重组人TRAIL蛋白的原核表达纯化及鉴定

文章编号:049026756(2002)0z 20142204

重组人TRA IL 蛋白的原核表达、纯化及鉴定

周建,彭旭东,张健,高小平3

(成都地奥集团药物研究所,成都610041)

摘要:将含有人TRA IL 蛋白表达质粒的大肠杆菌以IPTG 诱导表达,表达蛋白主要以包涵体形式存在.经菌体破碎、包涵体分离、抽提及复性,用Ni 2N TA Superflow 柱层析及进一步的离子交换色谱分离纯化获得纯蛋白.SDS 2PA GE 显示纯化的蛋白为19kD 的单一条带.Western blot 鉴定表明,纯化的表达产物与抗人TRA I L 蛋白的抗体发生特异性免疫反应.抗肿瘤生物活性测定表明该纯化蛋白对肿瘤细胞的体外生长具有显著的抑制作用.

关键词:TRA IL ;纯化;Ni 2N TA Superflow

中图分类号:Q517;Q782 文献标识码:A

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TN F 2related apoptosis 2inducing ligand ,TRA IL ,亦称Apo2L )是新近发现的一种细胞毒蛋白,其分子结构与TN F 和FasL (CD95)相近,属于TN F 家系成员[1].TRA IL 蛋白具有快速诱导多种肿瘤细胞发生凋亡的作用,而正常细胞受TRA IL 的影响很小[2],因此,TRA IL 作为药物进行肿瘤治疗具有很好的应用前景.人TRA IL 由281个氨基酸组成,研究发现全序列的TRA IL 蛋白无诱导肿瘤细胞凋亡的活性,而去除N 端部分氨基酸后,则具有快速诱导肿瘤细胞凋亡的作用[3～5].据此,我们构建了TRA IL C 端多肽的表达质粒p ET3a/TRA IL ,其中插入的TRA IL cDNA 去除了编码N 端12113氨基酸的碱基序列,保留了编码C 端168个氨基酸的序列.我们在原有研究的基础上,进一步对该TRA IL 蛋白表达质粒的诱导表达、表达蛋白纯化以及生物活性进行了研究.

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　质粒、菌株和细胞　重组人TRA IL 蛋白表达质粒p ET3a/TRA IL 由我室构建;大肠杆菌BL21为本室保存;离子交换层析凝胶SP sepharose 购自珐玛西亚公司,Ni 2N TA superflow 购自Q IA GEN 公司.

细胞株:MDA 2MB 2231人乳腺癌细胞来源于美国A TCC (American Type Culture Collection ).

1.1.2　试剂　兔抗人TRA IL 蛋白的抗体购自晶美公司、HRP 标记的羊抗兔Ig G 及PVDF 膜等为Bio 2Rad 公司产品;TRA IL 标准品购自SAN T CRU Z 公司;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和SDS 购自CA IB IOCHEM ,ECL TM K it (增强化学发光试剂盒)购自Amersham Pharmacia Biotech 公司;其余试剂为市售分析纯.

1.2　方法

1.2.1　重组质粒p ET3a/TRA IL 的诱导表达　将冻存的含有人TRA IL 蛋白表达质粒p ET3a/TRA IL 的大肠杆菌BL21铺皿,挑取单菌接种于含氨苄青霉素(Amp ,100×10-6g/mL )的5mL LB 液体培养基中,37℃下振摇培养过夜.转入50mL LB 中培养至OD 600nm 为0.8左右时,再转接入2500mL LB 中,培养2h 后,加入终浓度为50mmol/L 的IPTG 诱导培养4h ,离心收集菌体后,取少量菌体用于检测TRA IL 蛋白的诱导表达水

平,在菌体中加入SDS 2PA GE 上样缓冲液(含4%SDS ,10%

β巯基乙醇,1mmol/L ED TA 和20mmol/L Tris ,p H8.0),混匀后沸水浴10min ,离心后取上清液进行SDS 2PA GE ,同时设未诱导的带质粒菌为对照.

收稿日期:2002203213

3通讯作者,Tel :(028)2900418,E 2mail :gxplww @https://www.360docs.net/doc/e813707224.html,

2002年4月

第39卷增刊四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University (Natural Science Edition )Apr.2002Vol.39Issue

1.2.2　包涵体制备　在上述菌体沉淀中,加入裂菌缓冲液(50mmol/L Tris ,0.15mol/L NaCl 和2mmol/L ED TA ,p H8.0)重悬,溶菌酶处理后12000g 离心10min ,用含1mol/L 尿素和20mmol/L PB (p H7.6)的缓冲液洗涤沉淀3次,即为精制TRA IL 包涵体.

