番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

V ol 132,N o 15

pp 1755-761 May ,2006

作 物 学 报

ACT A AG RONOMICA SI NICA

第32卷第5期2006年5月 755~761页

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

陆云华

1,2

 马立新

1,3

 蒋思婧

1

(1湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室,湖北武汉430062;2宜春学院生物工程系,江西宜春336000)

摘 要:根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(G enBank Z 0004411)设计引物,用PCR 的方法克隆到1个31663kb

的番茄叶绿体DNA 片段(psbD ΠtrnG ),命名为ctDNA 。该片段与G enBank 中烟草的相应片段有9617%同源性,与本文所用的烟草的相应片段有9518%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn 和终止子psb A 3′,以及甘露聚糖酶基因man 、绿荧光蛋白基因gfp 、氨基糖苷3′2腺苷酰基转移酶基因aadA 构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(2psbD 2Prrn 2RBS 2man 2RBS 2gfp 2RBS 2aadA 2psb A 3′2trnG 2)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR 、激光扫描、Western blot 、RF LP 等方法检测都证实man 、gfp 、aadA 基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。

关键词:多顺反子;番茄质体载体构建;烟草质体转化;基因枪法中图分类号:Q78

Construction of Tomato Chloroplast Multicistron Site I ntegration Expression V ector and Its T ransgenic Tobacco

LU Y un 2Hua 1,2,M A Li 2X in 1,3and J IANG S i 2Jing 1

(1Laboratory of M olecular M icrobiology and G ene Engineering ,C ollege of Life Science ,Hubei University ,Wuhan 430062,Hubei ;2Biotechnology Department of Y ichun University ,Y ichun 33600,Jiangxi ,China )

Abstract :According to the published DNA sequence (G enBank Z 0004411)of tobacco chloroplast high 2frequency hom olog ous recombination fragment ,primers were designed to am plify a 31663kb DNA fragment named ctDNA from chloroplast genome of tomato by PCR 1The fragment was not only 9617%hom ology com pared w ith the tobacco fragment reported in G enBank ,but also 9518%hom ology com pared w ith the tobacco fragment used in this paper 1The tomato chloroplast multicistron expression vector pLM 2(Fig 11)(2psbD 2Prrn 2RBS 2man 2RBS 2gfp 2RBS 2aadA 2psb A 3′2trnG 2)was constructed w ith ctDNA ,Prrn ,man ,gfp ,aadA and psb A 3′1And the tobacco leaves were bombarded w ith g olden particles coated w ith the vector pLM 21Three transgenic tobacco shoots were obtained on the screening medium 1The function of aadA gene was identified by screening medium (Fig 13),and the function of gfp gene was con firmed by laser scanner (Fig 14)1The expression of man gene was identified by W estern blot (Fig 15)1The genes man ,gfp and aadA being in the chloroplast of tobacco were con firmed by PCR (Fig 16)1And the tobacco chloroplast multicistron expression cassette integrating in tobacco chloroplast genome DNA was con firmed by RF LP (Fig 17)1The results were showed that the three genes (man ,gfp ,aadA ),which were in the tomato chloroplast multicistron expression vector pLM 2,were expressed in tobacco chloroplasts 1

K ey w ords :Multicistron ;C onstruction of T omato chloroplast expression vector ;T obacco plastid genetic trans formation ;Bombardment m icroprojectiles

高等植物的许多重要性状往往受多基因控制,如对除草剂、病、虫、害的抗性

[1]

,以及完整代谢途径的调节等

[2]

,其分子水平上的研究往往要对多个基

因同时进行操作,而目前要在植物细胞核中如此操

基金项目:国家高新技术研究发展计划(863计划)(2002AA227011)、国家“十五”科技攻关计划(2001BA70BB ,2004BA7BB )和湖北省自然

科学基金(2003ABA118)项目资助。

作者简介:陆云华(1968),男,江西丰城人,博士,副教授,主要从事植物分子生物学研究。

3

通讯作者(C orresponding author ):马立新。E 2mail :malixin9@hotmail 1com ;T el :027*********,027*********

