新型抗植物病毒剂及其作用机理研究新进展

新型抗植物病毒剂及其作用机理研究新进展
新型抗植物病毒剂及其作用机理研究新进展

新型抗植物病毒活性化合物的合成及其作用机理研究

新进展

范会涛,杨松*,陈卓,宋宝安,胡德禹,薛伟,李向阳

生物质资源综合利用国家地方联合工程实验室、贵州大学教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室、贵州大学精细化工研究开发中心贵阳(550025)

E-mail: yangsdqj@https://www.360docs.net/doc/e818800268.html,

摘要:植物病毒对农业生产危害较大,抗植物病毒剂的研究是近年来新农药研发的热点之一。本文就近年来化学合成的含硫脲、吡唑、氰基丙烯酸酯、α-氨基膦酸酯等结构的植物病毒抑制剂的合成路线、生物活性、以及作用机制等进行综述。

关键词:抗植物病毒剂;合成;作用机理

植物病毒是造成多种农作物减产和品质下降的重要病原之一,它是一种寄生在植物细胞甚至是细胞核内的专性寄生物,在寄主细胞内进行核酸(RNA或DNA)的复制和外壳蛋白的合成,组成新的病毒粒子。植物病毒在植物细胞中绝对寄生,其复制所需要的物质、能量、场所完全由寄主细胞提供,这使得植物病毒病的防治极其困难。植物病毒病是农业生产上的一大病害,严重阻碍了农业生产的发展,全世界每年因植物病毒病造成的损失达数百亿之多[1]。为了防治植物病毒病,人们进行了多方面的研究,当前防治植物病毒的方法主要是生物防治和化学防治,化学防治因其操作简单,作用直接,以及经济实用等优点,在整个植物病毒病防治中占有重要的地位,因此开发高效、环境友好型的化学合成植物病毒抑制剂已经成为当前研究的热点。

近年来化学合成抗植物病毒剂从结构上来分包括以下几类,即杂环类、核苷酸、生物碱、取代苯、醛类及其缩合物、有机磷、氨基酸衍生物等。目前,化学合成植物病毒抑制剂的研究有了较大的进展,已合成并筛选出一些新的具有抗植物病毒活性的化合物,具有代表性的有含硫脲、吡唑、氰基丙烯酸酯、α-氨基膦酸酯等结构的植物病毒抑制剂。本文就近年来具有代表性的新型植物病毒抑制剂的合成路线、结构特征、生物活性及其作用机制进行综述。

1. 硫脲类植物病毒抑制剂

硫脲类化合物在农药和医药上具有广泛的生物活性,如抗过敏、消炎、抗菌、杀虫和除草等活性。近十年来,国外的一些药物公司相继成功地开发了几个硫脲类的杀菌剂、杀虫剂、植物生长调节剂和杀鼠剂等新品种,如作为杀菌剂的代菌灵(thiophamine)、杀虫剂的螟蛉畏(chloromethiuron)、杀螨剂的杀螨隆(diafenthiuron)、植物生长调节剂的呋苯硫脲(fuphenthiourea)、杀鼠剂安妥(antu)等。进而引发了人们对硫脲类化合物是否具有抗植物病毒活性的思考,硫脲类植物病毒抑制剂的研究已引起了人们的重视,特别是近几年来,已成为化学界和生物学界学者们研究的热点之一。

2003年,宋宝安等[2]以异硫氰酸酯为原料合成了几种含三氟甲基或杂环1,3-二取代的非对称硫脲:1a~1e,其合成路线见图1。生物活性测定结果表明:化合物1b有较好的活体治疗活性,在浓度为500 μg/mL时,对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的抑制率为70.1

* E-mail: yangsdqj@https://www.360docs.net/doc/e818800268.html,

作者简介:范会涛,硕士,主要从事农药生物学研究工作。

基金项目:教育部博士点基金(20060657004), 国家自然科学基金(Nos: 20872021, 20762002)和国家973重点基础研究发展计划(No: 2010CB126105)资助项目.

%。

图1 化合物1的合成

2006年,臧洪俊等[3]通过5种糖基异硫氰酸酯与β-氨基丁酸甲酯经亲核加成反应,合成了5种N-(2-甲氧羰基-1-甲基)-乙基-(N’-1)-乙酰基吡喃型糖)硫脲:2a~2e,其合成路线见图2,生物活性测试结果表明,该类化合物对TMV具有一定的诱导抗性。

H3C C C

H

COOH NH

2

CONH2

ethylene glycol HN NH

O

O

H3C

NaOH/H2O

H3C

H

HN

CH2

C

O

NH2NaOH/H O

-Na2CO3,-NH3

H3C C

NH2

COONa

H

H3C

H

NH2

CH2

COO

SiCl(CH)

CH3OH

H3C C

H

NH2

CH2

3

Gly Br Pb(SCN)

2

Gly NCS

H3C

H

NH2

CH2

3

Gly Gly NHCH

S

3

CH2COOCH3

2

图2 化合物2的合成

Gly: 2a. Tetra-o-acetyl-β-D-glucosyl; 2b. Tetra-o-acetyl-β-maltosyl;

2c. Hepta-o-acetal-β-maltosyl; 2d. Hepta-o-acetyl-β-D-laltosyl;

2e. Tri-o-acetyl-β-D-xylosy

2009年,闫志坤等[4]用离子液体合成了一系列手性硫脲衍生物:3a~3x,见图3。生物活性测试结果表明:其中含有茚基的化合物3i在浓度为500 mg/L时具有很好的抗TMV活性,活体治疗、保护、钝化抑制率分别为57.0%、55.0%、96.4%,其中活体治疗、保护作用均高于对照药剂宁南霉素(55.9%、53.9%),钝化作用与宁南霉素(96.5%)相当。

NCS

R R1NH2

*

H

N

H

N

S

R1

R

*

3

3a: R=H, R1= (S)-1-(3-methoxyphenyl)ethyl;

3b: R=H, R1=(R)-1-hydroxybutan-2-yl;

3c: R=H, R1=(R)-2-(methoxymethyl)pyrrolidin-1-yl;

3d: R=H, R1=(R)-1-cyclohexylethyl;

3e: R=H, R1=(S)-1-cyclohexylethyl;

3f: R=H, R1=(R)-1-(4-fluorophenyl)ethyl;

3g: R=H, R1=(S)-1-(4-fluorophenyl)ethyl;

3h: R=H, R1=(R)-2, 3-dihydro-1H-inden-1-yl;

3i: R=H, R1=(S)-2, 3-dihydro-1H-inden-1-yl;

3j: R=H, R1=(R)-1-(naphthalen-1-yl)ethyl;

3k: R=H, R1=(S)-1-(naphthalen-1-yl)ethyl;

3l: R=H, R1=(S)-1-(4-methoxyphenyl)ethyl.

3m:R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(S)-1-(naphthalen-1-yl)ethyl;

3n: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(R)-1-(naphthalen-1-yl)ethyl;

3o: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(S)-1-cyclohexylethyl;

3p: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(R)-1-cyclohexylethyl;

3q: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(S)-2, 3-dihydro-1H-inden-1-yl;

3r: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(S)-2, 3-dihydro-1H-inden-1-yl;

3s: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(S)-1-(4-fluorophenyl)ethyl;

3t: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(R)-1-(4-fluorophenyl)ethyl;

3u: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(S)-1-p-tolylethyl;

3v: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(R)-2-(methoxymethyl)pyrrolidin-1-yl;

3w:R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(R)-1-hydroxybutan-2-yl;

3x: R= 3, 5-bis(trifluoromethyl)phenyl, R1=(S)-1-(4-methoxyphenyl)ethyl.

