ICSI受精失败的原因与对策

NJA中华男科学杂志

National Journal of Andrology

Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi

2011，17（12）：1131－1134 http：//www．androl．cn

Mini Review ·综述·

ICSI受精失败的原因与对策

程丹1，2综述；李洁2，郭翠翠1，熊承良1审校

（1．华中科技大学同济医学院计划生育研究所，湖北武汉430030；

2．武汉大学人民医院生殖医学中心，湖北武汉430060）

【摘要】卵细胞胞质内单精子注射（ICSI）是一种新型的体外受精技术，有很高的单精受精率，但ICSI技术不能解决所有的受精失败，可能的原因包括卵母细胞质量、受精激活障碍、精子异常以及ICSI技术等问题。IVF超促排卵可能引起卵母细胞内凋亡增加，从而导致受精失败。卵母细胞激活障碍有多种人工辅助的激活方法。ICSI时精子引起的受精失败多是由于精子微小畸形，形态学选择性ICSI是常用的方法。但ICSI后的完全受精失败仍是助孕治疗面临的棘手问题，不能完全避免。

【关键词】ICSI；受精失败；卵母细胞激活；精子

中图分类号：R271．14文献标志码：A文章编号：1009-3591（2011）12-1131-04

Failed fertilization after ICSI：Causes and countermeasures

CHENG Dan1，2，LI Jie1，2，GUO Cui-cui1，XIONG Cheng-liang1

1．Family Planning Research Institute，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan，Hubei430030，China；2．Center of Reproductive Medicine，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan，Hubei430060，China

【Abstract】As a new technique for IVF，ICSI has a high rate of monospermy but cannot prevent all fertilization failures，of which the possible causes are poor oocytes or sperm，abnormal oocyte activation，and ICSI technical problems．Controlled ovarian hyperstimu-lation during IVF could increase the apoptosis of oocytes and subsequently induce fertilization failure．There are several methods for ar-tificial activation in case of oocyte activation failure．Sperm-induced fertilization failure is mostly due to minute malformation of sperm，for which morphologically selective ICSI is generally employed．However，totally failed fertilization after ICSI remains a real challenge．Natl J Androl，2011，17（12）：1131－1134

【Key words】ICSI；fertilization；failure；oocyte activation；sperm

Correspondence to：XIIONG Cheng-liang，email：clxiongcn@yahoo．com．cn

Received：February11，2011；accepted：September2，2011

ICSI与传统IVF在受精过程中的作用不同，它避开了精卵结合受精过程的三大屏障：顶体反应（精子穿过卵放射冠）、精子穿过卵透明带、精子穿过卵细胞质膜，显著提高受精率。ICSI对精子几乎没有限制，活精子、死精子、射出的不运动的精子、附睾精子和睾丸精子都可用于ICSI，而且具有单精受精率高及不受精子浓度、形态、活力的影响等优点。

ICSI使辅助生殖技术中的受精率大大提高，但ICSI技术不能解决所有的受精失败，辅助生殖实验室仍然存在难以预测和不明原因的ICSI后全部受

·

1311

·

*作者简介：程丹（1979-），女，湖北武汉市人，博士研究生，从事生殖医学研究。Email：chengdanny@126．com 通讯作者：熊承良，Email：clxiongcn@yahoo．com．cn

精失败（total fertilization failures，TFF）与受精率低的情况，Esfandiari等［1］报道ICSI后TFF发生率为1．3% 3．0%。一旦出现TFF就意味着不孕治疗过程的全部终止，给不孕患者带来很大经济损失与精神打击，也使不孕症的治疗变得非常棘手。现将ICSI后受精失败可能的原因与相关研究综述如下。

1卵母细胞质量

IVF/ICSI助孕治疗时卵母细胞质量仍是影响受精最关键的因素。卵母细胞成熟度与其受精能力关系密切。ICSI是在去除卵冠丘颗粒细胞后进行的，可准确选择已排出第一极体的成熟卵母细胞（M Ⅱ期卵）进行显微受精操作，但是第一极体排出仅是卵母细胞核成熟的标志，而卵子的成熟包括胞核及胞质的成熟。卵母细胞胞质充分成熟有2个重要标志：①皮质颗粒向质膜下迁移并沿质膜呈线性排列；②成群线粒体散开。胞质与胞核都成熟的卵母细胞才具有受精能力。Dubey等［2］的研究发现卵子胞质不成熟可能导致精子头部去浓缩失败，从而引起ICSI后受精失败。Bosco等［3］的研究认为助孕治疗时促排卵与体外培养过程可能引起卵母细胞内调亡增加，DNA片段化，导致卵母细胞受精障碍。