Received (收稿日期):2005204211;Accepted (接受日期):20052092201

作还存在不少技术障碍。由于细胞核基因组难以处理多顺反子,目前要在高等植物细胞核中对多个基因进行操作,主要有2种方法。第1种是先获得多个独立的转基因系,然后经过反复的杂交育种,将多个基因导入到同一品系内;第2种是将多个基因通过几个载体进行遗传共转化,但其转化效率很低,同时核转基因还伴随各基因表达水平差异、基因沉默、位置效应等问题[3],这为多基因工程在高等植物细胞核中的实现带来很大的困难[4]。而在植物叶绿体基因组中,常常许多功能相近的基因聚合在一起,和1个启动子组成操纵子结构,为在同一启动子的调控下通过1次转化实现多个外源基因以多顺反子的形式同时在叶绿体中表达提供了可能,尤其是其精确、安全、高效的特点更有利于实现多基因共转化[528]。且表达产物在叶绿体中可完成二硫键交联、正确折叠等后转录修饰,具备生物活性。Henry Daniell2001年成功地在高等植物的叶绿体中实现了1个简单的启动子带动多个基因的表达[9210],但目前国内还未见相关报道。至于用番茄多顺反子定点质体表达载体成功实现在烟草质体中的表达,国内外均未见报道。本研究希望建立烟草、番茄、马铃薯、茄子、辣椒、甜椒等茄科的重要经济作物通用的多顺反子质体转基因技术平台,为将来利用它们表达有重要经济价值的功能蛋白,以及研究植物叶绿体的光合作用机制,改善光合能力,减少能量浪费,提高作物产量奠定基础。

1 材料与方法

111 植物材料

番茄(Lycoper sicon esculentum)樱桃红,购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所,大烟草(Nicotiana tabacum),购自中国农业科学院烟草研究所。

112 酶和试剂

各种限制性内切酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Ligation K it Ver1211、T4DNA polymerase、dCTP、dG TP购自T aK aRa公司,碱性磷酸酶(CI AP)、磷酸激酶购自GI BC O BR L公司,羊抗兔IgG2HRP、DAB等免疫学试剂购自武汉天源生物技术有限公司,魔芋精粉购自武汉东方天琪公司,其他为常规进口试剂。113 培养基

LBS(固)含LB(固)成分,另加015%魔芋粉, 0103%T rypan Blue。MD、BMGY、BM MY等培养基配制见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。分化培养基含MS+110mgΠL62BA+011mgΠL I AA+300mgΠL 壮观霉素(S pc),生根培养基含MS+0105mgΠL I AA+300mgΠL壮观霉素(S pc)。以上培养基均121℃灭菌20min。

114 质粒和菌株

大肠杆菌X L102G O LD购于Stratagene公司,克隆载体pMD182T购于T aK aRa公司,pBluescript SK(+)为本室保存,pAMG(Am p r,C olE1ori,Prrn2RBS2aadA2 RBS2man2RBS2gfp2psb A3′)为本室构建[11]。

115 番茄、烟草叶绿体DNA的提取

将番茄、烟草的种子播种于花盆中1个月左右,采用改进的高离子浓度低pH法提取番茄叶绿体DNA[12]。

116 PCR扩增

根据发表的烟草叶绿体DNA序列(G enBank Z0004411)设计合成1对引物:P1(5′2 GG TT CTTT AAATT CC G TGGG TGG TG T AG C23′)和P2 (5′2T CGGG ATTGGG C AC AG T ATG AAAG ACCTT23′),以番茄叶绿体基因组DNA为模板,95℃变性5min, 95℃变性30s,58℃退火50s,72℃延伸4min,35个循环,72℃延伸20min。

根据番茄片段的测序结果,需要在番茄片段ctDNA的基因间诱变1个Sna BⅠ酶切位点,将(Prrn2RBS2man2RBS2gfp2RBS2aadA2psb A3′)表达盒式结构插入其间,需要设计1对定点诱变引物P3(5′2 CT AT CCCT CCCCT ACG T ATT CTTTTG CCTT CC ACCC23′)