图3化合物3的合成

2009年,陈美航等[5]合成了一系列含膦酸酯手性硫脲化合物:4a~4n,其结构见图4。生物活性测试结果表明:化合物4g在浓度为500 mg/L时对TMV有较好的治疗活性,抑制率接近于对照药剂宁南霉素。

R3

N

H

N

H

P

S

2

*OR

2

4

4a: R2= Et R3=(S)-1-phenylethyl 4h: R2= n-Pr R3=(R)-1-cyclohexylethyl

4b: R2= Et R3=(R)-1-phenylethyl 4i: R2= i-Pr R3=(S)-1-phenylethyl

4c: R2= Et R3=(S)-1-cyclohexylethyl 4j: R2= i-Pr R3=(R)-1-phenylethyl

4d: R2= Et R3=(R)-1-cyclohexylethyl 4k: R2= i-Pr R3=(S)-1-cyclohexylethyl

4e: R2= n-Pr R3=(S)-1-phenylethyl 4l: R2= i-Pr R3=(R)-1-cyclohexylethyl

4f: R2= n-Pr R3=(R)-1-phenylethyl 4m: R2= n-Bu R3=(S)-1-cyclohexylethyl

4g: R2= n-Pr R3=(S)-1-cyclohexylethyl 4n: R2= n-Bu R3=(R)-1-cyclohexylethyl

图4 化合物4 的结构式

关于硫脲类植物病毒抑制剂的作用机理,目前还没有相关报道,有待进一步研究。2. 吡唑类植物病毒抑制剂

2008年,欧阳贵平等[6]以1-取代芳基-3-甲基吡唑酮为原料,通过POCl3氯化合成了一系列吡唑类衍生物:5a~5n,其结构式见图5。

生物活性测定结果表明:化合物5l 、5m 在浓度500 mg/L 时对TMV 有较好的治疗活性,抑制率分别为62.0%、60.0%高于对照药剂宁南霉素(56.0%)。钝化抑制率分别为85.6%、82.9%接近于宁南霉素(91.0%)。 N

CH R 12

35

5a : R 1=H R 2=Me R 3=Me 5b : R 1=H R 2=F R 3=Me

5c : R 1=H R 2=F R 3=Ph 5d : R 1=3-Cl R 2=F R 3=Ph

5e : R 1=4-Cl R 2=MeO R 3=Ph 5f : R 1=4-Me R 2=F R 3=Ph

5g : R 1=4-Cl R 2=F R 3=Ph 5h : R 1=4-Me R 2=F R 3=Me-CH=CH-CH=CH 5i : R 1=H R 2=F R 3=Me-(CH 2)4 5j : R 1=Me R 2=F R 3= Me-(CH 2)4 5k : R 1=4-Cl R 2=Me R 3= Me-CH=CH-CH=CH 5l : R 1=4-Cl R 2=F R 3= Me-(CH 2)4 5m : R 1=4-Cl R 2=F R 3=Me-CH=CH-CH=CH 5n : R 1=H R 2=F R 3=n-Pr

图5化合物5的结构式

室内生物活性测试结果表明:吡唑衍生物5l 对TMV 具有较高的钝化活性(在浓度为500 mg/L 时,对TMV 的钝化抑制率为85.6%)而治疗和保护相对较低(治疗和保护抑制率分别为62.0%和31.0%)提示吡唑衍生物5l 抗TMV 机制与直接作用于病毒组分相关。本课题组进一步分离纯化TMV RNA 和CP 组分,采用荧光光谱和紫外波谱试验发现吡唑衍生物5l 与TMV 的CP 作用后,在波谱上引起荧光淬灭和红移,而与TMV RNA 和花青类染料作用后没有明显的波谱特征改变,提示吡唑衍生物5l 抗TMV 的作用靶标在CP 上,可能产生和CP 特异亲合,从而抑制病毒的增殖和转移。

对普通烟PR 基因的研究:化合物5l 处理已感染TMV5天的普通烟后,普通烟叶片病程相关蛋白-1a(pathogenesis-related proteins, PR-1a)基因表达明显上调,高于对照药剂宁南霉素,说明化合物5l 具有诱导PR-1a 基因表达的作用;结果表明5l 可诱导PR-1a 基因表达,提高烟草抗病毒的能力。这些结果为创制具有高效农用抗病毒活性的新化合物提供了先导化合物;由此,该类化合物具有较好的抗TMV 活性,对该类化合物进行结构优化,筛选出高活性的植物病毒抑制剂是很有希望的。

3. 氰基丙烯酸酯类植物病毒抑制剂

2-氰基丙烯酸酯及其类似物是一类具有新颖光合作用光系统II (PSII) 抑制作用的化合物,其研究最早见于1969年法国专利[7],自1981年Huppatz 等[8]第一次报道有关它的Hill 反应抑制活性后,关于此类衍生物的合成方法和生物活性研究受到人们的广泛关注[9~15],研究结果表明:具有除草、杀虫、杀菌、抗病毒、抗癌及植物生长调节等方面的生物活性,现已成为国内外农药研究的重要方向之一。本课题组从2003年起,开展了一系列氰基丙烯酸酯类化合物的合成及生物活性的研究,先后报道了含芳香胺、手性胺、膦酸酯、氨基膦酸酯结构的氰基丙烯酸酯类化合物合成,生物活性测试结果表明,部分目标化合物表现出适中的

或较好的抗TMV 活性。 2004年本课题组[16]发明公开了氰基丙烯酸酯类衍生物的抗植物病毒活性,合成路线如图6所示。发明介绍了化合物6a 、6e 对TMV 的抑制作用,表现出一定的抗TMV 活性。 NCCH 2CO 2R R 1OOC

NC SCH 3SCH 3CS ,Me SO 32R 1133

6a : R 1 = C 2H 5; X = S; R 2 = CH 3; R 3 =CF 3Cl 6b : R 1 = C 2H 5; X = S; R 2 = CH 3; R 3 =CF 36c : R 1 = C 2H 5; X = N; R 2 = i-C 3H 7; R 3 =CF 36d : R 1 = C 2H 5; X = N; R 2 = CH 2Ph; R 3 =

CF 3 6e : R 1 = C 2H 5; X = N; R 2 = n -C 3H 7; R 3 =N Cl

H 3C Cl

R 1OOC

NC

XR 2NHR 36

图6 化合物6的合成

2005年,宋宝安等[17]报道了系列含手性胺取代的2-氰基丙烯酸酯衍生物7。合成路线如图7所示。

室内抗TMV 活性测试结果表明:此系列化合物有一定的抗TMV 活性,其中手性化合物7c(R ) (Ar=对硝基苯基) 活体钝化和活体治疗效果较好,在浓度为500 μg / mL 时,抑制率分别为89.1 %和53.1 %。

C 2H 5OOC NC

SCH SCH 32C 2H 5OOC NC SCH NH-Ar

C 2H 5OOC

NC NH*CH(CH 3)Ph NH-Ar Ph*CH(CH 3)NH 7

CF 3NO 2Br NHC

O OCH 3OCH 3

OCH 3Ar =

图7化合物7的合成

2007年,吕印谱等[18]为了发现高效的抗TMV 活性化合物,运用活性基团拼接法,将活性基团膦酰基引入到氰基丙烯酸酯结构中,设计合成了衍生物8。合成路线如图8所示。 生物活性测试结果表明:这些化合物均有一定的抗TMV 活性,尤其是化合物8a (R 1=C 2H 5, R 2=C 2H 5) 和8b (R 1=C 2H 5, R 2=i -C 3H 7) 对TMV 有较好的活体治疗活性,在浓度为500 μg / mL 时,抑制率分别为60.0 %和64.2 %。

NCCH 2CO 2R 1R 1OOC NC SCH 3SCH 3224R 1OOC

NC SCH 3P NaH/THF 8P O

OR 2OR 2H O OR 2OR 2

图8化合物8的合成

2007年,汪清民等[19]报道了含呋喃或四氢呋喃苄胺取代的氰基丙烯酸乙氧乙酯类系列化合物:9~12,结构如图9所示。他们通过合成不同的呋喃或四氢呋喃苄胺中间体,然后再与3-甲硫基-2-氰基丙烯酸酯反应制得目标化合物。

生物活性测试结果显示:部分化合物有较好的除草活性、一定的杀虫活性以及一定的植物生长调节作用,如对黄瓜、小麦等;同时他们也对此类化合物进行了抗TMV 测试,但是此系列衍生物表现出很弱的抗TMV 活性。 COOC 2H 4OC 2H 5CN H 2CHN

