作物转基因技术研究进展

作物转基因技术研究进展

周岩,薛晓锋,赵俊杰,贺杰

（河南科技学院,河南新乡453003）

摘要：综述了当前作物转基因技术的三大主流方法农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等在农作物遗传改良中的研究进展,并阐述了这些转基因技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆、苜蓿等主要农作物遗传转化现状.着重论述了作物转基因技术在抗病虫、抗逆、品质改良、雄性不育等方面对作物进行遗传改良的最新研究进展.

关键词：作物;转基因技术;研究进展

中图分类号：Q789文献标志码：A 文章编号：1008-7516（2011）05-0001-05

Advances in crop genetic engineering research

Zhou Yan,Xue Xiaofeng,Zhao Junjie,He Jie

（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China ）

Abstract:The researsh of crop genetic engineering have extensively developed and gradually become effective complement of the conventional breeding.This paper briefly reviews current progress in the development of research and applications in main crop transgenic breeding;summarizes main transgenetic techniques widely used in main crop breeding （e.g.rice,wheat,cotton,maize,soybean and alfalfa ）,such as Agrobacterium -mediated transformation,particle bombardment,pollen tube pathway.Illustrates the advanced progress in the applications of crop genetic improvement,including diseases and insects resistance,quality improvment,abiotic stresses tolerance,male sterility and some other aspects.

Key words:crop,transgenic technology,advance

自1983年第一株转基因作物诞生以来,作物转基因技术得到了迅速发展.截至目前,几乎所有的作物都开展了转基因研究,育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面.一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段.

植物转基因技术就是将具有重要利用价值的、外源的DNA 片断导入植物基因组中使之产生变异从而获得新的特异性.大量转基因作物的研究表明,作物基因工程是在基因水平上对作物的遗传物质的改造,定向地对作物遗传性状进行改造,扩展了育种范围,打破了物种间的生殖隔离障碍,丰富了基因资源,使育种具有科学性、精确性、目的性和可操作性.作物遗传转化的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体法、低能离子束法、超声波介导法、显微注射法、花粉管通道法等.在当前作物基因工程研究中,主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法,这三种转基因技术相对较为成熟.其他几种方法虽然也应用于作物转基因,但是由于技术本身的限制及其他原因,报道的转基因植株较少.本文主要论述了农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法在作物基因工程上的最新进展,综述了主要农作物在抗病虫、抗逆、改良品质、抗除草剂以及雄性不育等方面的研究现状.doi:10.3969/j.issn.1008-7516.2011.05.001

第39卷第5期

395Vol.No.河南科技学院学报Journal of Henan Institute of Science and Technology 2011年10月

2011

Oct.收稿日期：2011-08-12

基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划项目（072300430120）

作者简介：

周岩（1962-）,女,河南新乡人,博士,教授.主要从事植物基因组学及分子生物学研究.

2011年河南科技学院学报（自然科学版）

1作物遗传转化方法

1.1农杆菌介导法

农杆菌介导的遗传转化是利用根癌农杆菌上的Ti质粒,将外源DNA导入植物细胞核基因组中并进行整合表达的转化方法.其基本原理为：植物受到创伤后,细胞合成并分泌如乙酰丁香酮等类的酚类化合物,它们作为信号物质,促使农杆菌附着到受伤植物细胞表面.这些酚类化合物能诱导农杆菌的Vir 区基因活化,T-DNA复制,Vir区编码的特异蛋白与T-DNA结合形成T链蛋白复合体,跨越农杆菌、植物细胞壁进入核膜,整合至植物基因组DNA中.1983年比利时科学家Montagu等人和美国Monsanto公司

—Fraley等人分别将T-DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,获得了世界上第一株转基因植株——转基因烟草,首次证明可以通过Ti质粒来实现外源基因对植物细胞的遗传转化.农杆菌介导法以其费用低、重复性好、单拷贝数、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐,随后不同的研究者利用该方法先后获得了胡萝卜、牵牛花、番茄和油菜等双子叶植物的转基因植株.