和P4(5′2GGG TGG AAGG C AAAAG AAT ACG T A GGGG2 AGGG AT AG23′),参照《分子克隆实验指南》重叠延伸产生特异位点诱变的方法[13]。

将载体pAMG改造成p G MA,根据质粒pAMG的序列设计合成3对引物扩增RBS2man2RBS2gfp、psb A3′2Prrn和RBS2aadA3个片段,并分别加上随机设计的相互匹配的多个接头:P5(5′2 TG AC CCG AGGG A GGG ATGGGGG AG TTG23′)、P6(5′2 AT AC ATTTG T AG ATGG AG CTT CG ATG T C23′)P7(5′2 T AC G CG AC AT CG AAG CT CC AT CT AC AA23′)、P8(5′2 TC AG GG CC AT AAAT CCCT CCC AT CC AA23′)和P9(5′2 TG AC TGG CT AG AGG ATTTG AAAGG C23′)、P10(5′2 AT AC TGG AAAAAT AAAT AG AAAAAG AAAT C23′)。man 2gfp基因片段扩增程序为94℃预变性5min;94℃30s,57℃30s,72℃2min,共35个循环;72℃延伸7min。psb A2prrn片段扩增程序为94℃预变性5min, 94℃30s;53℃30s,72℃315min,共进行35个循

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环;72℃延伸12min。aadA片段94℃变性5min; 94℃30s,54℃30s,72℃1min,共35个循环;72℃延伸7min。

另外还需要设计1对带Sna BⅠ扩增(Prrn2RBS2 man2RBS2gfp2RBS2aadA2psb A3′)表达盒式结构,构建载体的引物P11(5′2GTC T ACG T AC AG CT C ACT C AAA2 GG CGG T AA T23′)、P12(5′2GTC T ACG T AGGGG AAA TG TG CG CGG AA23′)扩增程序为94℃预变性5min,94℃30s,55℃30s,72℃314min;共进行35个循环。72℃延伸15min。

以上PCR的反应均在PE2400型扩增仪中进行。

117 常规的分子生物学操作

质粒的提取、DNA的酶切、去磷酸化、磷酸化、消化、连接和转化参照文献[13]的方法;DNA片段的回收参照Vitagene公司回收试剂盒说明书。

118 甘露聚糖酶抗血清的制备

酵母工程菌Pichia pastoris G S115(man)参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册,摇瓶发酵,收集第9天的酶液,用VirT is公司6L型冷冻干燥仪对酶液浓缩,当酶液浓度达200μgΠm L时,用等体积的弗氏不完全佐剂乳化,背部皮下多点注射经淋巴诱导1周左右的家兔,间隔2周用同样剂量的酶蛋白加强2次,颈动脉放血收集抗血清分装后于-85℃保存。119 烟草叶片蛋白制备

采用改进的高离子浓度低pH法[12],先分离烟草叶绿体,再参照Sameer A(1993)的方法[14],在叶绿体中加4℃预冷抽提缓冲液[100mm olΠL T ris pH 710,150mm olΠL NaCl,011%β2巯基乙醇(VΠV)]于70℃保温15min,破叶绿体,离心10min(4℃, 10000×g),取上清液。

1110 甘露聚糖酶Western blot检测

参照《基因工程实验技术方法》[14]。

1111 番茄质体载体及基因枪转化烟草

参照Bio2RadΠHe1000型基因抢的操作手册进行。大烟草(革新1号)种子经灭菌在MS固体培养基上发芽,并通过茎节繁殖得到无菌苗,选取直径3cm大小的叶片作为外植体,放在MS培养基上约2~4h,然后用Bio2RadΠHe1000型基因枪轰击叶片。金粉、DNA子弹制备及轰击过程参照Pal Maliga的方法[15216],轰击后的叶片置光照培养箱(25℃)2d,然后切成小片,放在选择分化培养基(MS+011mgΠL I AA+110mgΠL62BA+300mgΠL S pc)上培养。叶片形成愈伤组织并分化出小芽后,将其移至生根成苗培养基(MS+0105mgΠL I AA+300mgΠL S pc)再生小植株,最后移至温室盆栽。