1.2.3　重组人TRA IL 蛋白的抽提、复性及柱层析纯化　在包涵体中加入7mol/L 盐酸胍溶液(20mmol/L PB ,p H7;6,7mol/L 盐酸胍,1mmol/L ED TA )反复研磨至溶.然后将其缓慢滴加到复性液中(2mol/L 尿素,50mmol/L Tris ,100mmol/L NaCl ,20mmol/L β2巯基乙醇,1mmol/L MgCl 2,0.2‰Tween 280),室温下复性24h.经微孔滤膜过滤后,即为TRA IL 蛋白复性样.复性样用水稀释一倍后直接上Ni 2N TA Superflow 柱,用含0～1mol/L 咪唑的20mmol/L PB (p H7.6)梯度洗脱后,活性组分直接上SP 2SepharoseF.F.柱层析,纯化后得到纯品,用SDS 2PA GE 检测各步层析活性组分.

1.2.4　重组人TRA IL 蛋白纯品的鉴定　采用Lowry 法测定TRA IL 蛋白纯品的蛋白含量,SDS 2PA GE 法分析其纯度,用Western blot 法分析其免疫原性,各实验均按常规进行.Western blot 一抗为兔抗人TRA IL 蛋白多克隆抗体(效价为1∶500),二抗为HRP 标记的羊抗兔Ig G (效价为1∶3000),检测用ECL TM K it (增强化学发光试剂盒).

1.2.5　重组人TRA IL 蛋白的抗肿瘤活性测定　通过重组人TRA IL 蛋白,对体外不同肿瘤细胞的生长抑制作用,对TRA IL 蛋白的抗肿瘤生物活性进行检测.MDA 2MB 2231细胞系,按常规于37℃下的5%CO 2培养箱中培养.取对数生长期细胞,按2×104个/孔接种于96孔培养板上.24h 后加入TRA IL 蛋白及标准品,浓度从250ng/mL 连续倍比稀释至15.6ng/mL ,培养48h 后,参照文[6]用SRB 法测定细胞生长率.2　结果

2.1　重组人TRA IL 蛋白的表达及纯化

由SDS 2PA GE 分析(图1)可知,重组质粒p ET3a/TRA IL 可在大肠杆菌中达到高效表达,薄层扫描分析显示表达量达菌体总蛋白的21.15%.包涵体经盐酸胍抽提后用Ni 2N TA Superflow 柱纯化,目的蛋白不能结合到柱上,而复性后则能特异地与Ni 结合

.一步纯化即可达90%以上的纯度.再经Sp 2SepharoseF.F.柱层析,即可得到纯度达98%以上的纯品(见图2).

图1　SDS 2PA GE 分析重组质粒p ET3a/TRAIL

在大肠杆菌中表达的TRAIL 蛋白:道1.蛋白质分子量

标准;道2.未诱导对照;道3.诱导4h 图2　SDS 2PA GE 分析柱层析纯化TRAIL 蛋白活性组分道1.蛋白质分子量标准;道2.Ni 2N TA 柱纯化TRAIL 蛋白活性组分;道3.SP 2Sepharose F.F.柱纯化TRAIL 蛋白活性组分

2.2　重组人TRA IL 蛋白免疫原性鉴定

Western blot 分析结果表明,纯化的重组TRA IL 蛋白能与抗人TRA IL 抗体发生特异性免疫反应(图3).

2.3　抗肿瘤生物活性分析

纯化的重组人TRA IL 蛋白对肿瘤细胞有显著的抑制作用(见图4),与标准品作用效果相当,作用于MDA 2MB 2231的GI50均在46ng 左右.

41增刊周建等:重组人TRA IL 蛋白的原核表达、纯化及鉴定

441四川大学学报(自然科学版) 第39卷

图3　Western blot法分析TRAIL蛋白免疫原性

　图4　TRAIL蛋白与标准品对MDA2MB2231细胞的抑制作用道1.TRAIL标准品;道2.TRAIL蛋白样品

3　讨论

在TRA IL的纯化中,我们通过大量的摸索,采用Ni2N TA agrose亲和层析使纯化步骤得以简化.我们所使用的质粒载体p ET23a是不带有His2tag的载体,但由于TRA IL有分子内组氨酸,我们就尝试着用Ni2 N TA agrose亲和层析.最初使用的是变性条件下结合,结果TRA IL不能与柱子结合,后来经过多次摸索,发现复性后的TRA IL可以与Ni2N TA agrose柱结合,估计是复性以后TRA IL蛋白的分子内组氨酸在空间位置上靠近,形成类似于His2tag的结构.通过Ni2N TA agrose亲和层析,得到的TRA IL蛋白可达到90%以上的纯度,再经一步阳离子交换层析,即可得到纯度大于98%的纯品.此法最方便的是,在复性以后不用透滤交换缓冲体系,也不用浓缩,由微孔滤膜过滤后就可以直接上柱.另外,我们在做离子交换时,选用的缓冲体系和Ni2N TA亲和层析的缓冲体系完全一致,故亲和层析用咪唑洗脱的目的组分,无需透析或超滤即可直接上离子交换柱.这样在整个纯化过程中,由于省略了超滤和透析,可大大减少蛋白损失,提高收率,降低成本,这将有利于TRA IL蛋白未来的大量生产.