1985年Horsch等创立叶盘法进行植物遗传转化,利用根癌农杆菌侵染烟草、番茄和矮牵牛叶片,成功获得了转基因植物.该方法简单高效,为植物进行遗传转化开创了新途径.双子叶植物是根癌农杆菌的天然寄主,该方法在双子叶植物遗传转化中得到了广泛的应用,已成为大多数植物转基因的首选方法.苏玉春等以木聚糖酶xynB基因为外源基因,利用根癌农杆菌介导法转化紫花苜蓿,获得了整合有外源基因的再生植株,且鲜叶片木聚糖酶活性为10.5U/g[1].

由于单子叶植物不是根癌农杆菌的天然寄主,体内很少或者很难产生激活Ti质粒上Vir基因的信号分子,大多数没有明显的创伤反应,不能诱导创伤区临近的细胞脱分化形成大量感受态细胞,对农杆菌感染不敏感,因而使用农杆菌转化单子叶植物很难获得成功.研究表明,乙酰丁香酮等酚类化合物可以促进农杆菌在水稻、玉米、小麦、谷子培养细胞及幼苗上吸附,从而有效地提高转化效率[2].农杆菌菌株类型、转化材料年龄及生理状态也是影响转化能否成功的关键因素.经过改良后的农杆菌介导遗传转化方法在一些重要的单子叶作物如水稻、玉米、小麦等成功获得转基因植株后,根癌农杆菌侵染单子叶的遗传转化研究迅速发展起来,并逐步获得了一部分作物转基因植株或品系.王秀红等利用该方法将新型抗草甘膦基因导入玉米优良再生材料Hi-Ⅱ中,获得了抗草甘膦转基因玉米[3].

1.2基因枪法

基因枪法又称为微弹轰击法,其原理是外源DNA包被在微小的金粒或钨粉中,以火药爆炸、高压放电或高压气体为驱动力,将附着于其表面的外源DNA分子导入受体细胞,然后通过细胞和组织培养技术再生出整合有外源DNA的新植株.最早的基因枪是由美国Cornel大学的Sanford等在1987年研制成功的.同年,Klein首次利用基因枪法转化玉米；1989年采用该方法将GUS和PAT基因导入玉米悬浮细胞系,获得了转基因玉米[4].研究发现,在转化过程中加入氯化钙和亚精胺能提高核酸与微弹的结合力,选择合适的转基因表达载体及受体组织,优化基因枪轰击参数（轰击次数、轰击时金粉用量、轰击距离、DNA浓度、氦气压力和微弹速度等）可有效提高基因枪的转化效率[5].伍成祥等利用基因枪将连有MAR 序列的bar基因导入水稻获得抗性植株[6].余桂容等研究表明,金粉用量100μg/枪,发射点与靶细胞距离60mm,可提高玉米基因枪的转化效率[7].

自基因枪法建立以来,有力地推动了作物基因工程的发展,采用该方法已成功将抗病、抗虫、抗逆、品质改良等基因导入作物基因组中.基因枪法对一些难以再生的作物更实用,幼胚、花粉细胞、茎尖分生组织等均可作为受体材料.基因枪法以其受体来源广泛,方法简单等优点,成为迄今为止单子叶作物转基因的主要方法,且转化的方法也相对比较成熟.然而基因枪法仍存在一些不足,如易形成嵌合体,多基因拷贝的整合,易出现共抑制和基因沉默现象,而且基因枪法所用的仪器设备昂贵,也限制其广泛应用.