选择MⅡ期卵进行ICSI也可能出现完全受精失败。Gasca等［4］即报道1例患者经3次促排卵，获MⅡ卵39个行ICSI均全部受精失败，经比较基因组研究对比TFF的MⅡ卵与正常受精的卵母细胞，发现TFF的MⅡ卵中参与减数分裂、细胞生长和调亡控制的基因存在明显异常，这项研究说明单从形态判断选择MⅡ卵行ICSI不能避免TFF，由于卵母细胞本身某些缺陷仍可能引起完全受精失败。对于此类患者一旦确诊只能通过赠卵来获得妊娠。

2受精激活障碍

受精失败的卵细胞内通常可见有精子存在，说明ICSI后受精障碍最主要的原因并不是精子入卵，而是精子不能够激活卵子，激活受精。受精激活主要包括：①卵母细胞的激活，可由精子完成，也可由物理化学刺激完成；②精子激活，精子进入成熟卵母细胞后，在细胞质中某些因子的作用下，才能完成核去致密和组蛋白替代鱼精蛋白的过程。

2．1卵母细胞的激活障碍卵母细胞的激活是以启动并完成第2次减数分裂、第二极体排出、皮质反应、雌原核的形成和卵子代谢启动为标志。由于ICSI越过了自然受精时精子需要经过的几道屏障，如顶体反应、精子与透明带结合、精卵质膜融合等，所以往往不能使卵母细胞完全激活。因此，ICSI时

必须通过显微注射针的机械刺激及注入精子的生物刺激来激活卵母细胞。在保证卵膜穿破的同时，注射精子前尽量轻柔的重复多次抽吸胞质，充分引发Ca2+释放以及Ca2+附加峰，达到激活卵母细胞的目的。也可通过多种人工处理，如电脉冲激活、与钙离子载体A23187或离子霉素共孵育等方法，辅助卵子激活等。

钙离子载体辅助卵子激活是目前辅助生殖实验室中ICSI受精失败最常用的处理措施［5-6］。Sug-aya［7］报道将人卵母细胞在5μmol/L的Ca2+载体A23187中处理5min激活，然后再行ICSI，获得成功妊娠。

Baltaci等［8］报道对于TFF病例通过电压激活后在进行标准ICSI可能部分解决由于卵子激活障碍导致的TFF，改善这类患者IVF治疗结局，Man-sour等［9］的研究也进一步证实电刺激对卵子激活障碍的可行性。Chen等［10］对反复TFF患者通过将SrCl

2

（10mmol/L，60min）与卵子共培养30min激活卵子后再ICSI，成功受精并获得优质胚胎移植获

得成功妊娠，而且动物实验发现SrCl

2

对卵的辅助激活作用优于钙离子载体。也有报道提出应用嘌呤霉素激活卵子再行ICSI，能够改善卵子激活障碍，提高受精率。

在生理性受精过程中，细胞内Ca2+瞬间升高都发生在精卵融合后，随后3 4h出现钙震荡。细胞内Ca2+瞬间升高对卵母细胞的激活是必要的，尽管这种钙震荡的功能尚未完全明了，但这种钙震荡不仅与受精有关，还与细胞分裂与胚胎发育有关，充分有效的钙震荡可以明显增加囊胚内细胞团的数目。钙离子载体治疗与电脉冲激活都是通过引起细胞内Ca2+瞬间升高，激活卵母细胞，激发受精。很多病例报道了不同激活卵母细胞，提高ICSI受精率的方法，并都有获得成功妊娠与分娩的例子，但其有效性与长期安全性尚需进一步评价。

2．2精子激活障碍精子激活是指精子在进入成熟卵母细胞后，在细胞质中某些因子的作用下，精子头部的鱼精蛋白与组蛋白比例迅速变化，组蛋白替代鱼精蛋白，精子核出现去浓缩，激活卵细胞，完成受精过程。精子激活以精核去致密、雄原核形成和发生DNA合成等为标志。精子头部去浓缩失败与鱼精蛋白缺陷均可导致精子激活障碍，从而引起受精失败。

