酶工程期末复习题

第一章绪论

问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？

答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。

(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。

(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。

(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。

第二章微生物发酵产酶

1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。诱导物的种类？

答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；

酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；

产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。

分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。

诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？

答：（1）同步合成型特点：

a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。

b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。

（2）延续合成型特点：

a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。

b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。

（3）中期合成型特点：

a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。

b.该酶对应的mRNA不稳定。

（4）滞后合成型特点：

a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。

b.该酶对应的mRNA稳定性高。

选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。

3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？

答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。

（2）表面活性剂的作用：增溶、乳化作用、润湿作用、助悬作用、起泡和消泡作用、消毒和杀菌剂。

4、根据微生物培养方式不同，酶的发酵生产有几种类型？哪种是目前酶发酵生产的主要方式？按酶生物合成的速度把细胞中的酶分几类？酶的生物合成在转录水平的调节主要有哪三种模式？微生物细胞生长过程一般分为几个阶段？

答：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化微生物细胞发酵、固定化微生物原生质体发酵。液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。

按酶生物合成的速度把细胞中的酶分为组成型酶、适应型酶两类

转录水平的调节主要有：分解代谢物阻遏作用、酶合成诱导作用、酶合成反馈阻遏作用。微生物细胞生长过程一般经历4个阶段：调整期、对数生长期、平衡期、衰退期。

5、为什么属于滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？答：是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用，只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。

6、简述微生物发酵产酶过程中工艺条件的控制？(提示: 从pH、温度、溶解氧三方面论述) 答：生产中控制pH值的方法：①调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比；②添加缓冲液维持一定的pH值（如磷酸盐）；③发酵液中pH过高，加糖或淀粉来调节。反之，加尿素或液氨；④通过调节通气量来实现；⑤加酸、碱。

温度的控制方法：一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。

调节溶氧速率的方法：①调节通气量；②调节氧的分压；③调节气液接触时间；④调节气液接触面积；⑤改变培养液性质。

7、在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产率，可以采取哪些措施？

答: 在酶的发酵生产过程中，要使酶产率提高，必需采取一系列的措施，主要有：

(1)使用优良的产酶细胞：通过筛选、诱变、原生质体融合、基因重组、定向进化等手段，获得生长快、产率高、稳定性好的产酶细胞。

(2)使用优良的发酵生产设备：通过精心设计或者选择使用高产、低耗的发酵罐等发酵生产设备。

(3)采用先进的分离纯化技术和设备：采用操作简便、收得率高的分离纯化技术和设备，已达到高产丰收的效果。

(4)控制好工艺条件：在发酵过程中，要根据菌种特性，确定培养基和发酵工艺条件，进行工艺优化，并根据需要和变化的情况及时加以调节控制。

(5)此外还可以采取某些行之有效的措施，诸如添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂等。

8、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。

实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养中，于37℃振荡培养，当OD550达到0.3左右时，将培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17mL培养液。于4个三角瓶中分别添加(A)3mL无菌水; (B)1mL乳糖溶液(0.1mol/L)和2mL无菌水; (C)1mL乳糖溶液(0.1mol/L) 、1mL葡萄糖溶液(0.1mol/L)和1mL无菌水; (D)1mL乳糖溶液(0.1mol/L) 、1mL葡萄糖溶液(0.1mol/L)和1mLcAMP钠盐溶液(0.1mol/L)。然后在相同的条件下于37℃振荡培养2h，分别取样测定β-半乳糖苷酶的活力。

实验结果：(A)瓶和(C)瓶样品的β-半乳糖苷酶活力为0，(B)瓶和(D)瓶样品的β-半乳糖苷酶活力达到1000U/mL左右。

答：从实验方法和结果可以进行下列分析，并得出如下结论：

(1)(A)号瓶为对照，只加入无菌水，结果没有β-半乳糖苷酶产生，表明β-半乳糖苷酶不是组成酶，而是诱导酶。

(2)(B)号瓶加入了半乳糖，结果在2h内β-半乳糖苷酶大量合成，表明乳糖是β-半乳糖苷酶的诱导剂。

(3)(C)号瓶与(B)号瓶相比，在含有乳糖的基础上增加了葡萄糖，结果也没有β-半乳糖苷酶产生，表明β-半乳糖苷酶的合成受到葡萄糖的阻遏作用，由于葡萄糖是一种容易利用的

