动物布鲁氏菌病防治研究进展_毛开荣

动物布鲁氏菌病防治研究进展

毛开荣

(中国兽医药品监察所,北京　100081)

[收稿日期]200303

20　[文献标识码]B [文章编号]10021280(2003)09

003704　[中图分类号]S 852.614

[摘　要]　布鲁氏菌病至今依然是在世界范围内流行的人畜共患传染病。除牛种、羊种、猪种、绵羊副睾种、犬种布鲁氏菌病的流行外,最近又发现了海洋种布鲁氏菌病的存在。对布鲁氏菌病的病原学诊断已从传统的分离培养鉴定发展到应用PCR 、基因探针等分子生物学技术,诊断的敏感性大大提高了。在血清学诊断方面,ELISA 技术已经成为国际公认的成熟技术。在预防用疫苗方面,牛用RB51和羊用M 111两种粗糙型疫苗开辟了布鲁氏菌病防治的新领域,将更有效地推动布鲁氏菌病的防治效果。[关键词]　布鲁氏菌病;布鲁氏菌;流行病学;诊断;疫苗毛开荣(1958年～),男,副研究员,从事兽用生物制品的研究与检验。

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella )引起的一种人畜共患传染病,在世界各地都有广泛流行,每年因此造成的经济损失高达数亿美元,而且此病还会对人类健康造成严重威胁。20世纪90年代,此病在马尔他和阿曼的再度爆发,表明了消灭此病的艰难

[1]

。

由于带菌动物是其他动物和人类布鲁氏菌病的主要传染源,因此,对动物布鲁氏菌病的防治就成为本病防制的关键。迄今,至少已有5种技术成熟或比较成熟的布鲁氏菌病疫苗可供免疫预防,有多种技术成熟的血清学方法可供诊断使用。诊断试验可用国际标准来标定、比较。

在新技术的研究方面,对新型疫苗、诊断方法的研究已有相当多的报道,如粗糙型疫苗、组分疫苗、独特型抗体疫苗、基因疫苗、ELISA 诊断技术、PCR 诊断技术、免疫层析诊断技术和免疫渗滤诊断技术等。将来还会有更多、更有效的布鲁氏菌病防治技术供我们选择。1　流行病学

1.1　牛种布鲁氏菌病　流行于世界各地,主要由生物1、2、3型菌引起,可感染奶牛、黄牛、水牛、鹿、骆驼、马、犬等家畜和其他野生动物。人易感。1.2　羊种布鲁氏菌病　主要在中东等亚洲国家及

南美洲流行,非洲有零星散发,以生物1型菌引发致病为主。其感染动物与牛种布鲁氏菌一样广泛,但以绵羊、山羊感染为主。牛感染羊种布鲁氏菌已成为南欧、以色列、科威特和沙特阿拉伯地区的严重问题。由于对牛感染羊种布鲁氏菌缺乏有效的免疫措施,因而在这些地区由此而引发的公共卫生问题越来越严重。

1.3　猪种布鲁氏菌病　几乎遍布全世界,感染猪、野猪、野兔及啮齿目动物,主要由生物1、3型菌引起。通常情况下,其流行程度比较低,但在南美和东南亚的流行程度较高,巴西和哥伦比亚等出现过猪种布鲁氏菌生物1型感染牛的情况[2]。猪种布鲁氏菌比牛种和羊种布鲁氏菌更易通过生殖道传染。猪种布鲁氏菌生物2型不同于生物1、3型,它主要传播于欧洲,以感染野兔为主。在北美和俄罗斯的北极圈地区曾出现过猪种布鲁氏菌生物4型引起该病的爆发流行[3]。

1.4　绵羊副睾种布鲁氏菌病　主要在大洋洲国家(澳大利亚、新西兰等)流行,但北美、南美、欧洲和南非也有过报道。感染动物仅限于绵羊,也有个别山羊感染的例子。已证实绵羊附睾种布鲁氏菌不感染人。

1.5　犬种布鲁氏菌病　在欧美、亚洲、非洲都有流

行。已经报道存在此病的国家有美国、墨西哥、阿根廷、西班牙、中国、日本、突尼斯等。除犬科动物敏感外,其他动物的感染率很低,有感染人的情况,但比较少见,亦不严重[4]。

1.6　海洋种布鲁氏菌病　从海洋哺乳动物分离到的布鲁氏菌暂时命名为海洋种布鲁氏菌(Brucella maris),是由英国和美国首先分离到的,具有人兽共患性。许多海洋哺乳动物,包括海豹、海豚、海狮、鲸鱼等都能被感染。有过实验室感染海洋种布鲁氏菌的情况,但未见报道。与感染的海豹或鲸类长期接触的工作人员亦可感染此病[5,6]。

