高效液相色谱的应用研究进展
高效液相色谱的应用研究进展
【摘要】从1903年，色谱的开始使用，各种色谱技术应运而生，其中高效液相色谱由于其分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，作为物质分离的重要工具，在各个方面都取得了很大的发展，并且出现了许多的新型色谱。本文综述了变性高效液相色谱在生物遗传方面的应用，及高效液相色谱在医学方面的应用。
【关键字】HPLC（高效液相色谱） DHPLC（变性高效液相色谱）
1.高效液相色谱概要
色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成。这种色谱称为高效液相色谱(1iighperformance liquid chromatography，HPLC)。
由于高效液相色谱法有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物学与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛。另外，在高效液相色谱法的基础上不断发展，变性高效液相色谱法(DHPLC)随之兴起，广泛用于生物学、遗传学等领域。
2.高效液相色谱在生物学的应用
变性高效液相色谱法(DHPLC)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下，由荧光检测被分离的DNA样品，从而实现对DNA不同的分析它因使用的温度不同而有不同的应用价值：①在非变性温度(40℃～5O℃ )条件下对不同长度的双链DNA进行分离，用于定量反相PCR、长度多态性分析以及杂合性缺失(LOH)分析等；②在部分变性温度(51℃～75℃)条件下进行基因突变，单核苷酸多态性和CpG甲基化的检测；③在完全变性温度(70℃～8O℃)条件下对寡核苷
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酸进行质量控制和纯化，RNA分离及已知位点基因型的分析等。
曹际娟等利用DHPLC 能够吸收检测DNA 片段并具有高度敏感性的特点，根据O1、O139、非01、非O139群霍乱弧菌外膜蛋白ompW 基因的特有基因组序列，进行PCR 扩增，然后利用DHPLC 检测，一次可同时自动化分析数百个样本，达到快速检测的目的．PCR-DHPLC 技术与实时PCR 技术检测致病菌相比，同样具备快速的优势，但在测试成本上却远远低于实时PCR 技术，因而具有更广阔的应用前景。[2] 曲直等对高效液相色谱法分析放线菌渊G+C 冤mol%含量的方法进行了摸索，找到了分离分析的较佳条件，用此方法对分离的8 株红树林放线菌进行了G+Cmol%含量的测定，实验结果表明，DNA 碱基分离效果好，无杂峰干扰，通过分析验证所测得的G+Cmol%含量与预期值相符，且检测速度快，因此高效液相色谱法为直接测定渊G+C 冤mol%含量提供了一种快速简洁而精确的方法。[3]
3.高效液相色谱在遗传学的应用
变性高效液相色谱( denatu ring h igh perfo r2mance liqu id ch romatography, DHPLC) 是一项在单链构象多态性( single2st rand confo rmat ional po lymo rph ism ,SSCP) 和变性梯度凝胶电泳(denatu ring gradien t gelelect ropho resis, DGGE ) 基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术。变性高效液相色谱(dHPLC)是一种高通量筛选DNA 序列变异的新技术． 该方法具有自动化、准确快速、检出率高等特点，现已广泛应用于与人类疾病相关基因的突变分析其原理是通过HPLC 在部分变性的条件下将发生错配的异源杂合双链DNA 与完全匹配的同源双链DNA 分离开来。施锦绣通过对DHPLC 与DNA 测序进行比较,与直接测序相比较, 有自动化程度高、价格便宜的优点。通过DNA 样品混合池, 在大量样本的筛检中DH2PLC 还有快速检测的优势。因此,DHPLC 不失为大规模开展人类基因组SN P 筛检和分型的一种有效手段。[4]韩宗福等利用CAU36和CAU328两个EST —SSR 标记，结合dHPI C 技术，鉴定了35份不同小麦品种(系)中的等位基因变异类型，并配制了4×6的小麦双列杂交组合，以抽穗期的穗下节节问为材料，对这两个基因在杂交F 代中的等位基因表达差异进行了分析，发现其中一个基因的等位表达变异与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性．[5]
4.高效液相色谱在医学的应用
HPLC 在测定蛋白活性上有重要的应用。应用HPLC 测定肝细胞色素P450活性对新药临床安全性评价和药物相互作用研究具有重大意义。金科涛等人应用液相一质谱串联技术
(LC-MS／MS)通过用多种CYP45(I特异性底物与微粒体蛋白共同孵育的方法可以同时检测
多个底物的代谢物，以评价各种CYP450亚型酶的活性。
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近年来，各种现代分析手段在药物分析中的应用广泛，受到了药物分析工作者的关注。铂类配合物作为一类无机抗癌药物，涉及的主要化学分析手段有炽灼残渣法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法、紫外分光光度法及毛细管电泳法等。其中，高效液相色谱法因分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，已成为近年来铂类抗癌配合物化学分析最常用的手段.