另外,我们还对纯化后的TRA IL蛋白进行了免疫原性和活性鉴定.结果表明,所得到的TRA IL蛋白能与抗人TRA IL蛋白的抗体发生特异免疫反应,且抗肿瘤活性良好,与标准品相当.

综上所述,我们通过实验成功地进行了TRA IL蛋白的表达和纯化,得到了大量具有活性的纯TRA IL 蛋白,为TRA IL蛋白更深入的基础研究及临床应用研究奠定了基础.

参考文献:

[1]　Wiley S R,et al.Identification and characterization of a new member of the TNF famil y that induces apoptosis[J].Immuni2

ty,1995,3:673-682.

[2]　Avi Ashkenazi,et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2ligand[J].The Journal of Clinical Investiga2

tion,1999,104(2):155-162.

[3]　Picti R M,et al.Induction of apoptosis by Apo2ligand,a new member of the tumor necrosis factor rece ptor family[J].J.Bi2

ol.Chem,1996,271:12687-12690.

[4]　Marsters S,et al.Activation of apoptosis by Apo2ligand is independent of FADD but blocked by CrmA[J].Curr.Biol,1996,

6:750-752.

[5]　Walczak H,et al.Tumoricidal activity of tumor necrosis factor related a poptosis2inducing ligand in vivo[J].Nat.Med,1999,

5:157-163.

[6]　韩锐.抗癌药物研究与实验技术[M].北京:北京医科大学?中国协和医科大学联合出版社,1997.287-286.

Expression and purif ication and biological activicty

assay of recombinat human TRAIL protein

ZHOU Jian ,PEN G X u 2dong ,ZHA N G Jian ,GA O Xiao 2pi ng

(Institute of materia medica ,Chengdu Diao Pharmaceutical Grou p ,Chengdu 610041,China )

Abstract :E.coli BL21baring a expression plasmid of human TRA IL protein was induced for expression with IPTG.The protein expressed in a form of inclusion bodies and was purified through cell disruption ,inclusion bodies extraction ,solubilization renaturation ,and a combination of Ni 2N TA Superflow affinity and ion 2exchange chromatography.The result of SDS 2PA GE and Western blot demonstrated that the purified protein was a single band with molecular weight of 19kD and reacted specially with anti 2human TRIAL Ig G.Cytotoxic activity assay showed that the purified TRA IL protein had good antitumor activity in vitro.

K ey w ords :TRA IL ;purification ;Ni 2N TA Superflow 5

41增刊周建等:重组人TRA IL 蛋白的原核表达、纯化及鉴定

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？

4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。此方法能快速得到蛋白。（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。

重组蛋白和多肽的分离纯化

重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋

表达蛋白的分离与纯化

表达蛋白的分离与纯化大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）（一）试剂准备采用T7· Tag Affinity Purification Kit 1．T7·Tag抗体琼脂。 2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3.

0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。 4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。 5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。 1.PEG 20000。（二）操作步骤 1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。 2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。 3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。 4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。 5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。 6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。 7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。 8.用PEG 20000浓缩蛋白。（三）注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。二、包涵体的纯化

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

蛋白体外表达与纯化

蛋白体外表达与纯化随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。一：原核表达系统原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。三：哺乳动物细胞表达系统由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。表达载体的种类及相应的分离纯化方法作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。实验方法与步骤：一：目的蛋白的粗提 1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期

浅谈原核表达

浅谈原核表达的技巧摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。关键词：原核表达表达载体限制性内切酶将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。一、原核表达一般程序表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。（1）对表达载体的分析载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。（2）对目的片段的分析基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

高中组 11年级生物化学 3人项目重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化摘要：干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化；一、研究背景干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。二、操作步骤（一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。关键词：蛋白质分离纯化前言：蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

蛋白的纯化

第二部分：蛋白的纯化如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体；建议：还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。