2 结果

211 番茄叶绿体DNA片段克隆与序列分析目前G enBank中还没有番茄叶绿体高频同源重组片段的序列发表,所以利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据与番茄同科(茄科)的烟草的叶绿体高频同源重组片段的已知序列(G enBank Z0004411)设计引物P1、P2,用PCR的方法克隆到1个约31663kb的DNA片段,命名为ctDNA1。将其进行琼脂糖凝胶电泳,割胶回收该DNA片段,与载体pMD182T连接,得到的重组质粒命名为pT ctDNA1,序列测定结果经NC BI核苷酸同源性对比,结果表明这段ctDNA序列与所报道的烟草叶绿体相应片段的DNA序列(G enBank Z0004411)有9617%的同源性,G enBank中没有番茄叶绿体同源片段的序列发表,ctDNA1片段包含了psbD和trnG两个基因。经G eneT ool序列比对,该番茄片段序列与本文所用的烟草的相应片段有9518%同源性。

212 番茄叶绿体ctDNA片段的定点诱变

经G eneT ool序列分析表明,ctDNA片段2个基因间隔区没有合适的酶切位点用来插入多顺反子表达盒,因此需要定点诱变1个碱基,产生1个Sna B Ⅰ酶切位点。第1轮PCR扩增用P1和P4为引物,以pT ctDNA1为模板,克隆到1个210kb的片段,将其进行琼脂糖电泳后,割胶回收该DNA片段;第2轮PCR扩增用P3和P2为引物,以pT ctDNA1为模板,克隆到1个116kb的片段,将其进行琼脂糖电泳后,割胶回收该DNA片段;第3轮PCR扩增用P1和P2为引物,以第1轮和第2轮PCR扩增的产物为模板,克隆到1个316kb的片段,命名为ctDNA2,将其进行琼脂糖电泳,割胶回收该DNA片段,先将1部分用Sna BⅠ酶切验证后,将此片段切成210kb psbD 和116kb trnG2个小片段,验证正确后,将剩下的片段与载体pMD182T连接,连接物转化大肠杆菌X L102G O LD,得到的重组质粒命名为pT ctDNA2。213 载体pAMG上的表达盒式结构的改造用P5和P6为引物,以pC M11为模板,克隆到1个1190kb的RBS2man2RBS2g fp片段;用P7和P8为引物,以pC M11为模板,克隆到1个3167kb的psb A3′2Prrn片

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 第5期陆云华等:番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

段;用P9和P10为引物,以pA MG 为模板,克隆到1个

0185kb 的RBS 2aad A 片段;将它们进行琼脂糖电泳后,割胶回收这些D N A 片段并酶切验证。

用dG TP 保护碱基,及T 4DNA polymerase 3′25′方向的外切酶活性,处理aadA 片段,使之产生能分别与man 2gfp 片段、psb A 2prrn 片段相匹配的末端;用dG TP 保护碱基,及T 4DNA polymerase 3′25′方向的外切酶活性,处理man 2gfp 片段,使之产生能分别与aadA 片段、psb A 2prrn 片段相匹配的末端;用dCTP 保护碱基,及T 4DNA polymerase 3′25′方向的外切酶活性,处理psb A 2prrn 片段,使之产生能分别与aadA 片段、man 2gfp 片段相匹配的末端。再用磷酸激酶分别对aadA 、man 2gfp 和psb A 2prrn 三个片段进行磷酸化处理;将处理好的片段进行连接;再将连接物常规转化大肠杆菌(X L 2G old ),取150μL 培养物涂布补加了氨苄青霉素(Am p )和壮观霉素(S pc )的LBS (固)平板,37℃倒置培养16h 后,平板上出现数十个带水解圈的菌落(图1),挑单菌落接LA (液)培养基,37℃280r Πmin 震荡培养12h ,抽提质粒,酶切验证,将得到的重组质粒命名为

