基因芯片技术研究现状

基因芯片技术研究现状

王　璐

(北京市崇文区疾病预防控制中心　100050)

摘　要　基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。它可用于DNA测序、基因表达图谱的分析及突变检测等很多方面,具有广阔的潜在应用价值,在未来的生命科学领域中必将发挥重要的作用。

关键词　基因芯片

人类基因组计划是人类为了认识自己而进行的一项最伟大和最具影响的研究计划。随着人类基因组计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展,越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定,基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多的基因在生命过程中所负担的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此,建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效快速的检测、分析就显得格外重要。基因芯片技术就是顺应这一发展要求的产物,它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。

1　基因芯片技术的基本原理

所谓基因芯片就是按特定的排列方式固定大量基因探针/基因片段的硅片、玻片、塑料片[1,3]。探针DNA是指被有序地点样固定在玻片或硅晶片上的DNA片段,这些片段可通过PCR反应扩增细菌质粒上插入的基因组片段或用通过引物从cDNA文库种PCR扩增得到。这些大小和序列不同的片段分别经过纯化后,被高密度有序地点样固定在玻片或硅晶片上从而制备成DNA微阵列,用于检测待测样品中是否有与之互补的序列。待测样品中的mRNA被提取后,通过反转录反应过程获得标记荧光的cDNA,与包含上千个基因的DNA微阵列进行杂交反应,将玻片上未互补结合反映的片段洗去,再对玻片进行激光共聚焦扫描,测定微阵列上各点的荧光强度,推算出待测样品中各种基因的表达水平。若要比较不同的两个细胞系或不同组织来源的细胞中基因表达的差异,则从不同的两个细胞系或不同的组织来源中提取mRNA。反转录反应过程中标记上不同颜色的荧光,等量混合后,与包含上千个基因的DNA微阵列进行杂交反应,对玻片进行激光共聚焦扫描。比较两种荧光在各点阵上的强度,推算出各基因在不同细胞系中的相对表达水平。2　基因芯片的种类

2.1　根据支持介质划分　制备芯片的固相介质有玻片、硅片、聚丙烯酸胺凝胶、尼龙膜等。在选择固相介质时,应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、介质对化学修饰作用的反应,介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。目前较为常用的支持介质是玻片。

2.2　根据制备方法划分　芯片制备的方法主要是原位合成和直接点样。原位合成适用于寡核苷酸;直接点样法多用于大片段DNA,有时也用于寡核苷酸,甚至mRNA。原位合成有两种途径,一是光刻法;一是喷印法[6]。

2.2.1　原位光刻合成　光刻法主要是利用半导体技术,在合成碱基单体的5,-羟基末端连接上一个光敏保护基,利用光照射使羟基脱保护进行DNA 的合成,在生长的链上加上一个碱基,这个过程反复进行直至合成完毕,该方法可在成千上万个位点同时进行合成。

2.2.2　原位喷印合成　芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似,不过芯片喷印头和墨盒有多个,墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致,因此不需要特殊制备的化学试剂[6]。

2.2.3　点样法　点样法是与微阵列的表面直接接触,利用由微点样针、毛细管或镊子组成的打印头将准备好的样品从样品槽中转移到固相的表面,一个三维移动装置直接控制寡核苷酸、cDNA和其他生物分子微阵列的制备。

3　样品的准备及杂交检测

3.1　基因芯片的制备　在制备基因芯片时要考虑阵列的密度、再生性、操作的简便性、成本的高低等

几方面的因素。原位光刻合成与原位喷印合成法、直接点样法相比,最大的优点是它可以合成密度极高的阵列;但它的缺点是耗时、操作复杂,而且为保证在不同位点加上不同的单体,从而在不同的位点合成不同的探针,需要不断更换不同的蔽光膜[7]。直接点样法虽然芯片上探针的密度相对较低,每个样品都要预合成、纯化,在芯片制备前还需妥善保存合成的探针,但是它的最大优点是操作简便。