大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤

大规模可溶性蛋白纯化实验操作 Hao Lab in SII 1. 取20 μL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 μg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 μg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。 2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。 3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。 4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。以下步骤均置于冰上。 5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。 6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。 7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。 15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。 8. 在步骤7离心的同时。取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。 9. 取下层析柱的帽子使NI-NTA beads重悬液体流净再盖上帽子，加入PBS至总体积约20 ml，用5 ml 移液器轻柔吹打混匀(避免气泡产生)，静置5 min之后取下层析柱的帽子将液体放空并盖上帽子，重复二次。 10. 取步骤7，离心后的上清用0.45 μm滤器(Millipore, #SLGP033RS) 过滤，滤液置于50 ml离心管中。 11. 取适量蛋白溶液将NI-NTA beads重悬并转移到装有蛋白溶液的50 ml离心管中。4°C摇荡过夜。空的层析柱加入约10 ml PBS，4°C保存。 12. 将摇荡过夜的beads和蛋白混合液以50 × g, 4°C离心1 min使beads沉淀。保留上清于4°C冰箱，可以考虑用旧的beads做二次结合。 13. 用10 ml PBS重悬beads, 50 × g, 4°C离心1 min, 弃上清，重复一次。再以20 ml wash buffer 重悬，装入层析柱中，静置5 min, 取下层析柱的帽子，收集0.5 ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-1，剩余液体流空再盖上帽子。 14. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。 15. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子收集0.5ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-3，剩余液体液体流空，盖上帽子。 16. 加入5 ml Elution buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，收集液体，于15 ml新离心管中并留样品20 μl, 标记为E-1。为盖上帽子。用Nanodrop2000粗测蛋白浓度。再以3 ml Elution buffer 重复三次上述步骤，收集至另一新15 ml离心管中。 17. 回收beads: 洗脱后的NI-NTA beads以20 ml PBS重悬，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。再以20 ml PBS重复两次上述步骤。再用20 ml 0.5 M NaOH重复一次，加入约10 ml 30%乙醇置于4°C保存。 19. 将16步得到的蛋白溶液加入3 KDa的15 ml超滤管(Millpore, #UFC900396)中, 4,000 × g, 4°C离心45 min进行超滤。倒掉超滤管底的废液，将约为15 ml PBS加入超滤管中，轻轻颠倒混匀，4,000 ×g, 4°C离心45 min，倒掉超滤管底的废液。重复超滤四次，最后一次离心1 h。如果16步第一次收集的蛋白溶液粗测浓度大于0.5 mg/ml，可以先超滤第一次洗脱得到的5ml蛋白溶液，其它的再用同一个超滤管进行第二次超滤。纯化后的蛋白溶液留样20 μl标为EC，加入终浓度为40%的甘油，每管100 μl分装，-80°C保存。 SDS-PAGE检测各样品的蛋白浓度及纯度。

原核表达步骤

原核表达及纯化总结教学提纲

原核表达及纯化总结

His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10μL连接体系，此步转化方法如下：取100μL DH5α感受态细胞，加入到10μL连接产物体系中 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激90秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入300μL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h ↓ 将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。 2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。 PCR扩增体系如下：取1 μL菌液作为模板反应体系如下：模板 1 μL 10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 μL

dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 μL 上游引物（10 μmol/L） 1 μL 下游引物（10 μmol/L） 1 μL Taq酶（5 U/μL）0.3 μL ddH2O 13.1μL Total 20 μL 条件： 94℃预变性 10min 94℃变性 45s 50℃退火 45s 72℃延伸 1min，30个循环的扩增反应 72℃延伸 10 min 4℃∞ 1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样3μL 样品（1μL loadingbuffer +6μL PCR产物混匀上样） 100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。（注意：记得保存菌种） 3 阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200μL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min 培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。质粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL离心管中 ↓ 12000rpm离心30s，弃上清 ↓

基因重组蛋白纯化流程

01.11 周总结一、本周工作 01．05 20T—TB23 蛋白处理 1、分析昨天20T—TB23 蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清； 2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M 尿素溶解上清中目的蛋白较少， 6M 、8M 溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M 尿素去杂蛋白，用6M 尿素洗目的蛋白；3、用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2mi n,12000rpm 离心15mi n,再重复一遍；4、用30ml 2M 尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl) 将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，进行电泳； 20T—I 56II12 菌体回收 1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min ； 2、去上清用20ml裂解液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心 25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.06 20T—TB23 蛋白回收： 1.将跑20T—TB23 蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条宽1cm 左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS 缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白溶液，稀释12 倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD 值为0.165,260nmOD 值为 0.098，C=(0.165*1.45—0.098*0.74) *12=2.0； 20T—I 56II12 蛋白处理： 1 用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl)将沉淀吹起，超声 2min,12000rpm 离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24 倍测蛋白浓度，280nmOD 值为1.041,260nmOD 值为 0.579，C=(1.041*1.45—0.579*0.74) *24=25.9；往上清中加2.6ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升于1.5ml 离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，共加4 板，进行电泳 01.07 协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12 蛋白 1准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上 (不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好)；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一