R

O COOC 2H 4OC 2H 5CN H 2CHN

R

O

COOC 2H 4OC 2H 5CN H 2CHN R O

COOC 2H 4OC 2H 5CN H 2CHN R O 9

101112

R=MeS; Me; Et; n -Pr; i -Pr

图9化合物9~12的结构

2008年,宋宝安等[20]在微波催化合成的条件下,将取代的手性甲基苄胺及取代的苯胺引入到氰基丙烯酸酯中,设计合成了一系列衍生物13。合成路线如图10所示。 生物活性测试结果表明:此类化合物有一定的抗TMV 活性,其中化合物(R )-4p (R 1=F,

R 2=Ph) 对TMV 有很好的抗TMV 活性,

在浓度为500 μg / mL 时,对TMV 有较好的活体治疗作用,抑制率达到64.0 %。

3C 2H 2C H CH 3R 1*R 1=F, Br, H; R 2=Ph, 2-NO 2-Ph, 3-NO 2-Ph, 2,4-bis-NO 2-Ph, 4-CF 3-Ph

13

图10化合物13的合成

同年宋宝安等[21]为了进一步探索氰基丙烯酸酯这类环境友好型化合物的生物活性,为了寻找更高抗TMV 活性的化合物,在本课题前期研究的基础上,采用活性基团拼接法,将具有广泛的活性的α-氨基膦酸酯引入到氰基丙烯酸酯结构中,设计合成了一系列新型的氰基丙烯酸酯 (酰胺) 化合物14。合成路线如图11所示。

生物活性测试结果表明:目标化合物有一定的抗TMV 活性,尤其是化合物14a (R 1=H,

R2=n-Bu, R3=OCH3) 和14b (R1= H, R3=C2H5, R3= NH2) 对TMV表现出很好的活体治疗活性,在浓度为500 mg / L时,抑制率分别是55.9 %和55.6 %。

2

2

14

图11化合物14的合成

2009年,杨家强等[22]等报道了与14类似,但是膦酸值部分为烷氧烷基的氰基丙烯酸酯(酰胺) 类衍生物15,如图12所示,生物活性测试结果表明:该类化合物具有一定抗烟草花叶病毒活性,其中化合物15a、15b在500 μg / mL对TMV有较好的活体治疗作用,抑制率分别为58.8 %、60.0 %,与现有商品化药剂宁南霉素的活性相当。

图12化合物15的合成

4 α-氨基膦酸酯及其衍生物类植物病毒抑制剂

α-氨基膦酸酯类化合物作为天然氨基酸类似物,具有抗植物病毒、植物生长调节、除草、杀菌、抑制癌细胞、抑制酶活性等重要生物活性,不少品种还具有低毒、低残留、对哺乳动物毒性低等优点。因此对该类化合物的分子设计、合成及生物活性等研究引起了化学和生物研究者的广泛关注。

本课题组根据生物等排原理和亚结构连接法,设计合成了一系列含氟和杂环取代的α-氨基膦酸酯类新化合物,抗烟草花叶病毒活性测试结果表明,此类化合物具有良好的生物活性,其中开发的具有自主知识产权的α-氨基膦酸酯类抗烟草花叶病毒制剂“病毒星”的大田试验药效明显高于对照药宁南霉素与病毒A[15]。近年来,人们尝试着用不同的胺、醛和不同的亚磷酸烷基酯反应,合成了N-端(氮端)、C-端(碳端)、P-端(磷端)为不同取代的α-氨基烷基膦酸的衍生物,以寻找具有高生物活性的化合物。

2002年本课题组筛选出高效抗TMV药剂毒氟磷,已获农业部农药临时登记证,成为了中国第一个具有自主知识产权的仿生合成的抗病毒品种药剂,其分子结构如图13所示。

S N

CH 3H N H C P

F O H 3CH 2CO

OCH 2CH 3 图13 毒氟磷分子结构式

2003年,宋宝安等[24]报道了含氟芳基α-氨基烷基膦酸酯类新化合物16。采用活性基团

拼接法将氟原子引入α-氨基烷基膦酸酯中,合成了目标化合物16。合成路线如图14所示。

室内抗TMV 生物测试结果表明:该类化合物具有良好的抗TMV 活性,其中16a (R 1=p -F , R 2=Et)化合物在浓度为500 μg/mL 时对TMV 活体治疗活性达到了67.03 %。

图14目标化合物15的合成路线

2008年,胡德禹等[25]报道了一系列含α-氨基烷基膦酸酯的酰胺类新化合物17。合成路线如图15所示。

室内抗TMV 测试结果表明:该类化合物具有良好的抗TMV 治疗活性,其中17a (R 1=H , R 2=2-FC 6H 4, R 3=Et)和17b (R 1=H , R 2=3,4,5-OCH 3, R 3=n -Pr)化合物在浓度为500 μg/mL 时对TMV 活体治疗活性达到了

56.0%和56.7%

图15 目标化合物17的合成路线

2009年,宋宝安等[26]以普通烟K326-TMV 为研究模型,采用Real-time PCR 和半定量PCR 方法发现毒氟磷可诱导烟草病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs )基因PR-1a 和PRs 蛋白表达上调;采用酶生物化学试验发现毒氟磷可在一定时间内诱导烟草苯丙氨酸酶(L -phenylalanine ammonia-lyase ,PAL )、过氧化物酶(Peroxidase ,POD )和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase ,SOD )活性增加,提高烟草PAL 、POD 和SOD 等活性以及增加烟草叶绿素含量,表明植物病毒抑制剂毒氟磷通过激活烟草产生系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR ),以提高烟草抗植物病毒的活性。

5 结论与展望

近年来随着新的外来植物病毒种类入侵,以及传媒害虫抗性增加,引发了农作物病毒病逐年加重,发生面积越来越大,损失越来越严重,2008年仅山东一省因玉米粗缩病所带来的损失就超过40亿元,环境友好的高效抗植物病毒剂亟待开发。近年来,国内外在此领域开展了一定的工作,取得了一定的进展,本课题组并创制出一个具有完全自主知识产权的抗植物病毒剂农药新品种,并对其作用机理开展了较为深入的研究,取得了较好的进展。相信随着计算机辅助分子设计、病毒学、结构生物学、分子生物学、生物化学等相关学科的飞速发展及现代检测分析技术的进步,对抗植物病毒剂新颖作用靶标及作用机理的研究预期将可取得突破,也将为抗植物病毒剂的研发提供更好的平台,开发出作用机制新颖、环境友好的高效抗植物病毒剂大有希望。

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New Research Progress on Synthesis and Action Mechanism of New Antiviral Agents for Plant

FAN Hui-Tao, YANG Song, CHEN Zhuo, SONG Bao-An, HU De-Yu, XUE Wei, LI

Xiang-Yang

(National and Local Jointed Engineering Lab for Biomass Comprehensive Utilization, Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural bioengineering of Ministry of Education, Center for Research and Development of Fine Chemicals, Guizhou University, Guiyang 550025)

Abscract

Plant virus is a serious threat to agriculture. The research and development of antiviral agent for plant is one of the most important area in new pesticide research. This paper reviewes the synthesis, biological activity and action mechanism of new compounds with antiviral bioactivities containing thiourea, pyrazole, cyanoacrylates,α-aminophosphonate structure in recent years.