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高效液相色谱作为物质分离的重要工具，在各个方面都取得了很大的发展，出现了许多的新型色谱。在分配机制方面，亲和色谱则根据另一类分配机制而进行分离的新型色谱。它是利用生物大分子与其相应互补体间特异识别能力进行多次差别分离的一种色谱。其具有选择性高、操作条件温和的特点。在流动相方面，超临界流体色谱以超临界流体为流动相。混合物在超临界流体色谱上的分离机理与气相色谱及液相色谱一样，即基于各化合物在两相间的分配系数不同而得到分离。超临界流体色谱融合了气相色谱和液相色谱的一些特征，具有比气相色谱和液相色谱更广泛应用范围。在固定相方面，高分子手性固定相
实现了手性药物的分离[8]
。同时，近年来，为了使物质的检测更加准确方便，出现了各
种HPLC串联技术。以HPLC—MS为例，它结合了HPLC对样品高分离能力和MS能提供相对分子质量与结构信息的优点，在药物、食品、环境分析等领域发挥功能，提供可靠的数据。【参考文献】
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高效液相色谱原理及应用
高效液相色谱原理及特点 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一、高效液相色谱仪有哪些特点？ 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350 ×105Pa。 2．高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。3．高效：近年来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4．高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。5．适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离 能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，而技术平台〉〉〉 高效液相色谱仪原理 不需要汽化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70%～80%。 二、高效液相色谱法可分为哪几种主要类型？各自的分离原理是什么？高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换 液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：
高效液相色谱的发展及其应用
高效液相色谱的发展及其应用 摘要：了解高效液相色谱[1]的发展历史，知道高效液相色谱的组成结构、操作 原理以及方法等等。掌握它的分类方法，通过比较得出高效液相色谱分析方法的优点与缺点。明确高效液相色谱的应用，最终分析结果。 关键词：高效液相色谱；发展历史；应用 高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 1、高效液相色谱的发展历史 1.1高效液相色谱的历史 高效液相色谱作为色谱分析法的一个分支，是在二十世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。 1.2高效液相色谱与其它色谱的比较[2] 1.2.1与经典液相色谱的比较 经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 1.2.2与气相色谱法的比较 高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析。 2、高效液相色谱 2.1高效液相色谱的特点 2.1.1高效液相色谱的优点 1.分辨率高于其它色谱法，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果； 2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成； 3.重复性高、样品不被破坏、易回收； 4.高效相色谱柱可反复使用； 5.自动化操作，分析精确度高；
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展_张良晓
高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展 张良晓 (中国地质大学(武汉)材料科学与化学工程学院,武汉 430074) 摘 要 本文综述高效液相色谱法作为药物分析的常规方法,药物动力学研究,药物含量测定等药物分析上的应用研究进展,并对应用研究的方向进行了预测。 关键词 高效液相色谱;药物分析;应用研究;进展 高效液相色谱法(H igh -Perfo r m ance L iqu id Ch rom a tog rap hy ,H PL C )是以液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20%,而80%则需用高效液相色谱来分析。液相色谱根据分离机理的不同可分为液液分配色谱、液固吸附色谱、离子交换色谱和排斥色谱(或凝 胶渗透色谱)[1] 。高效液相色谱已经广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面[2]。 近年来高效液相色谱法在药物分析中占主要地位。据美国药典22版载,H PL C 在含量测定方法中位居第一。其特点是分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样 品处理较简单[3] 。本文在按在药物分析中的作用从以下几个方面综述了高效液相色谱法在药物分析的研究进展。 1 高效液相色谱作为常规分析方法在药物分析中的应用 高效液相色谱法作为药物分析中的最主要的分析方法,常被作为常规分析和检验方法。近年来在这 个方面的研究比较多,刘树业.等[4] 为时刻监控治疗肝癌时的抗癌药物剂量即血中的药物浓度,提高疗效,减少副作用,采用紫外-H PL C 法对血中和组织中的阿霉素浓度进行分析.用U V -240紫外分光光度计,B ECK M AN 332型高效液相色谱仪,采用反向色谱法.秦.等[5]针对近几年国际奥委会医学委员会公布的禁用表中新增药物及一系列利尿剂的相关化合物进行了研究,比较了不同的提取方法及回收率,研究了几种药物的排泄情况;建立了同时分析13种利尿剂的高效液相色谱测定方法,检出限小于5ng 。