1.3花粉管通道法

上世纪70年代,周光宇等结合我国远缘杂交的成功经验,提出了DNA片段杂交假说,为建立花粉管

周岩等:作物转基因技术研究进展第5期

通道法奠定了重要的理论基础.而后周光宇等从分子水平上加以验证,模拟授粉杂交设计出花粉管通道

转基因技术,成功地将外源海岛棉DNA导入陆地棉,培育出抗枯萎病的栽培品种,正式创立花粉管通道

法.该方法是在植物授粉后,将含有目的外源基因的DNA溶液注射或涂抹到子房,利用植物开花,受精形

成的花粉管通道,将外源的DNA导入到受精的卵细胞中,最终整合到植物基因组中,伴随着受精卵的发

育而形成转基因新个体.尽管花粉管通道法获得的转基因植株,在性状方面的确发生了明显的变异,但由

于缺乏确切的分子生物学证据,致使国内外一些学者对其可靠性提出了质疑.龚蓁蓁等利用同位素示踪

法表明通过3′H-DNA标记的棉花总DNA经珠孔进入开放的珠心到达胚后,30s~8h之间取样放射自

显影观察,80%以上的胚囊2~4h均有外源DNA进入.在进入胚囊的途径中,自显斑点主要集中在珠心

—即花粉管通道,在花粉管通道以外的珠心组织无标记显示,表明授粉后形成的花粉管通道是孔道内——

外源DNA进入胚囊的唯一途径[8].1988年Luo和Wu首次利用花粉管通道法将含报告基因的质粒DNA 转入水稻,经Southern杂交和酶学测定证明,得到了外源基因整合并表达的转基因水稻植株[9],从而使花粉管通道法得到分子水平验证.自此,外源DNA导入技术的研究工作在多种植物中陆续开展起来,已在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆等作物育种中得到了成功应用,培育了许多具有抗病虫、抗逆及其他优良性状的作物新品种或新品系.董春林等采用改进的花粉管通道法,将海藻糖合酶基因（TPS）导入玉米自交系郑58中,获得了抗旱性高于对照的转化植株[10].

花粉管通道法最突出的优点是不依赖组织培养人工再生植株,技术简单,不需要装备精良的实验室,

常规育种工作者易于掌握等.然而由于受到转化时间、转化时温度和湿度、转化载体的DNA浓度及受体

植株花粉发育状态的影响,目前该方法的转化效率仍然较低.外源DNA片段与受体染色体组交换和重

组的随机性决定了转基因后代变异性状也有很大的随机性和多向性.外源DNA导入引起变异的种

类多、范围广、幅度大,使得对后代的筛选变得很复杂.

2主要作物基因工程的研究现状

2.1转基因水稻

水稻是世界的主要粮食作物之一,世界上有二分之一以上的人口以稻米为主食.自1988年获得第一

批转基因水稻以来,研究者利用转基因技术对传统的水稻进行改良,成功地获得了许多具有高产、抗性、

营养乃至药用价值的转基因水稻.1991年Christou等利用基因枪法轰击水稻幼胚,获得转基因籼稻和粳

稻植株,并发现转化性状能传递到子代并符合孟德尔遗传分离规律,同时利用分子生物学杂交证实了外

源基因已稳定整合到子代植株中[11].Ignacimuthu等利用农杆菌介导法将来源于菜豆种子的淀粉酶阻抑基因导入Basmati水稻中,获得了174株潮霉素抗性植株且呈GUS阳性反应,PCR和Southern bolts杂交证实淀粉酶阻抑基因已整合至水稻中,Western印记杂交证明相关蛋白已表达.除抗除草剂、改良品质基因外,抗病虫、抗逆基因、高产以及与C

光合作用相关的PEPC基因等都已应用于水稻的遗传转化[12].

4

2.2转基因小麦

1992年Vasil利用长期培养的胚性愈伤组织为外植体,通过基因枪法将Gus/Bar基因导入小麦品种“pavn”,获得对除草剂Basra具有抗性的再生植株（T0）及其后一代（T1）,从而获得了世界上第一株转基因小麦[13].基因枪转基因技术的诞生,为小麦基因工程遗传改良提供了新途径.迄今为止,基因枪法仍是国际上小麦转基因的主要方法.然而,其他转基因技术在小麦遗传转化中也发挥着重要作用,并取得了一系列成果.刘香利等利用花粉管通道法将高分子量麦谷蛋白14亚基基因整合到不含该亚基的小麦品种[14]. Daniel等利用根癌农杆菌介导法将GBSSI（限制性淀粉粒合成酶）基因导入小麦幼胚中,Southern bolts杂交分析确定了外源基因已整合至小麦基因组中[15].