碳源，其对β-半乳糖苷酶的阻遏作用属于分解代谢物阻遏作用。

(4)(D)号瓶与(C)号瓶相比，增加了cAMP，结果β-半乳糖苷酶又大量合成，表明cAMP 可以使分解代谢物阻遏作用解除。

第三章动植物细胞培养产酶

1、解释超氧化物歧化酶、纤溶酶原激活剂

答：超氧化物歧化酶：是催化超氧负离子进行氧化还原反应，生成氧和双氧水的氧化还原酶纤溶酶原激活剂：可以催化纤溶酶原水解，生成纤溶酶。

2、植物细胞培养、动物细胞培养主要用来获得哪些产物？

答：超氧化物歧化酶、纤溶酶原激活剂等

3、动物细胞培养的方式？

答：a.悬浮培养：主要适用于杂交瘤细胞、肿瘤细胞、以及来自于血液、淋巴组织的细胞。

b.贴壁培养：采用滚瓶培养系统、微载体系统进行培养。

c.固定化细胞培养：锚地依赖性和非锚地依赖性细胞均可固定化后培养。

4、举例说明植物细胞培养产酶的工艺过程？

答：大蒜诱导组织的诱导：优良蒜瓣→4℃保持3周→消毒→洗涤3次→切片→半固体培养基培养→诱导组织

大蒜细胞悬浮培养和分离纯化：诱导组织→25℃，600lux,12h/d培养→分散获得单细胞→过滤→25℃，600lux,12h/d培养→分离纯化→SOD。

5、举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程？

答：以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例：a、人黑色素瘤细胞培养基

b、人黑色素瘤细胞培养

c、组织纤溶酶原激活的分离纯化

6、从外植体获取植物细胞的方法主要有哪些？

答：直接分离法、原生质体再生法、愈伤组织诱导法。

7、动物细胞培养中常有哪种指示剂监测pH？

答：监测动物细胞培养液pH的常用指示剂是酚红

8、动物、植物细胞培养时适宜的温度和pH都是多少？

答：植物：最佳温度26-28℃、最佳pH：5.5-5.8;

第四章酶的提取与分离纯化（一）

1、解释细胞破碎、酶的提取、沉淀分离。

答：细胞破碎：通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。

2、细胞破碎的主要方法？各包括哪些具体方法？

答：机械破碎：捣碎法、研磨法、匀浆法；物理破碎：温度差破碎法、压力差破碎发、超声波破碎法；化学破碎法：有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿，表面活性剂：Triton Tween；酶促破碎：自溶法、外加酶制剂法

3、酶的提取主要方法？

答：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。

4、简述酶沉淀分离的主要方法及原理？

答：盐析沉淀法：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离。等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。有机溶剂沉淀法：利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。复合沉淀法：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离（耐高温，热稳定的蛋白）。

5、酶促破碎法破碎细胞壁时，不同细胞常采用哪些具体的酶？

答：革兰氏阳性菌主要依靠肽多糖维持细胞结构和形态，外加溶菌酶作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键而使细胞壁破坏；酵母细胞的破碎是外加β-葡聚糖酶，使其细胞壁的β-1，3-葡聚糖水解；霉菌可用几丁质酶进行细胞破碎；纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的混合使用，可使各种植物的细胞壁受到破坏，对植物细胞有良好的破碎效果。

6、按照离心机最大转数不同如何分类？

答：低速离心机高速离心机超速离心机

第四章酶的提取与分离纯化（二）

1、解释凝胶层析、亲和层析、膜分离技术。

答：凝胶层析：是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。亲和层析：是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。膜分离技术：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。

2、结晶的主要方法？

答：盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶。

3、根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤分为？根据推动力不同膜分离分为？

答：加压膜分离、电场膜分离、扩散膜分离

4、常用的萃取方法有？

答：有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取、反胶束萃取

5、按照凝胶的组成系统不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分为？

答：连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、梯度凝胶电泳、SDS-凝胶电泳

6、凝胶层析的洗脱中先流出的是？

答：凝胶层析中相对分子质量大的先流出层析柱。

7、超临界流体能够用于物质分离主要原因？

答：在超临界流体中，不同物质有不同的溶解度，溶解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解或溶解度晓得物质分开，然后通过升高温度或降低压力，使超临界流体变为气态而得到所需的物质。

8、在等电点聚焦电泳系统中，形成pH梯度的主要原因？

答：以PAGE为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing-PAGE,简释IEF-PAGE)。

9、简述双水相萃取的概念与特点？

答：双水相萃取：利用溶质在两个互不相溶的水相中溶解度不同而达到分离。特点：双水相萃取中使用的双水相一般由按一定百分比组成互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两者互不相溶的高分子溶液组成，利用溶质在两个互不相溶的水相中溶解度不同而达到分离。10、为什么SDS-凝胶电泳会不受蛋白质分子所带电荷及分子形状的影响？

答：研究结果表明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质分子的氢键、疏水键打开，并与蛋白质分子结合，形成SDS 复合物。在一定条件下，1.4gsSDS与1g蛋白质结合，由于SDS带负电荷，使各种蛋白质-SDS 复合物上带上相同密度的负电荷，而掩盖了不同蛋白质之间原来电荷的差别。此外SDS与蛋白结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成长椭圆形，椭圆的短轴长度均为18A左右，长轴的长度则与蛋白质的分子质量成正比。为此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷及分子形状的影响，而只决定于蛋白质的相对分子质量。

11、酶干燥的方法

答：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥

第五章酶的分子修饰

1、解释酶分子修饰、定点突变、酶的物理修饰、酶的大分子修饰。

答：酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。定点突变：是指DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。酶的物理修饰：通过极端物理条件下（高温、高压、高盐、极端pH值、真空等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的催化特性的变化。酶的大分子修饰：采用水溶性大分子与酶的共价键、非共价键侧链基团结合，使酶分子的空间构象发生变化，从而改变酶的催化特性的方法称大分子结合修饰。

2、酶的分子修饰方法有哪些？（只写蛋白类酶）

答：金属离子置换修饰、大分子结合修饰(共价/非共价)、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、氨基酸置换修饰、酶分子的物理修饰。

3、酶分子修饰的作用？

答：提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变底物专一性、探讨结构与催化特性之间的关系。

4、氨基酸置换修饰的方法？哪种方法常用？

答：化学修饰法、定点突变技术。化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。

5、酶的大分子修饰方法？

将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。

6、列举两个酶分子修饰后酶特性改变的例子。