左雄军.等[6]用0.02m o l L 的三羟甲基胺基甲烷(用磷酸调pH 值至7)和甲醇(含2%乙酸和0.25%庚烷磺酸钠)作流动相进行梯度洗脱,建立了脂性油膏药物中黄芩甙含量的反相高效液相色谱分析方法,本法分析速度快,重现性好,黄芩甙的平均回收率为103.7%。张晓青.等[7]采用反相离子对高效液相色谱法研究了唑来膦酸及其有关化合物的色 子河沉积物中重金属污染[J ].北京大学学报,2000, 36(4):525-530. [3] 王贵.胶州湾李村河口沉积物重金属及稀土元素演化 模式与环境记录[D ].长春:吉林大学图书馆,2003.[4] 廉雪琼.广西近岸海域沉积物中重金属污染评价[J ]. 海洋环境科学,2002,21(3):39～42. [5] 李任伟.沉积物污染和沉积环境学[J ].地球科学进展, 1998,13(4):398～40 [6] 柳林,许世远,陈振楼,余佳.上海滨岸潮滩表层沉积物 中重金属的空间分布与环境质量评价[J ].上海地质,2000,(1):1-5. [7] 腾彦国,庹先国,倪师军,张成江.应用地质累积指数评 价沉积物中重金属污染[J ].环境科学与技术,2002, 25(2):7-9. [8] 刘文新,栾兆坤,汤鸿霄.乐安江沉积物中重金属污染 的潜在生态风险评价[J ].生态学报,1999,19(2):206-211. [9] 刘芳文,颜文,王文质,古森昌,陈忠.珠江口沉积物重 金属污染及其潜在生态危害评价[J ].海洋环境科学,2002,21(3):34-38. [10] 许金生,冯泳兰,袁亚莉,邓健,陈文.大源渡库区表层 沉积物中重金属污染状况[J ].环境化学,2002,21(1):100-102. 第一作者简介:王贵(1961-),男,汉族,内蒙古包头市人,教授,主要从事环境地球化学研究工作。 The a ssess m en t of heavy m eta l pollution for the sed i m en ts of J i aozhou Bay W A N G Gu i ,YA O D e (Chem istry D epartm en t ,B ao tou T eacher’s Co llege ,B ao tou ,Inner M ongo lia 014030) (Co llege of Resource and Environm ental Engineering ,Shandong U niversity of Techno logy ,Zibo ,Shandong 255091)Abstract :Po ten tial eco logical risk (R I )and Geoaccum u lati on index (Igeo )w ere ap lied fo r heavy m etal po llu ti on assess m en t in J iaozhou B ay .T he resu lts show ed that the m iddle level po llu ti on s w ere ex isted in J iaozhou B ay .T he Igeo indexes w ere from 1to 4and R I values w ere m o stly betw een 100 ～300.A h igher R I value of abou t 600w as app eared in the sedi m en ts of H ai po R iver estuary ,w h ich show ed a com p aratively heavier po llu ti on ex ist there .T he con sequence of po ten tial eco logical risk fo r heavy m etals w as Cd >Pb >Cu >A s >Zn . Key words :J iaozhou B ay ;sedi m en t ;heavy m etal ;po llu ti on ass ;ess m en t 收稿日期:2005年6月28日 3 2005年第7期 内蒙古石油化工
高效液相色谱方法的验证
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
高效液相色谱法的应用
高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至
浅谈高效液相色谱的应用与发展
浅谈高效液相色谱的应用与发展 Peishan Zou 摘要：高效液相色谱分析是一种高效、快速、准确的分离分析方法。本文旨在从仪器原理、仪 器结构、应用范围、检测效率、检测准确度等方面简要介绍液相色谱分析法，及在不同领域的 应用情况和本领域分析方法中的重要性等角度进行阐述。着重对高效液相色谱的发展现状进行 总结，并根据发展趋势而延伸，预测未来液相色谱仪的技术发展路线。 关键词：高效液相色谱；应用；发展现状；发展趋势 1. 高效液相色谱的发展历史简况 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。 高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 高效液相色谱法是目前各种色谱模式中应用最广的一个领域，在化合物的分析方面，世界上约有80% 的化合物，如括高分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC(如正相 HPLC、反相 HPLC、离子交换色谱和离子色谱、体积排除色谱、亲合色谱等等)进行分离分析[1]。 站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。 2.高效液相色谱仪的原理与构造
高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景