感染布鲁氏菌病的病人极少会成为传染源,至今只有很少几篇关于孕妇传染胎儿和性接触感染的报道[7,8]。

2　诊断

诊断技术一直是布鲁氏菌病研究的重要领域。在20世纪80～90年代,分子生物学的飞速发展有力地推动了包括布鲁氏菌病在内的疫病诊断技术。

2.1　病原学诊断　布鲁氏菌的病原学诊断除通过病料直接涂片染色镜检外,已有用过氧化物酶标记或荧光标记的特异性免疫染色检验技术。DNA探针和PCR技术有望在不久的将来成为病原诊断的实用方法。最近,已有一种叫做野外脉冲凝胶电泳的技术用于布鲁氏菌病原鉴定,这种技术可以鉴别布鲁氏菌各个种[9]。

S19和RB51疫苗菌株已可以用PCR技术鉴定[10,11]:S19的赤鲜醇敏感基因缺失702bp(其他布鲁氏菌都有1063bp,S19只有361bp);RB51菌株编码葡胺聚糖酶的wbo A基因发生了变异。PCR鉴定技术所用引物为:

Primer1:5'T TA AGC GCT GAT GCC ATT TCC TTC AC3';

Primer2:5'T TT AGT TTG CCG TAA TAT AGG TCT AGA ACC TGT C3';

Primer3:5'GCC AAC CAA CCC AAA TGC TCA CAA3'。

猪种布鲁氏菌的病原学诊断与血清学诊断一样敏感。一方面是因为猪种布鲁氏菌的分离培养相对比较容易,另一方面是因为猪的血清学诊断价值不如牛羊等动物高[12]。

2.2　血清学诊断

2.2.1　凝集试验　传统的凝集试验(包括试管凝集试验、平板凝集试验)方法在发达国家已基本上停止使用,取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原试验,包括卡片试验、虎红平板凝集试验(RBPT)和缓冲平板凝集试验(BBAT)。在国际贸易中,缓冲布鲁氏菌抗原试验是诊断牛、羊、猪种布鲁氏菌病的指定筛选试验。这些常规血清学诊断试验(尤其是凝集类试验)是基于抗体对抗原表面多糖O-链的检测。光滑型菌的脂多糖(S-LPS)含有N甲酰化聚合物(N甲酰基4

氨基4,6异脱氧甘露糖)组成的多糖O-链,而粗糙型菌的脂多糖(R-LPS)缺乏多糖O-链。但与布鲁氏菌有交叉反应的细菌,如耶尔森氏菌O:9,亦有类似的脂多糖O-链结构[13]。

2.2.2　补体结合试验(CFT)　CFT至今仍是布鲁氏菌病的重要诊断方法,是国际贸易指定用于牛、羊、绵羊副睾种布鲁氏菌病诊断的确诊试验。但是,CFT不适合作为猪的个体诊断,因为猪的补体会干扰豚鼠补体而使得补体结合试验的敏感性降低38%～49%。尽管如此,欧盟和其他一些国家还是强调,猪的补体结合试验价应低于20个国际单位[14]。

2.2.3　乳环试验(M RT)　该试验是奶牛布鲁氏菌病监测的主要方法。

2.2.4　酶联免疫吸附试验(ELISA)　ELISA法与CFT效果相当,操作却更为方便,它既可以作为确证试验,又可以作为筛选试验。目前只有牛种布鲁氏菌病的ELISA试验是国际贸易中的指定试验。这种ELISA方法不但可用于血清学诊断,还可用于乳汁检查。

猪种布鲁氏菌病和绵羊副睾种布鲁氏菌病亦已有成熟的ELISA诊断技术[15]。ELISA方法在其他种布鲁氏菌病上的应用还需进一步改进抗原和积累数据。

关于ELISA的研究报道相当多,表明这是一种公认的比较有前途的诊断方法。ELISA方法的关键在于抗原的选用。在已经标准化了的牛种布鲁氏菌病ELISA诊断中,使用了S-LPS抗原。另外,从牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌获得的能表达高度免疫原性蛋白的基因,可生产用于鉴别S19和Rev.1疫苗免疫与自然感染的蛋白。

2.2.5　其他血清学诊断技术　由于凝集试验不适合绵羊副睾种布鲁氏菌病的诊断,一种琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验就成为绵羊副睾种布鲁氏菌病的常用诊断方法,但未被采纳为国际贸易指定试验。对猪种布鲁氏菌病来说,没有一种传统的血清学诊