Nasr-Esfahani等［11-12］研究发现，精子鱼精蛋白缺陷可能是ICSI后受精失败的原因之一，精子鱼精

蛋白缺陷可能导致人类精子染色质异常，从而导致受精失败。Razavi等［13］研究发现，ICSI后受精失败病例精子中存在鱼精蛋白缺陷的比例明显较受精正常病例高；为排除卵母细胞质量对受精的影响，Nasr-Esfahani等［14-16］用小鼠卵与存在鱼精蛋白缺陷的人类精子行ICSI，进一步证实了鱼精蛋白缺陷也可能是影响受精的独立因素之一。鱼精蛋白缺陷可通过在精子形成晚期导致顶体和核周膜形成缺陷，影响膜重排和其它对正常精子功能与精子入卵后激活卵子必须的精子形态变化和生物化学变态的过程，直接影响受精过程，降低受精率。

一般认为精子去浓缩失败与卵子激活障碍同时出现。也有研究认为精子去浓缩失败与卵子激活障碍均可独立发生。Nasr-Esfahani等［14］发现精子鱼精蛋白缺陷可能引起精子成熟前核浓缩，从而导致ICSI后受精失败，这可能是ICSI后受精失败的独立原因之一，但是精子鱼精蛋白缺陷与原核大小的不一致之间没有相关性。Nasr-Esfahani等［17］的研究也说明对鱼精蛋白缺陷检测对于ICSI后受精失败的预测价值远高于顶体活性和精液参数的检查，说明鱼精蛋白缺陷对于精子受精有直接的影响。

3精子异常

Ito等［18］研究发现精子能否激活卵子与精子头部的平整度以及是否存在核周隙物质等有关，圆头精子和缺乏顶体后鞘和核周鞘的畸形精子就可能因为不能激活卵子导致受精失败。Egashira等［19］报道对于圆形精子症患者通过电刺激激活卵母细胞后再行ICSI获得成功妊娠的报道。

在大多数哺乳动物受精过程中，精子入卵后由中心粒形成一个单极排列的微管状结构也称为精星体。精星体对配子基因组的融合与原核的形成至关重要，因此，中心粒异常导致的精星体形成障碍可导致受精失败。目前IVF实验室ICSI时一般选择形态相对正常的精子，但仍然不能完全避免选择的ICSI精子存在微小畸形，尤其是精子的中心粒（主段纤维鞘）畸形。有研究发现人类精子中存在中心粒或中心粒周围结构缺陷时，精子蛋白酶体的酶活性受损，影响受精时精子尾部的解离，从而导致受精失败或早期合子发育障碍［20-21］。

精子纤维鞘畸形引起的ICSI受精失败的处理方法包括ICSI时精子中心粒移植与形态学选择性单精子卵胞质内注射（intracytoplasmic morphologi-cally selected sperm injection，IMSI）。精子中心粒移植尚处于研究阶段，目前较常用的方法还是IMSI。ICSI选择精子时不仅注意选择头部正常的精子，还应注意尽量选择颈部中段正常形态的精子，避免ICSI后由于精子纤维鞘畸形导致的精星体形成障碍。

在哺乳动物中，精卵相遇后精子释放出激活信号，引起细胞内外Ca2+浓度的迅速变化，激起Ca2+振荡，激发受精。Yoon等［22］发现反复ICSI失败男性精子中存在部分可引起Ca2+振荡的精子蛋白磷脂肌醇特异性磷脂酶C-Z1［phospholipase C zeta1，PLCZ1］缺乏，说明精子中PLCZ1缺乏可能是反复ICSI受精失败的原因。Taylor等［23］报道通过对存在PLCζ缺乏的完全性球形精子症的患者通过应用钙离子载体辅助卵子激活后再行ICSI获得成功妊娠。

4ICSI技术问题

4．1微注射针不同参数的选择对ICSI胚体外发育的影响ICSI时微注射针尖的内径及斜面的角度，对显微注射时卵细胞损伤程度的大小起着至关重要的作用。注射时损伤卵细胞可能引起受精失败或受精卵发育停滞。