pMG A 。

图1

添加了氨苄青霉素和壮观霉素的LBS (固)平板上出现带水解圈的菌落

Fig 11The colonies with clear region on the screening plate

214 番茄质体多顺反子表达载体pLM2构建

用P11和P12为引物,以pMG A 为模板,克隆到1个314kb 的带,用Sna B Ⅰ酶切,溶液回收后待用。将质粒pT ctDNA2纯化后用Sna B Ⅰ酶切,胶回收线性载体,去磷酸化,溶液回收。将处理好的载体pT ctDNA2与处理好的片段(Prrn 2SD 2man 2SD 2gfp 2SD 2

aadA 2psb A 3′)连接,连接物常规转化大肠杆菌(X L 2

G old ),将得到的重组质粒命名为pLM2(如图2)。215 烟草叶绿体转化及再生植株的获得

参照Bio 2Rad ΠHe 1000型基因枪的操作手册,用基因枪将包被了番茄载体pLM2的金粉轰击烟草叶片,再将轰击过的叶片切成5mm ×5mm 大小

,放在选择分化培养基上进行分化和筛选,1周左右叶片

图2

番茄多顺反子质体表达载体pLM2的结构图

Fig 12Diagram of tom ato chloroplast multicistron expression vector pLM2

逐渐失绿变白,3周以后,开始长出少量愈伤组织并从叶片的边缘或中间分化出绿芽,从3个基因枪轰击过的烟草叶片外植体中获得了3个绿芽,而未经转化的烟草叶片则全部变白,只长出很少量的愈伤组织,无绿芽分化。将绿芽移至选择生根培养基上,3~4周后长成小植株,然后移到温室培养,取部分样品进行检测。216 对aadA 基因的功能检测如果能证明载体3顺反子表达盒Prrn 2RBS 2man 2RBS 2gfp 2RBS 2aadA 2psb A 3′中的aadA 基因在烟草中得到了表达,那么该基因前的gfp 和man 基因表达的可能性会较大。将转基因和未转基因烟草的叶片切成5mm ×5mm 大小,放在选择分化培养基上,转基因烟草叶片可以分化出愈伤组织和小苗,而未转基因烟草的叶片不能(图3)。这说明

aadA 基因已经在烟草中得到了表达。

图3筛选培养基验证基因aadA 的功能

F ig 13

I d enti fic atio n o f th e fu nctio n o f th e aadA gene o n s creening m edium

1:筛选培养基上的转基因烟草叶;2:筛选培养基上的未转基因烟草叶。

1:Picture of transgenic tobacco leaves on sscreening medium ;2:Picture of untransgenic tobacco leaves on screening medium.

217 对绿色荧光蛋白基因(gfp )的功能检测

为了证明3顺反子表达盒式结构中的基因确实得到了表达,我们用FU J IFI LMF LA 25100型激光扫描仪以473nm 波长检测再生烟草植株中gfp 基因的功能。结果转基因烟草的绿荧光明显比未转基因烟草强得

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多(图4),表明gfp 基因在烟草中可能得到了表达,且具有功能。

初步认为烟草再生植株为转基因烟草。

图4激光扫描验证基因gfp 的功能

Fig 14

Identification of the function of

the function of the gfp gene by laser scanner 1:W ild tobacco :24:T ransgenic tobacco.

218 对甘露聚糖酶基因man 的Western blot 检测

为了证明载体表达盒式结构是整合质体基因组中,且在质体中表达,本文分别抽提转基因和未转基因烟草叶绿体的蛋白质,进行Western blot 检测。结果除阴性对照外,均在预计的位置出现了条带(图5)。表明man 基因可能在烟草质体中得到了表达

图5

Western blot 验证man 基因表达的结果Fig 15

Western blot analysis of man gene expressed in the chloroplast of transgenic tob acco Lane 1:W ild tobacco ;Lane 24:man gene in the chloroplast of tobacco.M:Protein market.