Keywords: antiviral; synthesis; action mechanism

植物病毒病的有效防治方法

植物病毒病的有效防治方法 现在病毒病的危害有日益严重的趋势,发病病毒种类越来越多,常见到的有厥叶病毒,花叶病毒,条斑病毒,银叶病毒,黄化病毒,等几十种,而且混发的现象日趋严重。当前如何解决植物病毒病,是目前农业生产中非常紧迫的问题。植物病毒病的解决也是农民增产增收的保证。 一、病毒病的发病原因 (1)传染源 (2)传媒 (3)高温 (4)干旱 (5)光照过强 (6)品种本身的原因 二、预防措施 (1)切断传染源,措施:种子消毒,接种抗毒免疫剂。选择无毒种苗。利用茎尖脱毒克隆方法繁育种苗。 (2)消灭传媒,做好蚜虫,白粉虱等害虫的防治工作。 (3)尽量控制好温度,最高温度应控制在32度以下,如温度过高,就要采取措施,地面要经常浇小水,叶面多喷喷抗毒免疫剂或灌根。 (4)避免干旱,小水勤浇。要控制合适的湿度。 (5)夏天光照强时要进行适当遮光。 (6)增喷抗毒免疫剂,中药及生物的为最好。 (7)选育抗病毒品种 (8)改进栽培措施,选择先进的有机栽培模式。增强本身抗病毒能力。 三、治疗措施

(1)种子用脱毒剂进行处理,磷酸三钠10倍浸泡10分钟,或高猛酸钾100倍浸泡,或抗毒免疫剂100倍浸种10分钟,冲洗干净后播种或催芽。 (2)用无毒无菌无虫卵基质育苗。 (3)要尽量用有机栽培模式,利于根系发育,提高本身抗病毒能力 (4)出苗后接种抗病毒疫苗三次以上。 (5)移栽后定期喷洒抗病毒疫苗或制剂。 (6)冲施肥要以天然有机肥为主,用生物发酵好的肥料,厌氧菌或放线菌类有益防腐微生物为最好,养根壮根,提高产量的同时提高其抗病毒能力。 关于植物病毒病 植物病毒对寄主的危害,素有“植物癌症”之称,防治上十分困难。病毒在侵染寄主后,不仅与寄主争夺生长所必需的营养成分,而且破坏植物的养分输导,改变寄主植物的某些代谢平衡,使植物的光合作用受到抑制,致使植物生长困难,产生畸形、黄化等症状,严重的造成寄主植物死亡。为了有效地控制植物病毒病,人们采用了各种措施,包括轮作、种子脱毒、病毒间的弱毒株系交叉保护、抗病品种的选用、传毒介体的控制及化学农药的使用等,近年来转基因植物抗病研究也有了新的进展。但这些措施还不能有效克服病毒的危害,且化学农药的使用对环境造成了很大危害,在当前大力提倡绿色食品和环境保护的前提下,加强植物病害的综合防治和减少化学农药的使用已成为植保工作者工作的重点内容之一。为了能开发出有效控制病毒且不会造成环境污染的抗病毒药剂,研究人员不断寻找和筛选天然的生物源抗病毒物质。目前,国内外已报道的天然抗病毒活性物质种类很多,有的已形成产品,在农业生产中发挥着重要作用。 一、改变耕作制度,加强栽培管理,预防植物病毒病的发生和流行 1.轮作套种采用不同作物和品种的轮作和套种,可以减少病原积累,防止病害严重发生。 2.选择适宜播种期播种期的选择对病毒病的发生也有很大影响。 3.加强苗期管理苗床和苗期的管理对预防和控制病毒病的发生十分重要,因为苗床上的病株,可能成为大田发病的重要毒源。因此,要尽力保证幼苗不生病或少生病,加强田间栽培管理,提高植物抗病毒病的能力,铲除田间地头杂草,拔除病株以除掉毒源,及时治虫防病,也能减轻病害。 二、种植抗、耐病品种 采用抗病和耐病品种可以经济有效地防治和减轻病毒病的发生。多数抗病品种可以抵抗病毒复制和扩散,有些蔬菜可以抗传毒介体。

病毒学的几个概念:PFUMOITCID50

*** *** 病毒学的几个概念:PFU MOI TCID50 PFU:plaque forming unit ,空斑形成单位。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml 。由于测定pfu 往往重复性较差,因此近些年许多研究又开始采用TCID50 方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50 法。 MOI :multiplicity of infection ,感染复数。传统的MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。 其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu 。一般认为MOI 是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是pfu number/cell 。后来MOI 被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量 的比值。 然而,由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使MOI 产生了不同的含义。能产生细 胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu 表示病毒数量,因此其MOI 的含义与传统的概念相同。 传统意义上的MOI 的测定,其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件,遵循Poisson 分布规律,可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数(MOI )。其公式为: P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP (0)。 其中: P 为被感染细胞的百分率 P(0) 为未被感染细胞的百分率 m 为MOI 值 例如,如果要感染培养皿中99% 的培养细胞,则: P(0) = 1% = 0.01 m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell 。 TCID50 Protocol : 1:制备96 孔板单层细胞 2:将病毒做系列稀释,横向接种单层细胞板,每稀释度重复 3 孔 3:每日观察细胞病变,记录高于50 和低于50%病变孔的病毒稀释度, 4:计算比距,获得TCID50 计算比距: (高于50%的病变率-50%)/(高于50%病变率-小于50%病变率)=比距; 比距与接近50% 病变率的病毒的稀释度的指数相加,就获得了指数。 比如:比色计算或者显微镜观察病毒的TCID50 在10 的负7 和8 次方之间,那么,指数-8 与比距相加,获得的新的指数,就是TCID50 的指数,TCID50=10 的-7.几次方 TCID50 与PFU 换算: PFUs=0.7 ×TCID50 的滴度

高级植物病毒学

高级植物病毒学

高级植物病毒学 第一讲 1.病毒:病毒是一组(一种或一种以上)RNA或DNA核酸模板分子,包被在蛋白或脂蛋白外壳内,在合适的寄主细胞内,依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制,随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别: ⑴与细胞型寄生物的区别:①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜(continuous bilayer membrane)与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体(virion或virus particle)。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。⑵与质粒的区别:①正常的病毒具有粒子形态,其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的,并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化,对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡,但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别: ①大小: 一些痘病毒(pox virus)比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面,病毒与许多类群的专性细胞性寄生物(cellular parasite)如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。

植物病毒田间接种、传染方式教材

实验六植物病毒病及其传染方式 一、实验目的 认识植物病毒形态和病毒病主要症状类型,通过植物组织汁液的摩擦接种和蚜虫传播试验了解病毒病的主要传染方式。 二、讲解要点 1.病毒颗粒很小,必须用电子显微镜才能观察到。植物病毒颗粒可以分为圆球状(或等边多面体)、炮弹状、长杆状和线条状4种。这些在课堂和本次实验课上只能通过观看电镜照片或幻灯片来了解。 2.植物病毒病的主要症状类型有花叶、变色、条纹、枯斑或环斑坏死、畸形。应该注意:一方面这些症状类型的分辨在病毒病鉴定上具有比起它病害更重要的意义,另一方面在实际观察中,也会发现同一种病毒病在发病过程中或在不同环境条件下会有不同的表现(不同病状甚至隐症)。 3.病毒病多为系统性侵染,没有病征,易与非侵染性病害相混淆,往往需要通过一定方式的传染试验证实其传染性。植物病毒病的传染方式有:机械(摩擦)接触传染、嫁接传染、介体(包括昆虫、线虫、真菌、螨类和菟丝子)传染、花粉及种子传染等。由于病毒是专性寄生物,它的侵染来源都与活体(活的动、植物体或介体)有关,传染要使病毒接触活体。例如汁液摩擦接种,要用新鲜的病毒汁液,摩擦的目的是造成寄主植物体表面的微伤,使病毒有可能进入活的细胞,过重的损伤造成组织坏死并不利于病毒的传染。蚜虫、飞虱等刺吸式口器昆虫取食植物汁液的方式更容易满足植物病毒传播的两方面要求。 4.大白菜病毒病的症状为幼苗受侵后首先心叶出现明脉即沿叶脉失绿,继呈花叶及皱缩。成株被害,出现不同程度的叶片皱缩、变硬而脆,后期出现褐色斑点或褐色坏死条纹;植株矮化。我国十字花科蔬菜病毒病主要由芜菁花叶病毒(简称TuMV)、黄瓜花叶病毒(简称CMV)和烟草花叶病毒(简称TMV)所致,前两种病毒能由蚜虫和汁液传染,第三种只能以汁液传染。 马铃薯病毒病主要是皱缩花叶病和卷叶病两种。前者的症状为叶片皱缩、变小;叶尖向下弯曲,全株矮化,叶片色泽深浅不均,以后出现黑褐色坏死斑,质地变脆,严重时全株发生坏死性叶斑,自下而上枯死。马铃薯皱缩花叶病是由马铃薯X病毒(简称PVX)和马铃薯Y 病毒(简称PVY)两种病毒复合侵染引起的。PVX只能由汁液传染,昆虫不传染。PVY的传染方式有汁液与蚜虫传染。马铃薯卷叶病的症状为叶缘向上卷曲,病重时呈圆筒状。叶片色泽较浅,有时叶背面呈红色或紫色。叶片变厚变脆,病叶不出现萎蔫下垂的现象,矮化亦