4．2注射时极体位置对ICSI胚体外发育的影响

因为MⅡ期的纺锤体位于卵胞质外周，与第一极体紧邻，为了避免损伤卵母细胞纺锤体，影响受精和胚胎进一步发育，所以第一极体与精子注入的相对位置在ICSI过程中是一项重要的技术参数。Blake 等［24］认为在进行ICSI时，应尽可能使第一极体远离固定针、注射针和精子，将极体置于11点和与之对称的7点，使纺锤体离精子最远，可最大限度地减少卵细胞内部组织结构被破坏。但Anil等通过将ICSI后受精失败的卵进行核固定后分析发现，ICSI 后受精失败的主要原因是精卵间染色质融合的过程不能顺利完成，而与ICSI时注射的部位间关系不大。

4．3卵母细胞膜穿破方式对ICSI胚体外发育的影响ICSI的关键是能够成功地穿破卵膜，将被制动的单个精子置于卵母细胞胞质内。卵膜的穿破形式取决于操作技术环节和卵母细胞自身的特性，如卵膜的弹性以及卵母细胞本身的质量都会影响卵膜的穿破形式。卵母细胞膜穿破方式的差异也可能是由膜本身脂蛋白结构上的糖基支链等的不同所决定的。

4．4聚乙烯吡咯烷酮（PVP）对ICSI胚体外发育的影响PVP是N2乙烯基吡咯烷酮（NVP）经自由基聚合而成的一种十分重要的水溶性高分子聚合物，

具有良好的溶解性、化学稳定性、成膜性、生理惰性和粘接能力。PVP作为精子操作液中的一种成分，一方面使液体变得粘稠，减缓精子运动速度，易于将精子吸入和排出，方便ICSI操作；另一方面可以防止膜损伤后的精子粘在管壁上。但是由于PVP本身具有化学物质的一些活性，当随着精子一起注入卵母细胞质后可能会对胚胎发育造成影响，因此要选择合适的PVP浓度。

4．5ICSI制动的影响ICSI过程中没有细胞膜的融合，故精子制动很必要，其能破坏精子细胞膜，使精子细胞膜肿胀，卵细胞中的精核去浓缩因子进入精细胞，激活卵细胞。在制动过程中，精子质膜受到损伤，能够提高受精率，这是由于质膜完整的活动精子注入卵子后，精子在胞质内运动一段时间，会对卵子的细胞器和细胞骨架造成损伤。

对于各种原因引起的初次出现的ICSI后全部受精失败，因为可能由于卵子质量与ICSI过程中的问题，再次促排卵后ICSI仍然是必要的治疗方法，Javed等［25］报道约有70% 80%的病例在随后的ICSI周期没有出现全部受精失败；对于重复出现的ICSI后全部受精失败，仍有可能存在目前医学条件不能解决的受精障碍。

参考文献

［1］Esfandiari N，Javed MH，Gotlieb L，et al．Complete failed ferti-lization after intracytoplasmic sperm injection—analysis of10

years＇data．Int J Fertil Womens Med，2005，50（4）：187-192．［2］Dubey AK，Penzias AS，Reindollar RH，et al．Technical and physiological aspects associated with the lower fertilization follow-

ing intra cytoplasmic sperm injection（ICSI）in human．

Theriogenology，1998，49（1）：33-41．

［3］Bosco L，Ruvolo G，Morici G，et al．Apoptosis in human unfer-tilized oocytes after intracytoplasmic sperm injection．Fertil

Steril，2005，84（5）：1417-1423．

［4］Gasca S，Reyftmann L，Pellestor F，et al．Total fertilization fail-ure and molecular abnormalities in metaphase II oocytes．Reprod

Biomed Online，2008，17（6）：772-781．

［5］Terada Y，Hasegawa H，Takahashi A，et al．Successful pregnan-cy after oocyte activation by a calcium ionophore for a patient with

recurrent intracytoplasmic sperm injection failure，with an assess-

ment of oocyte activation and sperm centrosomal function using

bovine eggs．Fertil Steril，2009，91（3）：935．e11-14．

［6］Check JH，Summers-Chase D，Cohen R，et al．Artificial oocyte activation with calcium ionophore allowed fertilization and preg-

nancy in a couple with long-term unexplained infertility where the

female partner had diminished EGG reserve and failure to fertilize

oocytes despite intracytoplasmic sperm injection．Clin Exp Obstet

Gynecol，2010，37（4）：263-265．

［7］Sugaya S．Pregnancy following calcium ionophore oocyte activa-tion in an oligozoospermia patient with repeated failure of fertiliza-