2.3转基因棉花

自1987年Umbeck等首次报道利用农杆菌介导法将NPTII基因和CAT基因导入陆地棉品种珂字

312、310以来,棉花基因工程研究快速发展[16].中国农科院生物技术研究中心郭三堆等利用花粉管通道法,将构建的植物表达载体pGBI121S4ABC（携带高效双价杀虫基因CryIA和CpTI）导入石远321、中棉

2011年河南科技学院学报（自然科学版）

所19号等黄淮海棉区主栽的棉花品种中,首次获得了双价转基因抗虫棉株系[17].目前,棉花基因工程研究主要集中在抗病害、抗除草剂方面.王振怡等利用基因枪轰击陆地棉“邯208”的成熟种子胚尖,将抗黄萎病相关基因GhDAHPS转化到棉花中,获得了抗性植株[18].郭彩菊等利用农杆菌介导的方法,将含有根特异性表达启动子的植酸酶基因（PhyA）转入棉花的胚性愈伤中,PCR检测证明PhyA已整合到棉花基因组中[19].

2.4转基因玉米

自1989年Klein[4]首次获得转基因玉米以来,玉米的遗传转化取得突破性进展,目前已建立了一套比较完整的理论和技术体系.玉米基因工程在抗病虫害、抗除草剂、改良品质等方面研究十分广泛. Schnepf等首次成功地克隆了一个编码为Bt的杀虫晶体蛋白基因,它在植物体内能合成毒素蛋白,害虫吃过毒素蛋白后就会死亡,该基因成功地开启了利用基因工程培育抗虫植物的序幕[20].Koziel等利用基因枪法将Cry1b基因转入玉米幼胚,培育出抗虫转基因玉米[21].关淑艳等利用农杆菌介导法,将淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表达载体转入玉米自交系H99和丹598胚性愈伤组织,PCR检测初步证明外源基因已整合至玉米基因组中[22].

2.5其他转基因作物

大豆、苜蓿等作物基因工程研究与上述四大作物同步,目前已培育出了数千份具有各类特殊性状的作物转基因新材料.1988年Hinchee首次利用农杆菌介导法获得转基因大豆[23].自此,大豆遗传转化的外源基因覆盖了抗虫、抗除草剂及品质改良等方面,且在优化组织再生条件、提高遗传转化效率、去除选择标记等方面获得了突破性的进展.叶美等以“荷豆12”成熟种子胚尖为外植体,利用基因枪法进行遗传转化,基因枪转化后的胚尖组织和转基因植株后代的叶片中均观察到GUS基因的表达；PCR证明外源GUS基因插入到转基因后代的基因组中[24].张立全等利用花粉管通道法将盐生植物红树总DNA导入紫花苜蓿阿尔冈金,获得了在225mmol/L NaCl胁迫条件下具有高耐盐性的植株[25].

3结语

作物基因工程研究开展近三十年来,已取得了可喜成绩.全世界分离出的目的基因已达100多个,获得的转基因植物达200多种.玉米、大豆、棉花、油菜转基因作物等均已在田间释放并在全球大面积种植.2010年全球转基因作物种植面积14800万hm2.作物基因工程育种为获得新种质资源以及具优良农艺性状的品系提供了合理有效的新途径.然而作物转基因技术还普遍存在着作物遗传转化体系不稳定、转化效率低、外源基因表达量低或不表达、实验重复性差等问题.因此,今后的发展方向仍然是围绕着提高转化效率,克服基因表达后沉默等问题.我们相信随着基因工程的进一步发展,尤其是转化方法、转化机理、转化策略等不断完善,转基因技术将在作物遗传改良中发挥越来越重要的作用.

参考文献：

[1]苏玉春,陈光,白晶,等.农杆菌介导的xynB基因转化苜蓿的初步研究[J].中国草地学报,2010,32（4）：113-116.

[2]李宝健,欧阳学智,许耀.应用农杆菌Ti质粒系统将外源基因转入籼稻细胞研究[J].中国科学：B辑,1990（2）：144-149.

[3]王秀红,史向远,白建荣,等.抗草甘膦基因的玉米转化及后代遗传分析[J].华北农学报,2011,26（1）：117-121.