219 对man 、gfp 、aadA 基因的PCR 检测

采用本文115介绍的方法,分别提取质体转基因和未转基因烟草叶绿体基因组DNA 为模板,分别以man 、gfp 、aadA 基因的引物,用PCR 的方法检测man 、gfp 、aadA 基因,其结果均为阳性,而负对照为阴性(图6)。这一结果说明man 、gfp 、aadA 基因已存在烟草质体中

图6

PCR 验证man 、aadA 、gfp 基因的结果

Fig 16Identification of genes man ,aadA and gfp by PCR

2110 RF LP 验证表达盒整合到烟草质体基因组中

为了进一步得到载体表达盒式结构整合到质体基因组中的分子证据,我们以烟草质体多顺反子表达载体pLM2为正对照,以未转基因烟草叶绿体基因组DNA 为负对照,对转基因烟草叶绿体基因组DNA 做限制性片段多态性(RF LP )分析。用G eneT ool 软件对载体pLM2序列进行分析,找出介导片段与表达盒式结构上的单一酶有2个切点的酶Sna B Ⅰ,Smal Ⅰ,Sac Ⅱ,Bgl Ⅱ,Eco R Ⅰ。将正、负对照用上述酶切,找出能将正对照切出的目标带位置,而负对照为空白的酶Sna B Ⅰ,Sac Ⅱ,Bgl Ⅱ,Eco R Ⅰ。但其中Sna B Ⅰ切出的片段正好包含载体的表达盒式

结构(Prrn 2RBS 2man 2RBS 2gfp 2RBS 2aadA 2psb A 3′),为31463kb 。因此,用Sna B Ⅰ对转基因烟草叶绿体基

因组DNA 作RF LP 分析。先将叶绿体基因组DNA 胶回收,再酶切,之后浓缩10倍,再电泳分析。结果转基因烟草叶绿体基因组DNA 切出了31463kb 的带,而负对照没有,质粒pLM2切出了31463kb 和6

1604kb (图7)。这一结果可以直接证明番茄质体

图7

RFTP 验证表达盒式结构整合到烟草质体的结果Fig 17RF LP b anding p atterns confirming the tob acco

chloroplast multicistron expression cassette integrated in tob acco chloroplast genome DNA 1~3:整合了番茄多顺反子表达盒的烟草叶绿体基因组DNA 的RF LP 图谱;

4;未转基因的烟草叶绿体基因组DNA 的RF LP 图谱;

5:质粒pLM2的酶切图谱;M DNA 分子量标记Lane 13:The tobacco chloroplast multicistron expression cassette integrated in tobacco chloroplast genome DNA ;Lane 4W ild tobacco ;

Lane 5Vector pLM2;M DNA marker.

9

57 第5期陆云华等:番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

多顺反子定点整合表达载体pLM2中的多顺反子表达盒(Prrn2RBS2man2RBS2gfp2RBS2aadA2psb A3′)已成功整合到烟草的质体中,且得到表达。因此进一步认为转基因烟草为质体转基因烟草。

3 讨论

311 番茄质体多顺反子表达载体整合至烟草质体并表达的证据

在高等植物细胞中,目前发现有DNA且能自主复制、转录、翻译的仅3个,即细胞核、线粒体、质体。番茄质体多顺反子表达载体难以在烟草细胞核、线粒体中表达,其理由如下:(1)高等植物细胞核基因组既不能处理多顺反子,也不能识别和启动原核启动子。而番茄质体多顺反子表达载体中的3个基因man、gfp、aadA和一个原核启动子Prrn、强终止子psb A3′构成一个多顺反子表达盒,因此理论上不支持该载体中的3个基因man、gfp和aadA同时在细胞核中表达。(2)番茄质体多顺反子定点表达载体同源交换的介导片段是与光合作用有关的、质体所特有的,而在细胞核与线粒体中都没有发现,因此理论上也不支持该载体在线粒体或细胞核整合。(3)番茄质体多顺反子定点表达载体应用了原核强启动子Prrn,该启动子在高等植物细胞核中不能起作用。