植物组织培养研究进展

植物组织培养研究进展 摘要 植物组织培养技术作为一种科研手段,发展异常迅猛。从组织培养的原理、培养过程中遇到的问题以及前景和展望这3方面综述了我国近几年植物组织培养的新研究。 关键词: 组织培养;存在问题;措施;发展 20 世纪后半叶,植物组织培养发展十分迅速,利用组织培养,不仅可以生产大量的优良无性系,并可获得人类需要的多种代谢物质;细胞融合可打破种属间的界限,克服远缘杂交不亲和性障碍,在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力;还可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体;组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料[1]。因此,植物组织培养广泛应用于植物科学的各个分支,如植物学、植物生理学、遗传学、育种学、栽培学、胚胎学、解剖学、病理学等,并广泛应用在农业、林业、医药业等多种行业,产生了巨大的经济效益和社会效益,被认为是一项很有潜力的高新技术。 1组织培养的基本原理 1.1植物组织培养的概念 植物组织培养技术是指在无菌条件下,将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱发产生愈伤组织或潜伏芽等,或长成完整的植株的技术[2]。 1.2植物组织培养的依据 植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年,德国著名植物学家GHaberlanclt根据细胞学理论[3],大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直到单个细胞,即植物体细胞在适当的条件下具有不断分裂和繁殖,发育成完整植株的潜力的观点。1943年,美国人White在烟草愈伤组织培养中, 偶然发现形成一个芽, 证实了GHaberlanclt的论点[4]。在许多科学家的努力下,植物组织培养技术得到了迅速发展,其理论和方法趋于完善和成熟,并广泛应用产生了巨大的经济效益和社会效益。 1.3培养基的选择 组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White等[5]。由于不同植物所需要的生长条件有所不同,会对培养基做一些不同的处理,一般采用较多的是MS。组织培养采用固体培养基的较多,但只有在植物周围的营养物和激素被吸收,如果其他残留的培养基也能被利用,对工厂化生产的成本减少方面有很大的帮助。董雁等[6]利用回收转换后废弃的继代培养基,加入原继代培养基30 %浓度母液的培养基,培养效果与原继代培养基的基本相同,说明继代培养基再利用是可行的,这为规模化组培育苗开辟了新的途径。杜勤[7]等在无外源激素条件下,研究液体和固体培养基对黄瓜子叶培养器官分化的影响,结果用液体培养基直接诱导花芽率更高,分化高峰期出现的时间也更早,说明液体培养基对外植体的生长更有利,只是固体培养基更易操作而被较广泛应用。 2植物组织培养过程中存在的问题 2.1 污染问题 组织培养过程中的污染包括内因污染和外因污染。内因污染指由于外植体的表面或者内部带菌而引起的污染;外因污染则是主要由环境污染和操作不当引起,是指在接种或培养过程中病菌入侵,例如培养基、接种工具和接种室消毒不严格以及操作不规范等[8]。 针对植物组织培养中污染产生的原因,应从以下2个方而着手来控制污染。一是控制外植体自身带菌,外植体的表而带菌可以经过一系列的杀菌处理来减少;而外植体的内部带菌是不

高级植物病毒学

高级植物病毒学 第一讲 1.病毒:病毒是一组(一种或一种以上)RNA或DNA核酸模板分子,包被在蛋白或脂蛋白外壳内,在合适的寄主细胞内,依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制,随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别: ⑴与细胞型寄生物的区别:①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜(continuous bilayer membrane)与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体(virion或virus particle)。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。 ⑵与质粒的区别:①正常的病毒具有粒子形态,其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的,并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化,对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡,但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别: ①大小: 一些痘病毒(pox virus)比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面,病毒与许多类群的专性细胞性寄生物(cellular parasite)如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。 3.专著和刊物 《植物病毒学》《植物病毒研究方法》《植物病毒种类的分子鉴定》《Plant Virology》《微生物学报》《植物保护学报》《植物病理学报》Plant Disease、Phytopathology、Molecular Plant Microbe Interactions、Molecular Plant Pathology、Virus Genes、Archives of Virology、Virus Research、Journal of General Virology 第二讲 1.类病毒:不具病毒粒体,而是裸露的RNA,能侵染细胞,进行自我复制,称为类病毒。 2.卫星核酸:是指依赖于辅助病毒才能复制的线状和环状小分子核酸,其核酸序

植物组织培养的研究进展和发展趋势

植物组织培养的研究进展和发展趋势 (甘肃农业大学生命科学技术学院植物生物技术,甘肃兰州730070) 摘要:植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的原理而发展起来的一门生物技术。本文简要概述了植物组织培养的概念及研究进展,较全面的综述了植物组织培养新技术以及在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面的研究现状,最后展望了植物组织培养的发展趋势。 关键词:组织培养;研究进展;发展趋势 Research Progress in Plant Tissue Culture and trends (College of life science and technology of plant biotechnology of Gansu Agricultural University,gansulanzhou 730070) Abstract: Plant tissue culture plant cells are totipotent under the principle and developed a biotechnology. This article provides a brief overview of the concepts and plant tissue culture research, a more comprehensive overview of plant tissue culture propagation of new technologies as well as in detoxification, breeding, germplasm conservation, extraction of secondary metabolites, and other aspects of gene transfer research status , Finally, the future trends in plant tissue culture. Key words: organizational culture; research status; trends 引言 植物组织培养是20世纪之初,以植物细胞全能性为理论基础发展起来的一门新兴技术,是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的环境里培养成完整的植株,也称离体培养或植物克隆。自1902年德国科学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性理论, 到1934 年美国White 等用番茄根进行离体培养证实这一观点以来,植物离体培养技术在基础理论和应用研究,已广泛应用到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学 等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一[1]。近年来,随着 科学技术的不断发展,植物组织培养新方法和新技术不断涌现,研究重点也由器官、细胞水平向分子、基因方向转移。21世纪,生物技术是最有生命力的一门学科,而植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段,被认为具有巨大的潜力,现就植物组织培养技术研究进展做一简单综述。 1在植物育种上的应用 植物组织培养技术对培养有粮作物品种开辟了全新的途径。目前,国内外已

植物病毒病检测方法

植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害,严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂,对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展,植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上,根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的,而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法,如果不经过侵染力的验证,将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉-碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种,为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围,须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟(Nicotiana glutinosa)接种叶片上引起局部坏死斑点,在一定的病毒浓度范围内,所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础(田波,1987)。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法,但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外,还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉-碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时,采用此法。Holmes(1931)发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块,但不能用于计数。将这种接种叶用95%乙醇加热到80℃固定,然后用I2和KI混合液(10克I2,30克KI,1500毫升H2O)染色时,则侵染点处出现淀粉-碘的蓝色反应。当下午采摘叶片,褪色过夜,然后用碘液染色,则侵染点较周围组织着色浅;当采摘叶片前,植株先在黑暗中放几个小时,再用碘液染色,则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成,也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉-碘染色的强弱受环境条件的影响较大,不如局部枯斑法可靠,但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时,可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释,可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验