[4]Klein T M,Kornstei N L,Sanford J C,et al.Genetic transformation of maize cells by particle bombardment[J].Plant Physiology,

1989,91：440-444.

[5]Hagio T.Optimising the particle bombardment method for efficient genetic transformation[J].Japan Agricultural Research Quarterly,

1998,32（4）：239-247.

[6]伍成祥,宛煜嵩,徐俊,等.基因枪转化M AR序列介导的水稻bar基因的表达分析[J].农业生物技术学报,2002,10（3）：

227-230.

[7]余桂容,杜文平,宋军,等.基因枪介导抗除草剂基因2mG2-epsps转化玉米的初步研究[J].分子植物育种,2010,8（5）：

885-890.

[8]龚蓁蓁,沈慰芬,周光宇,等.授粉后外源DNA导入植株技术3′H-DNA通过花粉管通道进入胚囊[J].中国科学：B辑,1988

周岩等:作物转基因技术研究进展第5期

（6）：611-614.

[9]Luo Z X,Wu R.A simple method for the transformation of rice via the pollen tube pathway[J].Plant M olecular Biology Reporter,

1988,6（3）：165-174.

[10]董春林,张明义,林忠平,等.用花粉管通道法将抗旱耐盐基因导入玉米自交系的研究[J].山西农业科学,2011,39（5）：

392-394.

[11]Christou P,Ford T,Kofron M.Production of transgenic rice（Oryza Sativa L.）plants from agronomically important indica and

japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos[J].Nature Biotechnology,1991,9：957-962.

[12]Ignacimuthu S,Arockiasamy S.Agrobacterium-mediated transformation of an elite indica rice for insect resistance[J].Current

Science,2006,90（6）：829-835.

[13]Vasil V,Castillo A M,Frommm M E,et al.Herbicide resistant fertile transgenic wheat plant obtained by micro-projectile

bombardment of regenerable embryogenic callus[J].Nature Biotechnology,1992,10：667-674.

[14]刘香利,刘缙,郭蔼光,等.小麦高分子量麦谷蛋白14亚基基因的花粉管通道法转化[J].西北农林科技大学学报：自然科

学版,2008,36（1）：121-124,130.

[15]Shaw D J,Gray J C.Visualisation of stromules in transgenic wheat expressing a plastid-targeted yellow fluorescent protein[J].

Planta,2011,233（5）：961-970.

[16]Umbeck P,Johnson G,Barton K,et al.Genetically transformed cotton（Gossypium hirsutum L.）plants[J].Nature Biotechnology,

1987,5：263-266.

[17]郭三堆,崔洪志,夏兰芹,等.双价抗虫转基因棉花研究[J].中国农业科学,1999,32（3）：1-7.

[18]王振怡,吴立柱,王省芬,等.基因枪介导棉花成熟种子胚尖的遗传转化[J].河北农业大学：自然科学版,2010,33（3）：1-4.

[19]郭彩菊,王省芬,张桂寅,等.农杆菌介导的植酸酶基因转化棉花的研究[J].中国农学通报,2009,25（20）：68-71.

[20]Koziel M G,Beland G L,Bowman C,et al.Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein

derived from Bacillus thuringiensis[J].Nature Biotechnology,1993,11：194-200.

[21]Schnepf H E,Whiteley H R.Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli[J].

Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,1981,78：2893-2897.

[22]关淑艳,赵丽娜,刘慧婧,等.农杆菌介导的sbe2a基因RNAi载体对玉米遗传转化的研究[J].作物杂志,2011（2）：36-40.

[23]Hinchee M A W,Connor-ward D V,Newell C A,et al.Production of transgenic soybean plant using Agrobacterium-mediated

gene transfer[J].Nature Biotechnology,1988,6：915-922.

[24]叶美,张敏,杨素欣,等.大豆成熟种子胚尖基因枪法转化体系的优化[J].大豆科学,2011,30（1）：20-23.

[25]张立全,牛一丁,郝金凤,等.通过花粉管通道法导入红树总DNA获得耐盐紫花苜蓿T0代植株及其RAPD验证[J].草业

学报,2011,20（3）：292-297.

（责任编辑：邓天福）