断方法是适用的,主要的问题在于断奶后2～3月龄的猪是最易感的,但它们对感染的凝集类抗体的应答很有限[16,17];再有,耶尔森氏菌O:9感染在猪群非常普遍,而布鲁氏菌传统试验所用抗原的主要有效成分———LPS与耶尔森氏菌O:9的LPS难以区分;另外猪血清有时还有非特异抗体(主要是IgM),对凝集类试验,尤其是SAT影响较大。因此,对猪布鲁氏菌病的诊断,流行病学显得尤为重要。一种免疫荧光试验已用于猪种布鲁氏菌病的鉴别诊断[18],可排除与耶尔森氏菌的交叉反应。变态反应试验对猪种布鲁氏菌病诊断有着很高的特异性,亦不与耶尔森氏菌发生交叉反应,但敏感性与凝集试验一样差,不适合作为个体猪的诊断。

3　疫苗

目前世界上广泛应用的布鲁氏菌病疫苗有2种:S19和Rev.1。一些国家也在使用自己研制的疫苗,如中国的S2、M5活疫苗,俄罗斯的牛种布鲁氏菌82、82pn和75/79活疫苗等。在美国阿拉斯加州的驯鹿中流行猪种布鲁氏菌生物4型感染的疾病,当地采用猪种布鲁氏菌生物4型佐剂灭活苗作为免疫预防用。有些布鲁氏菌病疫苗曾经在较大范围内使用过,但由于经过一定时间的实际应用后,发现效果不理想,逐渐停用或少用,如H38、45/20佐剂疫苗。还有些疫苗只经过短时间的实际应用,如1950年Kotlyarova研制的牛种布鲁氏菌104M 活疫苗,1960年Yuskovets MK等研制的用于绵羊免疫的牛种布鲁氏菌68活疫苗,1952年Chernr-shava等研制的用于绵羊免疫的猪种布鲁氏菌B61活疫苗,1956年M aiboroda研制的用于牛和猪的ULEV。Cedro等在阿根廷曾经应用过活的牛种布鲁氏菌Viejo与灭活的猪种布鲁氏菌制备的混合疫苗。自20世纪50年代开始,粗糙型布鲁氏菌疫苗一直是布鲁氏菌病疫苗研究的热点之一,已报道实验室试验有效的不少于20种,包括早期Jones 等[19]研制的R6、R7灭活佐剂疫苗和后来的45/20灭活佐剂疫苗,但最后都因免疫效果差或不是完全的无凝集原性而停止使用。美国研制出一种粗糙型牛种布鲁氏菌活疫苗RB51[20],据报道有相当于S19疫苗的免疫效力,而且不干扰常规血清学诊断,在美国已获准正式使用。我国殷善述等亦研制了一种粗糙型羊种布鲁氏菌活疫苗M111[21],对绵羊、山羊都有较好的免疫保护力,同样对常规血清学诊断不产生干扰。3.1　粗糙型牛种布鲁氏菌活疫苗RB51　RB51是20世纪90年代美国研制的一株粗糙型牛种布鲁氏菌疫苗,是由牛种布鲁氏菌2308在含有利福平的培养基上培养获得的。RB51菌株的脂多糖缺乏O 链,通过各种动物体内外试验表明,其粗糙型特性非常稳定,不管动物年龄、免疫剂量大小、注射次数多少,都不会诱导产生常规血清学试验或ELISA 试验可检测到的抗O链抗体。RB51是一株弱毒菌株,小鼠、豚鼠、山羊和牛的研究结果表明,RB51于短期内就会在体内被清除,极少导致或不导致流产,一次性免疫牛的效果与S19相似[20]。最近,对布鲁氏菌病高度流行和低度流行地区的免疫试验表明,RB51菌株产生的免疫力(在免疫接种后一年)近似于或高于S19菌株产生的免疫力。

用RB51免疫后,所有动物的常规布鲁氏菌病血清学试验依然是阴性。这一特性对于有效地清除牛种布鲁氏菌病是非常重要的。用它代替S19疫苗将会减少假阳性反应。

RB51对牛(包括野牛)具有良好的免疫效果。但对牛以外的其他动物的应用价值,还需要做进一步的评价。

3.2　粗糙型羊种布鲁氏菌活疫苗M111　M111疫苗具有很好的安全性,其毒力低于S19、Rev.1、M5和S2,亦具有不诱导产生针对S LPS多糖O

链抗体的特点。对近万头羊(包括绵羊、山羊和奶山羊)免疫后的血清学检查结果表明,M111疫苗免疫不会诱导被免疫动物产生布鲁氏菌病常规血清学诊断(包括试管凝集试验,平板凝集试验抗原,虎红平板凝集试验,补体结合试验)抗体,对实施布鲁氏菌病检疫不会产生任何干扰。上述血清学特性,有利于疫区结合检疫措施更快地控制布鲁氏菌病的流行,同时也为布鲁氏菌病控制地区提供了一种有效的预防措施,以保护本地区羊免受外来布鲁氏菌病感染的威胁,巩固布鲁氏菌病防治成果。此外,它对我国以羊布鲁氏菌病为主的布鲁氏菌病防治也有着重要意义[21]。

