｌｕｔａｍａｘＴＭ：购自ＧｉｂｃｏｌＢＲＬ公司。．２０。Ｃ保存。

２．５０．０５％胰蛋白酶，０．０２％ＥＤｌＡ：ＧｉｂｃｏｌＢＲＬ公司

２．６１Ｍ磷酸盐缓冲液（１０ｘＰＢＳ）；称ＫＣｌ２９，ＫＨ２Ｐ０４２９，ＮａＣＩ８０９，Ｎａ２ＨＰ０４ｑＨ２０１５．６９，加ｄｄＨ２０至９００ｍｌ，混匀，用ＮａＯＨ或ＨＣＩ调节ＰＨ值至７．２左右，Ｏ．２２ｐｒｏ滤膜过滤，分装，高压灭菌，４０ｃ保存。

０．１Ｍ磷酸盐缓冲液（１ｘＰＢＳ），取１０ｘＰＢＳ１００ｍｌ，加ｄｄＨ２０定容至１０００ｍｌ。用０．１Ｍ盐酸调节ＰＨ值至７．２左右，分装，高压灭菌，４。Ｃ保存

２．７细胞冻存液：ＤＭＥＭ?ＬＧ液体培养基：胎牛血清：ＯＭＳ０＝７：２：１分装，－２００Ｃ保存，使用前４０Ｃ解冻。

３．细胞诱导的主要试剂及其制备方法

３．１维生素Ｃ及其贮备液配制：维生素Ｃ购自华美公司。取０．３５９，溶于１０ｍ｜三蒸水，配成０．２ｍｏＩ，Ｌ（１０００×）的贮备液浓度。０．２ｍ滤膜过滤，分装，－２０ｏＣ保存备用。

３．２口－甘油磷酸：母－甘油磷酸购自Ｓｉｇｍａ公司。取２．１６９，溶于１０ｍＥ蒸水。配成