3.2　样品的获得与标记　由于目前的检测体系还不能检测出未扩增的标记样品,所以待测样品DNA 在杂交前一般都要进行聚合酶链反映(PCR),在扩增的过程中,对靶DNA进行标记。目前DNA样品的扩增一般是通过液相反映来完成。

样品的标记主要是荧光标记。荧光标记基本分为2种,一种是使用荧光标记的引物,一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。目前常使用的荧光物质有:荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根据扩增产物分离的方法不同,标记的方法也不同:进行单引物标记的,其扩增产物通常由聚丙烯酸胺凝胶电泳分离;对一个引物用生物素标记,另一个引物用荧光素标记的,一般用亲合素偶联得磁珠捕捉其扩增产物,通过变性处理使荧光标记的产物解链[10]。此外,也有用生物素残基标记引物,将生物素标记的扩增产物与芯片杂交,洗涤后加入亲合素连接的荧光物,通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号,然后利用荧光监测系统对荧光信号进行检测。

3.3　杂交反应　杂交反应是一个复杂的过程,受很多因素的影响,而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性,这些影响因素包括:(1)寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱,而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。

(2)支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时,杂交信号显著增强。(3)杂交序列长度的影响。一般来说,短的杂交序列更容易区分碱基的错配,但复合物的稳定性要差一些;长杂交序列形成的复合物稳定,而区分碱基错配能力要差一些[10]。(4)GC含量的影响。GC含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。(5)探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片,提高了寡核苷酸的浓度,在胶内进行的杂交更像在液相中进行的杂交反应,这些因素提高了对错配碱基的分辨率,同时也提高了芯片检测的灵敏度。(6)核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时,单链核酸越长,则样品进入凝胶单元的时间越长,也就越容易形成链内二级结构从而影响其与芯片上探针的杂交,因而样品制备过程中,对核酸的片段化处理,不仅可提高杂交信号的强度,还可提高杂交速度[12]。

3.4　信号检测　生物芯片的2个关键技术是芯片的制备与结果检测,目前荧光检测主要有2种:激光共聚焦荧光显微扫描和CCD荧光显微照相检测。前者检测灵敏度、分辨率均较高,但扫描时间长;后者扫描时间短,但灵敏度和分辨率不如前者。虽然荧光检测在芯片技术中得到了广泛的应用,但是荧光标记的靶DNA只要结合到芯片上就会产生荧光信号,而目前的检测系统还不能区分来自某一位点的荧光信号是有正常配对产生的,因而目前的荧光监测系统还有待于进一步完善与发展。有研究者正试图绕过荧光标记,建立新的检测系统,以提高杂交信号检测的灵敏度[5]。

4　基因芯片的应用

4.1　DNA测序[13～16]　人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展。芯片技术中杂交测序技术及邻堆杂交技术即是一种新的高效快速测序方法。该方法可用于含重复序列及较长序列的DNA序列测定及不用基因组同源区域的序列比较。

4.2　研究基因差异表达　人类基因组可在一张芯片上、一次杂交反应中观察到其在目的细胞的实际表达状态,包括表达与否,表达丰度,而且两种相关细胞的实验可在同一张片子上同时做出来,便于最小实验误差情况下比较二者细微差异。这样将具体的分子信息与细胞的生理特征改变联系起来,极有可能以前所未有的速度提示生命活动过程的精细机制,并成批地进行功能克隆新基因或将“孤儿基因”与确定的生物学功能联系起来;另一方面为临床诊断、预后评价提供全新的标准模式,为新药的设计提示靶分子而且提供快速廉价的分析手段[17]。

4.3　寻找新基因[18～19]　定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗等方面是很有价值的。实验提示在缺乏任何序列信息的条件下,微阵列可用于基因发现和基因表达检测,这将大大地加速人类基因组的功能分析。