M111疫苗对300多头羊(包括绵羊、山羊、奶山羊)的效力试验结果表明,M111疫苗口服的免疫保护力可达75%以上,注射的免疫保护力可达78%以上,已与S2、M5疫苗的效果接近或相当。M111疫苗的有效免疫期为一年。

对布鲁氏菌病流行疫区的应用结果表明,结合检疫措施,M111疫苗可更有效地减轻布鲁氏菌病

的流行程度,更快地达到控制布鲁氏菌病的目的。在一个感染率为10%的羊布鲁氏菌病暴发流行点,使用M111疫苗免疫后一年,感染率降低到1.12%,免疫后二年降到0.8%。另一个布鲁氏菌出菌率2.3%、流产率6.6%的疫区,用M111免疫后一年,不再分离到布鲁氏菌,流产率亦降到4.4%,第二年就不再发生流产。

至今,已用M111疫苗免疫了上百万动物,结果表明此疫苗安全有效,特别是不干扰常规血清学诊断的特点使其比传统的布鲁氏菌病疫苗更利于综合预防措施的实施,更利于快速控制布鲁氏菌病的流行,而且解决了布鲁氏菌病控制地区的免疫预防问题。

现今,研究新疫苗大致从以下三方面着手,一是继续选择具有良好免疫原性的菌株,二是保护性抗原修饰疫苗,三是DNA疫苗。其中保护性抗原修饰疫苗可能比较有前途,目前的技术已经有可能提高细菌对保护性抗原的表达。Cu/Zn过氧化物歧化酶,L7/L12核蛋白和Omp10、Omp16、Omp19、Om p25、Omp31、Omp2b、Omp1等外膜蛋白是已知的良好的保护性抗原成份。当然,布鲁氏菌体内免疫是非常复杂的,进一步了解这些免疫机理将有助于新疫苗的研究开发。

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3.4　试剂盒A、B操作时间比试剂盒G缩短30 min,但试剂盒G操作说明书清楚,可操作性强。3.5　三种试剂盒样品添加试验所用空白牛奶、鸡肝均为同一批,但空白样品测定结果不尽相同,如试剂盒A的牛奶空白结果为0.45ng/mL,试剂盒B和G 均为0.15ng/mL。这是由于采用试剂盒G时,牛奶经提取后,溶液澄清,无混浊;采用试剂盒B时,牛奶未经提取,直接应用,溶液混浊,但检测方法中设有牛奶缓冲液加入标准溶液中,使标准溶液与样品混浊度相同;采用试剂盒A时牛奶经10倍稀释后,直接应用,溶液混浊,使空白结果偏高。

3.6　对这三种试剂盒从灵敏度、板内、板间差异、样品添加回收试验几方面考虑,认为德国试剂盒具有灵敏度和样品回收率高的特点。

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Evaluation on three kinds of ELISA kits for chloramphenicol

ZHOU De g ang,FANG Hui,ZUO Wen xia,GUO Zhi hong,YAN Xiao feng

(Beijing Institute of Veterinary Drug C ontrol,Beijing100012;China)

A bstract:Three kinds of ELISA kits fo r chloramphenicol were tested respectively.Kit A w as from Euro Diagnostica Company in America,kit

B w as from RANDOX company in Britain and kit G w as from r Bio-pharm company in Germany.The results showed that the corresponding concentration w ith50%inhibition of kit A,B or G was less than1ng/m L respectively.The measuring range of kit A w as0.1～2.0ng/m L,kit B w as0.14～21.0ng/mL and kit G w as0.05～4.05ng/m L.the inter assay variations w as less than11.3% and the intra assay variations w as less than17.4%.The recovery w as70%～120%.

Key words:milk;chicken liver;chloram phenicol;ELISA kit;drug residue;control

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Advances in animal Brucellosis control

M AO Kai rong

(China Institute o f Veter inary Drug Con trol,Beijing,100081;Ch ina)

A bstract:Brucellosis is still prev alent in the w orld today.Brucella maris have been found ex cept Brucella abortus,Brucella melitensis,Bruc ella suis,Brucella ov ies and Bruc ella c anies.Not only isolated o rgan,but also more sensitivity methods such as PCR and DNA probe have been applied to confirm.ELISA has been w idely used to detect brucellosis in the world.Two new rough ty pe Brucella vaccine,RB51and M111,are more effective fo r preventing brucellosis.

Key words:Brucellosis;Brucella;epidemiology;diagnosis;vaccine