高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景 摘要：高效液相色谱分析是一种高效、快速、准确的分离分析方法，在石油化工、生命科学、环境、医药及食品安全等领域有着广泛的应用。本文旨在简要介绍液相色谱分析法在不同领域的应用情况，并从使用频度、应用范围、检测效率、检测准确度及在本领域分析方法中的重要性等角度进行阐述。 关键词：高效液相色谱仪；石油化工；食品安全 中图分类号： O657.7+2 文献标识码：A 高效液相色谱在20世纪70年代获得迅猛的发展，是一种常规的分离技术色品分析仪的应用最广是在化学领域上，食品与环境的领域上也出现多方面的应用。其中，化合物的分析就包括高分子化合物，离子型化合物，热不稳定化合物以及生活性的化合物等都可以用不同的方式进行离子交换色谱和离子色谱，体积排除法，亲和色谱法等，进行离子分析。 一、高液相色谱分析仪发展现状 随着高效液相色谱分析仪的转换，高效液相色谱仪器成为国际分析化学界发展较快的学科，高效液相色谱是由液相系统组成，分别是检测器，色谱柱，记录仪等三个方面的部分组成，为了取得更好的效果，科研工作者需要提升准确度以及精确度和灵敏度显示科研工作的重要性。 经常采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(OC)进行含量测定，而液相色谱法(LC)只是用于对组分标样的测定和分离的可能性研究。色谱法是一
种分类和混合的开发技术，是在1913年由俄国植物学家在实验中发现并且命名的技术，将植物的叶色素和石油醚，通过装有白色的碳酸钠颗粒的玻璃管，再用石油醚进行全面的冲洗，玻璃管的内壁出现不同颜色的色带，随着冲洗剂的不断转变，色带以不同的颜色进行冲洗，不同的色带以不同的速度向下移动并且分离，色谱法由此得名。 二、色谱分析仪的使用及工作原理 色谱柱通称为不锈钢柱，内装填充剂，常用的是硅胶作为填料，用于正相色谱，化学键固定相，根据色谱化学键的固定相，可以用来作为反相或者是反高的要求。输液系统要为 HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，同时还要提供精度好、准确度高的多元溶剂梯度。早在2003年国家标准中就已经规定了液相色谱法检测食品中糖精钠和安赛蜜的检测方法，在质检机构中已经将之作为一种常规检验项目的基本检测方法来进行操作。近几年随着色谱柱填充制备技术的高速发展，已经可以一次性分离糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、柠檬黄、日落黄、胭脂红。 （一）、高效液相色谱仪的工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程高的要求。 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相
高效液相色谱法测定手册
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱在生物制药中的应用
高效液相色谱在生物制药中的应用 高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。 1.高效液相色谱的介绍 高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型： 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）
高效液相色谱的应用与发展前景
高效液相色谱的应用呵发展前景 液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过 改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快. 分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。 高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。 对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个 不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。 2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优 点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技 术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
高效液相色谱法在药物分析中的研究进展
高效液相色谱法在药物分析中的研究进展 摘要：高效液相色谱法作为药物分析的常规方法应用广泛，本文对其在药物含量测定及药代动力学研究上的应用进行综述。 关键词：高效液相色谱法；药物分析；研究；进展 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatogra phy，HPLC）是一项柱色谱分离技术，因分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等特点已广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定。随着与质谱、核磁共振波谱等的联用技术的发展，HPLC的应用将愈加广泛[1]。 一、高效液相色谱法作为药物分析的常规方法在药物分析中的应用 高效液相色谱法作为药物分析中的最主要的分析方法，常被作为常规分析和检验方法[2]。近年来这个方面的研究较多，陈英红等通过对人参糖肽注射液中多糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化，采用高效液相色谱法进行组成糖分析，建立了人参糖肽注射液特征图谱。该方法操作简便，分离度高，重复性及稳定性良好，可有效控制人参糖肽注射液的质量，同时可作为酸性杂多糖的测定方法。陈金泉等建立
抗艾滋病药物更昔洛韦、阿昔洛韦、喷昔洛韦和伐昔洛韦的HPLC快速检测方法。采用同一色谱体系实现对四种药物的分析，该检测方法快速、简便，准确。这些研究充分利用了高效液相色谱操作简单，灵敏度高，回收率高的特点。 二、高效液相色谱在药物分析测定中的研究进展 高效液相色谱法是一种集分离和测定为一体的分析方法，其作为药物分析中药物鉴别、杂质检查及含量测定的重要方法。 （一）在鉴别中的应用。HPLC用于药物鉴别时，一般规定按供试品含量测定项下的高效液相色谱条件进行实验。要求供试品和对照品色谱峰的保留时间一致。在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数。如头抱拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。 （二）在有关物质检查中的应用。目前药品的有关物质的检查方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、紫外分光光度法（UV）及容量分析法等多种。近年来随着仪器分析技术的发展，HPLC 分离效果佳分离速度快的特点使其成为最主要的检测有关 物质的方法。 （三）在药物（含中药）成分含量测定上的应用。在药物分析中，高效液相色谱由于其专一性，灵敏度高，快速简