4.4　基因组文库作图　比如从20个啤酒酵母的基因组克隆里制备Cosmid DNA,用限制性内切酶Ear I切割,PCR扩增,荧光标记变性产生单链

DNA,于256点的芯片杂交,将荧光强度标准化,相邻克隆对的相关值由统计分析确定,最后根据模拟退火过程中相关分数,将10个产生最强信号的克隆连续依次排列。估计一个操作者一天能完成几百个克隆的作图。这项技术显示了以高度并行方式进行克隆作图进行大规模测序的乐观前景[17]。

4.5　突变体和多态性的检测[20～26]　SHB技术可大规模地检测和分析DNA的变异及多态性。这种方法可快速、定量地获得基因信息,快速、准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变异。

4.6　其它　特殊设计的基因芯片还可用于筛选、疾病诊断、基因扫描等领域,如Livache[27]等人研制了在硅装置上的多聚吡咯DNA芯片,用于血清样品中丙型肝炎病毒的基因分性,结果显示了良好的敏感性和高度的二维分辨能力。特定染色体文库基因片段制备的DNA芯片还可用于疾病相关基因的快速扫描,以高效率地发现新的疾病相关基因。此外,利用芯片技术,可寻找能与mRNA杂交的寡核苷酸,为选择有效反义寡核苷酸提供了一个简单的经验型方法[29]。

5　基因芯片技术的研究方向及当前面临的困难[2]尽管基因芯片技术已取得了长足的发展,但仍然存在着许多难以解决的问题,主要表现在以下几个方面:

样品制备上,当前多数公司在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高监测的灵敏度,但仍有不少人在尝试绕过该问题,这包括Mosa2 ic Technologies公司的固相PCR扩增体系以及Lynx Therapeutics公司提出大量并行固相克隆方法,两种方法各有优缺点,但目前尚未取得实际应用。

探针的合成与固定比较复杂,特别是对于制作高密度的探针阵列。使用光导聚合技术每步产率不高,难于保证好的聚合效果。应运而生的其它很多方法,虽然技术难度较低方法也比较灵活,但存在的问题是难以形成高密度的探针阵列,所以只能在较小规模上使用。最近我国学者已成功地将分子印章技术应用探针的原位合成而且取得了比较满意的结果。

目标分子的标记也是一个重要的限速步骤,如何简化或绕过这一步现在仍然是个问题。目标分子与探针的杂交会出现一些问题:首先,由于杂交位于固相表面,所以有一定程度的空间阻碍作用,有必要设法减少这种不利因素的影响。其次,探针分子的GC含量、长度以及浓度等都会对杂交产生一定的影响,因此需要分别进行分析和研究。

信号的获取与分析上,当前多数方法使用荧光法进行检测和分析,重复性较好,但灵敏度仍然不高。正在发展的方法有多种,如质谱法、化学发光等。基因芯片上成千上万的寡核苷酸探针由于序列本身有一定程度的重叠因而产生了大量的丰余信息。要对如此大量的信息进行解读,目前仍是一个艰巨的技术问题。

6　基因芯片的产业化现状及我国的研究现状现代科学的一个特点是基础研究、技术科学和成果商品化的密切结合,生物技术界也是这样,每一项新技术新方法的背后都有一些公司做强有力的支撑,使得该技术日臻完善,真正为科学家所用。生物芯片的发展也是这样,在美国尤其是加州已涌现出二十多个这方面的企业。

基因芯片对于分子细胞生物学及其相关产业的影响大概只有分子克隆技术、单克隆抗体技术、PCR 技术可以与之比肩。而且可以看出,由于生物芯片等新一代生物学研究技术的使用,生物学实验本身大大自动化、灵敏化和快速化,对研究人员来说已变得如此简单和便捷,而数据的积累迅速汇聚成海洋,今后的创造性工作将集中在计算机数据处理分析、建模和预测上[6]。

