全日制分生作业(3)生物分子的分离纯化与PCR技术

王秀颖 121007002 口腔学院

生物分子的分离纯化

聚合酶链反应

一、名解

生物大分子：主要包括核酸、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子组成，具有比较复杂的空间结构，而且结构与生物活性密切相关。

酚抽提法：本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。

凝胶过滤层析：凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。

多重PCR：该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。

荧光域值：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。

荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

退火：在低温下，人工合成的两条寡聚核苷酸引物按碱基配对原则与单链目标DNA片段两侧特定部位互补结合，形成局部双链。

二、问答

1、根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？

答：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；

（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；

（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。

（5）根据配体特异性，如亲和层析。

2、什么原因易引起DNA降解，该如何解决？

答：原因：（1）材料不新鲜或反复冻融；（2）未很好抑制内源核酸酶的活性；（3）提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断；（4）外源核酸酶污染（5）反复冻融。

如何解决：（1）尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；（2）液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；（3）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量；（4）细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔（5）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌；（6）将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

3、简述PCR技术的基本原理

答：PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。

4、简述PCR实验中常见的问题及其对策。

答：（1）假阳性。对策：①PCR前后工序分室操作，试剂器材分室存放；②凡耐高温的试剂器材均高压灭菌；③Tip头、Eppendorf管等最好一次性使用；④操作人员必须戴手套进行操作；⑤试剂小量分装保存，用前先离心，防止开盖时液体溅出。

（2）非特异性产物。对策：①调换引物或降低引物用量；②TaqDNA 聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶；③可适当调节Mg2+的浓度；④提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增；⑤适当增加模板用量，减少循环次数。（3）假阴性。对策：①引物设计是否合理，有无二级结构形成，尤其是引物3’端应无发夹结构。②标本中是否有Taq酶抑制剂，Taq 酶是否失活。③反应体系中是否有较难去除的蛋白质抑制PCR系统，用蛋白酶K重新处理常可获预期结果。④反应体系中有无蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95℃以上加热10min使其灭活。

⑤循环温度是否过高。⑥检测PCR产物的方法灵敏度不够。⑦靶序列

发生突变、缺失等。

（4）引物二聚体。对策：①两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对。②引物比例太高，可增加模板用量。③退火温度过低。

④热循环次数过多。

5、简述实时荧光定量PCR定量的基本原理？

答：该技术基于荧光能量传递技术，通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，转移效率与两个发色团之间距离的6次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比，检查PCR过程的荧光信号便可知靶序列初始的浓度。