组培的研究进展及发展趋势

组培的研究进展及发展趋势 植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的原理而发展起来的一门生物技术。简要概述了植物组织培养的概念及研究进展,较全面的综述了植物组织培养新技术以及在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面的研究现状,最后展望了植物组织培养的发展趋势。 关键词:组织培养;新技术;应用现状;发展趋势 植物组织培养是20世纪之初,以植物细胞全能性为理论基础发展起来的一门新兴技术,是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的环境里培养成完整的植株,也称离体培养或植物克隆。自1902年德国科学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性理论, 到1934年美国White 等用番茄根进行离体培养证实这一观点以来,植物离体培养技术在基础理论和应用研究,已广泛应用到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一。近年来,随着科学技术的不断发展,植物组织培养新方法和新技术不断涌现,研究重点也由器官、细胞水平向分子、基因方向转移。21世纪,生物技术是最有生命力的一门学科,而植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段,被认为具有巨大的潜力。 一、植物组织培养新技术的研究 随着科学技术的发展和对植物组织培养技术的不断深入研究,一些新的培养方法和技术不断出现,为植物组织培养技术的不断优化和发展提供了新的途径。 1.新型光源的应用 光是植物生长发育必不可少的重要因素之一,光照长短、光质、光周期对植物的生长、形态建成、光合作用、新陈代谢以及基因表达均有调控作用。传统的组织培养光源灯普遍存在寿命短、发热量大且不均以及发光效率不理想等缺点。LED作为植物组织培养光源早在1991年就有栽培试验。研究发现, 光质比例和光照强度可调的LED 光源比通常植物组织培养使用的荧光灯更能有效地促进试管苗的光合作用和生长发育。蒋要卫利用LED作为大花蕙兰组培苗光源的研究发现, LED光源可以显著改善大花惠兰试管苗的生长状况和提高其品质。日本的田中道男等运用阴极荧光灯( CCFL)作为文心兰试管苗光源, 结果表明其地上部干、鲜重和试管苗的高度都有显著提高。另外田中道男等利用SILHOS 作为生菜组织培养光源, 获得了高质量的组织培养苗。目前LED是组织培养中最有效的人工照明光源,而CCFL等新型光源是未来发展的主要方向。 2.开放组织培养技术 传统的植物组织培养属于严格的封闭式培养,因而造成灭菌成本偏高、培养基易污染、外界环境调控难度大等缺点。而开放组织培养新技术是在外加抗菌剂的条件下,使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境,在自然开放的有菌环境中进行,恰好弥补了这些不足。赵青华等采用开放式组培技术,在培养基中添加抑菌剂,克服了非灭菌条件下魔芋组织培养污染问题,有效地简化了实验步骤,降低了生产成本。何松林的研究表明在添加抗菌剂的开放式组培中,文心

国内外苔藓植物组织培养研究进展

国内外苔藓植物组织培养研究进展 文章在对苔藓植物的特征及组织培养研究简史进行简要介绍的基础上,重点介绍了国内外学者对苔藓植物组织培养材料及基质的选择、外植体的消毒方法、培养基成分的选择及培养条件的筛选等4个方面的研究进展。 标签:苔藓植物;组织培养;消毒方法;培养基 苔藓植物是植物界中比较特殊的一个植物类群,主要生活在阴湿的环境中,是一类由水生向陆生过渡的重要的原始高等植物。苔藓植物生活史为典型的异型世代交替,孢子体则寄生于配子体上生活,孢子在产生新的配子体过程中还需要经过一个原丝体阶段。目前,全世界大约有2.3万种苔藓植物,其种类仅次于被子植物。 苔藓植物能够蓄积大量水分,因此对水土保持与涵养、森林及某些附生植物的发育都有极其重要的作用。此外,苔藓植物还含有脂类、萜类、黄酮类、生物碱、醌类等活性物质,因此具有极高的药用价值。 苔藓植物的组织培养历史可以追溯到1902年Haberlandt的研究和1905年Goebel等人的研究,此后的50余年时间内,科学家的关注点更多的集中于被子植物组织培养上,对苔藓植物的组织培养几无涉及。1957年,Allsopp利用石地钱和小叶苔的孢子进行组织培养,首次成功获得相应愈伤组织及再生叶状体。此后,世界范围内的关于苔藓植物组织培养的实验研究逐渐展开并取得了一定的成果。 1 苔藓植物组织培养供试材料及基质 目前,可以用于苔藓植物组织培养的材料主要是苔藓植物的配子体、孢子体和原丝体,此外还可以利用其生殖器官、芽孢、游离原生质体等。1960年,Ward 以Knudson培养基培养金发藓和波叶仙鹤藓的孢子并获得其无菌原丝体,并在添加了蔗糖的基本培养基中利用该无菌原丝体诱导获得了相应的愈伤组织及再生植株。2003年,高永超等利用牛角藓配子体茎段诱导获得相应愈伤组织,并探讨了蔗糖及大量元素对愈伤组织细胞生长的影响。2007年,于传梅利用膨叶唇藓苔和溪苔的叶状体、柳叶藓的茎段、短叶藓和江岸立碗藓的孢子进行组织培养,获得了相应的愈伤组织或再生植株。 2 苔藓植物组织培养供试材料的消毒 可用于苔藓植物外植体消毒的试剂包括乙醇、次氯酸钠、升汞等,不同的供试材料和不同部位的外植体所用消毒剂有所不同。Saboljevic等研究表明,适用于Aloina aloides孢子和配子体消毒的次氯酸钠浓度分别为120.00g·L-1和90.00g·L-1。于传梅(2007)研究表明,适用于膨叶唇藓苔和溪苔的叶状体消毒的试剂为0.1%次氯酸钠,消毒时间为5分钟。梁书峰(2010)研究表明,适用

苹果全生育期主要病虫害绿色防控集成技术

苹果全生育期主要病虫害绿色防控集成技术 关键词苹果绿色防控药剂组合免疫诱抗害虫诱杀技术集成陕西省苹果面积和产量均居全国第一,但苹果树腐烂病、早期落叶病、蚜虫、叶螨、金纹细蛾等病虫害成为制约苹果优质、高产的最大限制因素。为优化集成苹果树病虫害绿色防控技术体系,掌握与病虫害发生规律相结合的药剂使用关键技术,2011—2013年,笔者以作物为主线,针对苹果全生育期病虫害主要发生种类,以病虫基数控制技术为基础,重点示范苹果全生育期不同阶段主要防控对象的适宜农药品种组合,配套害虫诱杀技术、植物免疫激活产品和高效施药器械的应用,突破苹果树绿色防控技术的关键环节。通过在陕西省苹果主产区的示范实践,取得了显著效果,实现了“集成技术、规范体系、减量增效、确保安全”的目标。 1 技术集成原则 1.1 技术配套 在坚持系统调查的基础上,针对主要病虫防治对象,重点实施药剂组合技术,把握施药适期;同时组装、配套、集成农业栽培、害虫诱杀、免疫诱抗等技术措施,以作物为主线形成技术体系。 1.2 减量增效 综合考虑苹果全生育期主要防控对象发生规律和药剂使用特点,制订农药品种组合方案,提高用药对症性。同时,选用高效施药器械,科学把握喷液量,减少农药用量,提高利用率,增强农药效能。 1.3 提质降本 通过免疫诱导产品与农药的配合使用,提高苹果树免疫力,增强抗性,改善树势及果品品质,降低农药用量,提高商品率,增加产出效益。 1.4 确保安全 优先使用生物农药和高效低毒、环境友好型化学农药,严格遵循农药合理使用准则的各项指标要求,控制农药残留量,确保果品质量安全。 2 苹果全生育期主要防控对象及防控集成技术 2.1萌芽至开花前 此期主要病虫害有新发的苹果树腐烂病病斑、越冬的各种病虫,如芽鳞中越冬的苹果白粉病病菌、山楂叶螨雌成螨、苹果全爪螨卵、卷叶蛾幼虫、蚜虫卵、介壳虫等。要预防早春倒春寒,保花保果。树上喷雾选用治疗性杀菌剂+触杀性、渗透性强的杀虫剂+免疫诱导剂药剂品种组合,降低病虫害发生基数。依据田间调查情况选用三唑类杀菌剂,如43%戊唑醇悬浮剂、50%烯唑醇水分散粒剂、40%腈菌唑水分散粒剂等,杀虫剂可用40%毒死蜱乳油、1.8%阿维菌素乳油等,杀虫剂、杀菌剂各选用1种,按照各自推荐用量,不增不减,配制好药液。苹果叶螨发生重的果园,加入螨卵和成螨兼杀的杀螨剂,最后加入免疫诱导剂5%氨基寡糖素水剂800~1000倍液(要先用水稀释10倍以上再使用),混合均匀后全树细致喷雾。 (1)刮治苹果树腐烂病病斑检查全园,刮治漏防的苹果树腐烂病病斑。刮除时把病部的坏死组织及相连的5 mm左右健皮组织仔细刮净,深达木质部,连绿切成立茬、梭形。

抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则

抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则 一、概述 病毒感染是危及人类健康和生命的疾病之一,目前已有很多抗病毒药物上市应用,但仍不能完全满足临床治疗的需求。近年来国内外相关制药企业不断投入大量资金研发抗病毒药物,抗病毒药 物的注册申请也逐渐受到各方面的关注。 根据试验数据撰写的非临床和临床病毒学研究报告是审评抗病毒药物的临床试验申请和上市申请的重要资料。本指导原则旨在 帮助研发抗病毒药物或生物制品(例如:治疗性蛋白和单克隆抗体)的申请人初步了解哪些非临床和临床病毒学研究数据对于抗病毒药物或生物制品申报临床试验或申请上市是最关键的。 本指导原则主要关注非临床和临床病毒学研究报告,同时对需要收集和提交的耐药性研究数据提出了建议。讨论的主要问题包括: ●明确作用机制 ●确定所研究药物特定的抗病毒活性 ●评价所研究药物与其他可能合用的抗病毒药之间发生相互作用的可能性 ●提供病毒对所研究药物产生耐药性的研究数据 ●提供所研究药物与已上市的其他相同作用靶点抗病毒药物的交叉耐药性的研究数据 二、背景

近年来,国内外在抗HIV-1药物的研究方面积累了大量的经验, 也取得了很多进展。因此,本指导原则以抗HIV-1药物为范例,介绍 抗病毒药物病毒学研究的一般原则。尽管不同病毒的检测方法和模型系统有较大的差异,但本指导原则的许多抗HIV药物研发的原则 适用于治疗其他病毒感染(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱 疹病毒、带状疱疹病毒、流感病毒、鼻病毒、巨细胞病毒及人乳头瘤 病毒等国内常见病毒)的抗病毒药物的研发。病毒学领域研究发展 日新月异,所以,当积累了新的资料或出现相关需求时,我们将对 本指导原则进行修订。 三、非临床病毒学研究 非临床病毒学研究有助于在进行人体试验前评价药物的有效性 和安全性。建议申请人进行药物的作用机制、药物在模型系统中的 特定抗病毒活性的研究,并提供对药物产生耐药的病毒学数据。此外,临床上常将一种药物与其他已上市的治疗相同适应症的药物联 合使用,因此,最好通过体外试验研究两种或两种以上药物联合用 药的抗病毒活性,以便发现所研究药物与其他抗病毒药物之间可能 存在的相互作用(如拮抗、协同、增强、叠加等),尤其应关注负面的 相互作用。 由于已上市的抗病毒药物很多,交叉耐药(病毒对一种药物耐 药后,对同类的其他药物也产生了耐药性)可能会成为临床应用中 的一个主要问题。因此,在抗病毒药物的研发过程中,下列信息显

植物组织培养新技术与应用的研究进展及发展趋势

植物组织培养新技术与应用的研究进展及发展趋势 发表时间:2012-09-04T08:13:38.717Z 来源:《时代报告》2012年第6期作者:白立伟 [导读] 传统的组织培养光源灯普遍存在寿命短、发热量大且不均以及发光效率不理想等缺点。 白立伟(西南大学园艺园林学院,重庆北碚 400715) 中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1003-2738(2012)06-0322-01 摘要:植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的原理而发展起来的一门生物技术。本文简要概述了植物组织培养的概念及研究进展,较全面的综述了植物组织培养新技术以及在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面的研究现状,最后展望了植物组织培养的发展趋势。 关键词:组织培养;新技术;应用现状;发展趋势 引言 植物组织培养是20世纪之初,以植物细胞全能性为理论基础发展起来的一门新兴技术,是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的环境里培养成完整的植株,也称离体培养或植物克隆。自1902年德国科学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性理论, 到1934 年美国White 等用番茄根进行离体培养证实这一观点以来,植物离体培养技术在基础理论和应用研究,已广泛应用到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一[1]。近年来,随着科学技术的不断发展,植物组织培养新方法和新技术不断涌现,研究重点也由器官、细胞水平向分子、基因方向转移。21世纪,生物技术是最有生命力的一门学科,而植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段,被认为具有巨大的潜力。 一、植物组织培养新技术的研究 随着科学技术的发展和对植物组织培养技术的不断深入研究,一些新的培养方法和技术不断出现,为植物组织培养技术的不断优化和发展提供了新的途径。 1.新型光源的应用。 光是植物生长发育必不可少的重要因素之一,光照长短、光质、光周期对植物的生长、形态建成、光合作用、新陈代谢以及基因表达均有调控作用。传统的组织培养光源灯普遍存在寿命短、发热量大且不均以及发光效率不理想等缺点。LED作为植物组织培养光源早在1991年就有栽培试验。研究发现, 光质比例和光照强度可调的LED 光源比通常植物组织培养使用的荧光灯更能有效地促进试管苗的光合作用和生长发育。蒋要卫利用LED作为大花蕙兰组培苗光源的研究发现, LED光源可以显著改善大花惠兰试管苗的生长状况和提高其品质[2]。日本的田中道男等运用阴极荧光灯( CCFL)作为文心兰试管苗光源, 结果表明其地上部干、鲜重和试管苗的高度都有显著提高。另外田中道男等利用SILHOS作为生菜组织培养光源, 获得了高质量的组织培养苗。目前LED是组织培养中最有效的人工照明光源,而CCFL等新型光源是未来发展的主要方向。 2.开放组织培养技术。 传统的植物组织培养属于严格的封闭式培养,因而造成灭菌成本偏高、培养基易污染、外界环境调控难度大等缺点。而开放组织培养新技术是在外加抗菌剂的条件下,使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境,在自然开放的有菌环境中进行,恰好弥补了这些不足。赵青华等采用开放式组培技术,在培养基中添加抑菌剂,克服了非灭菌条件下魔芋组织培养污染问题,有效地简化了实验步骤,降低了生产成本[3]。何松林的研究表明在添加抗菌剂的开放式组培中,文心兰试管苗可正常生长[4]。开放式组织培养突破了封闭式培养的限制,从根本上简化了组织培养环节,使将来规模化开放式组织培养成为可能。 3.光独立培养技术。 光独立培养法又称无糖培养法,是指利用CO2代替葡萄糖作为植物组织培养的碳源,人工控制组织培养苗生长所需的光、温、水、气、营养等条件,促使组织培养苗快速转变为自养型的培养方式。一方面避免了由葡萄糖引起的杂菌污染;另一方面,增强了组织培养微环境的人工调控能力。屈云慧等以虎眼万年青为对象的无糖培养研究表明万年青再生芽的生根率高, 种苗质量也优于常规培养[5]。肖玉兰、丁永前等设计的全套无糖组织培养设备培育出的苗具有抽叶多、植株健壮、节间距短、根系发达、干物重积累多、光合自养能力强等更优良的生物学性状。目前,无糖培养法还处于理论研究和应用的开始阶段,随着理论研究的不断深入及相关配套技术的不断完善,必将成为组织培养技术的一种重要手段。 4.多因子综合控制技术。 近年来,随着对植物组织培养机理的深入研究和交叉学科间的相互促进作用,多因子综合控制的环境调控设施越来越多的应用到实际生产中,大大降低了组织培养成本, 促进了组织培养苗商品化的进程。崔谨等运用CO2 监控系统对甘薯组培苗进行调控的结果表明, 在CO2监控系统方式下培养的甘薯组培苗, 具有生长迅速、光合产物积累明显、叶色深绿、根系发达等特点[6]。刘文科等设计了一种新型密闭式组培室, 并研制出一套用于该组培室的综合环境控制系统[7]。李传业等设计的一套能对组培箱内CO2 浓度、相对湿度进行调控的组织培养微环境控制系统试验结果表明, 组织培养箱内CO2摩尔分数和相对湿度达到了预期目标。 二、植物组织培养的应用研究 植物组织培养技术的应用主要理论基础有两方面。一是细胞全能性,植物修复与完善、快繁脱毒苗、育种、种子和种质资源保存、植物检疫等都是其发展和应用的成果。二是悬浮培养液,主要应用于植物次生代谢产物的提取。 1.“全能性”的应用。 植物修复与完善是模拟植物组织培养过程中器官形成和细胞增殖形成的一套全新理论,植物脱毒和离体快速繁殖是目前植物组织培养应用最多、最有效的一个方面,因其快速、无毒的特点,已经广泛应用于观赏植物、园艺作物、经济林木、无性繁殖作物,并已形成产业化、商品化。植物组织培养技术为培育优良作物品种开辟了新的途径,利用该技术,通过花药和花粉培养、胚胎培养与细胞融合、细胞无性系变异、基因工程及突变体筛选等手段,已经培育出一大批具有优良性状的植株。借助植物组织培养技术保存种子和种质资源,因其优于常规方法的特殊性越来越受到重视,已在1000多种植物种和品种上得到应用, 并取得很好的效果。 2.愈伤组织或悬浮培养液的应用。 植物次生代谢物如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物是许多医药、食品、香料、色素、农药和化工产品的