游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法)
八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定 本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。 （一）方法提要 试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。 （二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。 （三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。 （四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样
高效液相色谱仪的研制与技术开发
高效液相色谱仪的研制与技术开发 --新型二极管阵列检测器 洪群发张庆和李彤张维冰张玉奎 （大连依利特分析仪器有限公司，中国科学院大连化学物理研究所，大连，116011） 摘要：介绍一种新型的高效液相色谱二极管阵列检测器。该仪器采用光纤传导技术和全封闭光学系统，具有较高的光谱分辨率和检测灵敏度。采用虚拟设备驱动技术配合功能强大的数据处理系统可为用户提供色谱、光谱，三维谱图及色谱峰纯度等大量的信息。 关键词：高效液相色谱；二极管阵列检测器；虚拟设备驱动 Research and Developmemt on High Performance Liquid Chromatographic Instruments --A Novel Diode Array Detector Hong Qunfa, Zhang Qinghe, Li Tong, Zhang Weibing, Zhang Yukui (Dalian Elite Analytical Instrument Ltd. Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Science, Dalian, 116011) Abstract: A novel diode array detector (DAD) for high performance liquid chromatography (HPLC) was introduced. A full-closed optical system and quartz light fiber based transmission technique were used in the instrument, and high spectral resolution and detect sensitivity were obtained. Virtual device driving technique was used, and combined with the powerful data system, the instrument can provide a lot of information including chromatogram, spectra of components, three dimension information and peak purity results. Key words:High performance liquid chromatography; Diode array detector; Virtual device driving
实验6 高效液相色谱法的定量分析
实验6 高效液相色谱法的定量分析 一. 实验目的 1. 了解HPLC仪器基本结构,熟悉高效液相色谱仪的使用方法、 2. 掌握液相色谱定性分析的方法； 3. 加深对色谱分离原理的理解，掌握主要实验条件的选择 二. 实验原理 HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC还有电脑控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。 色谱定量分析的依据是被测组分的量与其峰面积成正比。但是峰面积的大小不仅取决于组分的质量，而且还与它的性质有关。即当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同。 保留时间(retention time，t R)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 峰面积A：色谱峰与峰底之间的面积。峰面积一般用mm2、mm×min或检测器的输出的信号单位表示。色谱峰的面积可由色谱仪中的积分仪求得，也可通过以下方法求得： 对于对称的色谱峰：A=1.065h W1/2 对于非对称色谱峰：A=1.065 h (W0.15+W0.85)/2 三. 实验设备 高效液相色谱（HPLC）仪：waters e2695高液相色谱仪配2998二极管阵列（PDA）检测器，自动进样器，色谱柱：Kromasil C-18 250*4.6mm 四．实验内容与主要步骤 1.样品：喹乙醇经0.45 m滤膜过滤至1 m L的样品管中。 2.色谱条件： 流动相：甲醇：乙酸铵溶液（pH=4，0.02mol/L）=2：8 检测波长：270nm 流动相流速：1.0ml/min 进样量：10ul 3.开机，平衡： 打开稳压电源，待电压稳定于220 V后，依次打开Varian 210泵，Varian 335 PDA检测器电源开关，计算机主机；显示器。双击鼠标左键打开Varian WS；待屏幕上方出现LC Workstation后，单击鼠标System control连机进入程序。点击Method,编辑方法，点击System Setup最大压力、最小压力，后点击Save。将该方法保存在指定的文件夹中，放上配制好的流动相，由File中打开Activate Method，选择编辑好的方法激活，平衡色谱柱，到基线基