本实验也排除了外源基因以附加体形式或游离状态存在的可能,其理由如下:(1)作RF LP分析的烟草叶绿体基因组是经胶回收纯化的,从而排除了外源基因以附加体形式或游离状态存在的可能。

(2)如果外源基因以附加体形式或游离状态存在,那么图7中的转基因叶绿体基因组RF LP分析的结果还应该出现与质粒pLM2酶切相似的31463kb和61604kb的2条带,而实际结果却只出现了31463kb 的1条带。(3)转基因烟草叶绿体基因组DNA切出了31463kb的带,而未转基因的没有,这唯一可能的解释是多顺反子表达盒(Prrn2RBS2man2RBS2gfp2 RBS2aadA2psb A3′)已成功整合到烟草的质体中。综合图3~图7的结果完全可以证明,外源多顺反子表达盒已成功整合到烟草质体基因组中,且得到表达。

312 高频同源重组介导片段的克隆

不同的同源重组片段介导重组的能力不同,会影响到转化效率。因为对番茄叶绿体片段介导重组的能力尚未见报道,本文所采用的高频同源重组介导片段的克隆方法,为亲缘关系较近的植物叶绿体高频同源重组介导片段的克隆提供一种新思路。本实验将番茄质体多顺反子定点表达载体用基因枪法成功转化烟草质体,其转化频率达到1株Π枪,与Z ora Svab等报道[17]的单顺反子稳定转化效率1株Π枪相近。其结果说明该法的有效性。

313 将载体pAMG改造成pG MA有利于同质化将载体pAMG上的表达盒式结构(Prrn2RBS2

aadA2RBS2man2RBS2gfp2psb A3′)先改造成p G MA(Prrn2 RBS2man2RBS2gfp2RBS2aadA2psb A3′),更有利于同质化。因为aadA作为同质化的筛选标记,如果它的位置在man和gfp之前,那么,在添加了壮观霉素的

选择分化培养基上,对表达了aadA、aadA和man基因的的细胞无法筛除,不利于同质化。而将aadA 放在man和gfp之后则可以避免上述情况的发生。314 叶绿体多顺反子表达的优越性

植物的核转基因过程中,多个基因的表达需要首先将单个基因分别导入到植物细胞,然后经过费时的反复育种过程以重建多亚基蛋白或代谢途径;或者将多个基因通过几个载体共转化导入到植物核基因组。例如Y e等经过长达7年的努力,将3个参与合成β2胡萝卜素的基因转入水稻细胞核中,得到了能合成β2胡萝卜素的“黄金稻”。而本实验仅在几个月内,得到了的多顺反子质体转基因烟草植株,相比之下,在植物叶绿体中进行多顺反子表达具有很大的优越性。

315 载体的优越性

在载体的构建过程中,在man基因的两端引入

CpoⅠ和AscⅠ两个稀有酶切位点,为便于克隆外源基因,在设计PCR引物时,在正反向引物两端分别加上G T C A和CG CG A的序列,用这对引物扩增出来的产物加上dTTP保护碱基,利用T4DNA polymerase 3′25′方向的外切酶活性,在PCR产物两段产生的C

末端

5′G T C A

3′T

T3′

AG CG C5′

恰好可以和经CpoⅠ和AscⅠ双酶切切下的载体2个黏性末端互补匹配,从而可以将任何感兴趣的外源基因经相同的处理克隆到叶绿体表达载体上,是一种高通量的克隆方式,为克隆外源基因带来方便。

这些研究为今后建立烟草、番茄、马铃薯、茄子、辣椒、甜椒等茄科重要经济作物通用的多顺反子叶绿体转基因技术平台,为将来利用它们表达有重要经济价值的功能蛋白,以及研究植物叶绿体的光合

067 作 物 学 报第32卷 

作用机制,改善光合能力,减少能量的浪费,提高作物产量奠定基础。

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167

 第5期陆云华等:番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

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