植物病原病毒

植物病原病毒 一、概述 1. 病毒定义:病毒是一组(一种或一种以上)DNA或RNA核酸分子,包围在蛋白或脂蛋白外壳内,在合适的寄主细胞借助于寄主蛋白合成体系、物质和能量完成复制,伴随核酸突变发生变异的分子寄生物。简单讲,病毒是一类由核酸和蛋白质组成的非细胞状态的分子生物。 主要特征:①结构简单的(核酸+蛋白或脂蛋白衣壳);②严格专性寄生的(依赖寄主的核酸和蛋白质合成系统);③非细胞生物(分子寄生物)。 2. 类群:根据病毒的寄主类型,习惯上将病毒划归为下列几大类群 寄生植物的称为植物病毒 寄生动物的称为动物病毒 医学病毒(人类病毒) 真菌病毒 寄生细菌的称为噬菌体(细菌病毒) 二、病毒与人类的关系 有害方面:引起人类疾病(天花、爱滋病、非典型肺炎、肝炎、流感、小儿麻痺等)。 引起畜禽疾病(狂犬病、口蹄疫、猪瘟、牛瘟、鸡瘟、鸭瘟)。 引起植物病害。 有益方面:用作基因工程的载体或元件。 有害生物控制(害虫、真菌及杂草生防)。 环境保护(利用藻类病毒消除水面藻类污染)。 花卉增色(金心黄杨、金边瑞香、杂色郁金香)。目前已研究和命名的植物病毒达1000多种,其中许多为重要的农作物病原,其所造成的损失仅次于真菌病害。 植物病毒也有利用的价值,如 TMV导致分子生物学的产生; 病毒在开发基因工程的载体、转 基因植物研究等方面,也发挥了 很大作用。 三、病毒在生物中的地位 生物:细胞生物、分子生物 细胞生物:原核生物(原核生物 界)、真核生物(动物界、植物 界、菌物界、原生生物界) 分子生物:病毒界?:真病毒、 亚病毒(类病毒、拟病毒、朊病 毒) 四、植物病毒的一般性状 (一)、植物病毒的形态 病毒粒体:病毒的基本存在形 式(形态)。 病毒粒体的形态微小,只有在放 大数万倍的电镜下才能观察到, 其度量单位通常采用纳米(nm, 1nm=10-9m)。 植物病毒粒体形态主要有:球 状、线状、杆状、弹状、双联体 状、丝线状、柔软不定形等。形 态多样性。 ◆许多植物病毒由不只一种粒 体构成。 一些球状病毒也有多种粒体组 分,但这些粒体形态相同,只是 其中所包含的核酸含量不同而 重量存在差异。 这些病毒被称为多分体病毒,必 需有多种病毒粒体组分同时侵 染寄主细胞,才能增殖并完成其 生物学功能。 (二)植物病毒的结构 植物病毒粒体主要含有核酸和 蛋白两大部分。中间为核酸芯 (RNA或DNA),外部有外壳蛋 白(CP)包被形成衣壳,少数病 毒在蛋白衣壳外面还包被一层 那囊膜,称为包膜病毒,如植物弹 状病毒。 1. 杆状或线状病毒:蛋白质亚基 螺旋状排列,中间是一个由核酸 构成的空心管子,核酸也呈螺旋 状排列,嵌入到螺旋状排列的蛋 白质亚基内端。如,TMV杆状 粒体。 TMV:2130个蛋白质亚基;130 圈;16 1/3亚基/圈,3 圈一个周期,49个亚基 /3圈;2.3nm亚基间隔/ 圈。 2. 球状病毒:蛋白质亚基镶嵌在 粒体表面,构成多面体形,内心 是病毒的核酸;球状病毒并非光 滑的球体,而是多面体(多为二 十面体),多个正三角形组合而 成。 (三)植物病毒组分及其生物学 功能 植物病毒的主要成份是核酸和 蛋白质,有些还含有少量的金属 离子、多胺和水等。 1. 核酸 核酸是病毒遗传信息的载体,植 物病毒粒体中的核酸主要是其 基因组,有些含mRNA。一套基 因组含有病毒侵染、复制、运转、 传播等生命活动所需的全部基 因,决定病毒的增殖、生物学特 性及致病性等。 植物病毒基因组所包含的基因 数目从一个(卫星病毒)至十二 个(植物呼肠孤病毒),一般为 4~7个基因,分子量从0.4×106d 到15.5×106d,通常具有外壳蛋 白基因、复制酶基因及运动蛋白 基因等。大部分植物病毒基因组 能编码4~7种蛋白质。 (1)植物病毒的核酸类型 植物病毒的基因组多数为核糖 核酸(RNA),少数为脱氧核糖 核酸(DNA)。 根据核酸性质及功能,可将植物 病毒基因组分为下列5种类型:

【CN110074113A】大球盖菇多糖的应用、植物免疫诱抗剂及应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910348772.7 (22)申请日 2019.04.28 (71)申请人 杭州市农业科学研究院 地址 310024 浙江省杭州市西湖区转塘街 道洙泗路261号 (72)发明人 肖文斐 阮松林 忻雅 裘劼人  柴伟国 陈佳滢  (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 沈金龙 (51)Int.Cl. A01N 43/16(2006.01) A01P 21/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12P 19/04(2006.01) (54)发明名称 大球盖菇多糖的应用、植物免疫诱抗剂及应 用 (57)摘要 本发明公开了一种大球盖菇多糖的新应用、 以大球盖菇多糖为有效成分的植物免疫诱抗剂 及应用。(1)本发明通过株高、干重、叶龄、叶绿素 含量、根系活力、等指标有效证明了大球盖菇多 糖能促进水稻生长、提高秧苗素质。(2)本发明的 植物免疫诱抗剂可增加每穗粒数和结实率, 从而实现水稻增产。(3)本发明的植物免疫诱抗剂对 于水稻纹枯病和穗腐病的防治效果好,且在处理 浓度下对水稻安全。权利要求书1页 说明书7页CN 110074113 A 2019.08.02 C N 110074113 A

权 利 要 求 书1/1页CN 110074113 A 1.大球盖菇多糖在促进水稻幼苗生长或提高水稻秧苗素质中的应用。 2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤: (1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀; (2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解; (3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液; (4)将多糖提取液去蛋白,再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。 3.一种植物免疫诱抗剂,其特征在于,有效成分为大球盖菇多糖。 4.如权利要求3所述的植物免疫诱抗剂,其特征在于,包括质量浓度为100~150ppm的大球盖菇多糖,质量浓度为0.001~0.02%的表面活性剂,质量浓度为0.0006~0.002%的防腐剂。 5.如权利要求4所述的植物免疫诱抗剂,其特征在于,所述表面活性剂为Tween-20,所述防腐剂为山梨酸钾。 6.如权利要求3~5任一所述的植物免疫诱抗剂,其特征在于,所述大球盖菇多糖的制备方法包括以下步骤: (1)将大球盖菇子实体磨粉后加水混合均匀; (2)加入木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶进行酶解; (3)酶解产物去除固体物质获得多糖提取液; (4)将多糖提取液去蛋白,再用乙醇沉淀多糖获得大球盖菇多糖。 7.如权利要求3~5任一所述的植物免疫诱抗剂在通过增加水稻每穗粒数和结实率从而增加水稻产量中的应用。 8.如权利要求3~5任一所述的植物免疫诱抗剂在防治水稻纹枯病或穗腐病中的应用。 9.一种水稻幼苗的培养方法,其特征在于,包括:将水稻种子放入含有大球盖菇多糖的水溶液中进行浸渍,取出后,清洗干净,再进行种子催芽,得到水稻幼苗。 10.如权利要求9所述水稻幼苗的培养方法,其特征在于,所述大球盖菇多糖的浓度为100~150ppm;浸渍的时间为20~30h,温度为25~30℃。 2

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