tion after ICSI．Clin Exp Obstet Gynecol，2010，37（4）：261-

262．

［8］Baltaci V，Ayvaz OU，Unsal E，et al．The effectiveness of intra-

cytoplasmic sperm injection combined with piezoelectric stimula-

tion in infertile couples with total fertilization failure．Fertil

Steril，2010，94（3）：900-904．

［9］Mansour R，Fahmy I，Tawab NA，et al．Electrical activation of oocytes after intracytoplasmic sperm injection：A controlled ran-

domized study．Fertil Steril，2009，91（1）：133-139．

［10］Chen J，Qian Y，Tan Y．Successful pregnancy following oocyte activation by strontium in normozoospermic patients of unex-

plained infertility with fertilisation failures during previous intra-

cytoplasmic sperm injection treatment．Reprod Fertil Dev，2010，

22（5）：852-855．

［11］Nasr-Esfahani MH，Razavi S，Mozdarani H，et al．Relationship between protamine deficiency with fertilization rate and incidence

of sperm premature chromosomal condensation post-ICSI．Andro-

logia，2004，36（3）：95-100．

［12］Nasr-Esfahani MH，Naghshizadian N，Imani H，et al．Can sperm protamine deficiency induce sperm premature chromosomal con-

densation？Andrologia，2006，38（3）：92-98．

［13］Razavi S，Nasr-Esfahani MH，Mardani M，et al．Effect of human sperm chromatin anomalies on fertilization outcome post-ICSI．

Andrologia，2003，35（4）：238-243．

［14］Nasr-Esfahani MH，Razavi S，Mardani M，et al．Effects of failed oocyte activation and sperm protamine deficiency on fertilization

post-ICSI．Reprod Biomed Online，2007，14（4）：422-429．［15］Nasr-Esfahani MH，Salehi M，Razavi S，et al．Effect of sperm DNA damage and sperm protamine deficiency on fertilization and

embryo development post-ICSI．Reprod Biomed Online，2005，

11（2）：198-205．

［16］Nasr-Esfahani MH，Salehi M，Razavi S，et al．Effect of prota-mine-2deficiency on ICSI outcome．Reprod Biomed Online，

2004，9（6）：652-658．

［17］Nasr-Esfahani MH，Razavi S，Tavalaee M．Failed fertilization af-ter ICSI and spermiogenic defects．Fertil Steril，2008，89（4）：

892-898．

［18］Ito C，Akutsu H，Yao R，et al．Oocyte activation ability corre-lates with head flatness and presence of perinuclear theca sub-

stance in human and mouse sperm．Hum Reprod，2009，24

（10）：2588-2595．

［19］Egashira A，Murakami M，Haigo K，et al．A successful pregnan-cy and live birth after intracytoplasmic sperm injection with globo-

zoospermic sperm and electrical oocyte activation．Fertil Steril，

2009，92（6）：2037．e5-9．

［20］Rawe VY，Díaz ES，Abdelmassin R，et al．The role of sperm proteasomes during sperm aster formation and early zygote

development：Implications for fertilization failure in humans．

Hum Reprod，2008，23（3）：573-580．

［21］Terada Y，Schatten G，Hasegawa H，et al．Essential roles of the sperm centrosome in human fertilization：Developing the therapy

for fertilization failure due to sperm centrosomal dysfunction．To-

hoku J Exp Med，2010，220（4）：247-258．

［22］Yoon SY，Teru J，Ana MS，et al．Human sperm devoid of PLC，zeta1fail to induce Ca2+release and are unable to initiate the

first step of embryo development J Clin Invest，2008，118（11）：

3671-3681．

［23］Taylor SL，Yoon SY，Morshedi MS，et al．Complete globozoosper-mia associated with PLCζdeficiency treated with calcium iono-

phore and ICSI results in pregnancy．Reprod Biomed Online，

2010，20（4）：559-564．

［24］Blake M，Garrisi J，Tomkin G，et al．Sperm deposition site dur-ing ICSI affects fertilization and development．Fertil Steril，

2000，73（1）：31-37．

［25］Javed M，Esfandiari N，Casper RF．Failed fertilization after clinical intracytoplasmic sperm injection．Reprod Biomed Online，2010，

20（1）：56-67．

（收稿日期：2011-02-21；接受日期：2011-09-02）

（本文编辑：徐建平）