目前,我国尚未有较成型的基因芯片问世,但据悉已有几家单位组织人力物力从事该技术的研制工作,并且取得了一些可喜的进展。这标志着我国相关学科与技术正在走向成熟。基因芯片技术是一个巨大的产业方向,我们国家的生命科学、计算机科学乃至精密机械科学的工作者应该也可以在该领域内占有一席之地。但是我们应该充分地认识到,这不是一件轻易的事,应该是有组织、有计划地集中具有一定研究实力的单位和个人进行攻关,这也许更适合我国国情[2]。

7　基因芯片的应用前景

基因芯片技术因其可再一次反应中进行多种信息的平行分析而受到众多研究者的瞩目,特别是基因芯片在人类基因组计划的研究工作中的作用,不仅极大地促进了该项工作的进行,也使芯片技术在短短的几年间得到了长足的发展,并迅速在杂交测序以外的领域得到广泛的应用,但该技术成本高,芯片的制备比较复杂,样品的准备与标记较为繁琐,且其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高,这些问题使得该技术的普及与进一步推广存在一定的难

度。目前国外正在致力于这些问题的解决与研究,国内也有研究者正在积极地开展该项研究工作。我们有理由相信,随着该技术的不断完善与发展,在将来,基因芯片会作为一种简便快捷的技术,为我们的研究工作与临床检测带来极大的便利。

参　考　文　献

1　Ramsay R Nature Biotechnology1998,16:40～44

2　冯永强,阎小君,苏成芝.基因芯片技术.国外医学.分子生物学分册,2000:22(1)

3　Marshall A and Hodgson J.Nature Biotechnology,1998,16:2731 4　Duggan DJ,Bittner M,Chen,Y,et al.Nat G enet,1999,21(1 Suppl):10～14

5　刘彦华,仝文斌,吴小意,陶其敏,生物芯片技术及其应用前景.中华检验医学杂志;2000:23(3)

6　王升启,基因芯片技术及应用研究进展.生物工程进展;1999,19

(4)

7　BIanchard AP,K aiser J R,Hood L E,et al.High-density oligonu2 cleotide arrays.BiosensBioelectfon,1996,11:687～690

8　Marshall A,Hodgson J.DNA chips:an array of possibilities.Nat Biotechnol,1998,16:27～31

9　Y ershov G,Barsky V,Belgovskiy A,et al.DNA analysis and di2 agnostics on oligonucleotidemicrochips.Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:4913～4918

10Guo Z,GuilfOyle RA,Thiel A J,et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms byhybridization with oligonucleotide arrays on glass supports.Nuci Acids Res,1994,22:5456～5465

11Livache T,Fouque B,Roget A,et al.Polypyrrole DNA chip on a silicon device:example of hepatitis Cvirus genotyping.Anal Biochem,1998,255:188～19412Drobyshev A,Mologina N,Shik V et al.Sequence analysis by hy2 bridization with oligonucleotidemicrochipfidentification ofβ-tha2 lassemia mutations.G ene,1997,188:45～52

13Parinov S,Barsky V,Y ershov G,et a1.Nucleic Acids Res,1996,24

(15):2998～3004

14Wallraff,G.,Labadie,J.,Brock,P,et al.Chemtech1997,22～32 15Southern EM.TIG,1996,12(3):110～115

16Dubiley S,K irillov E,Lysov Y,et al.Nucleic Acids Res,1997,25

(12):2259～2265

17周建军.生物芯片.国外医学.分子生物学分册,2000,22(1)

18Schena,M.,Shalon,D.,Davis,R.W,et al.Science1995,270:467～470

19Shaion,D.,Smith,J.S.,Brown,P.O.G enome Res1996,6:639～645

20Guo Z,Gullfoyle FA,Thiel AJ,et al Nucleic Acids Res,1994,22

(24):5456～5465

21G inot,F.Human Mutation1997,10:1～10

22K ozal M.J.,Shah,N.,Shen,N.et al.Nthee Medicine1996,2:753～9

23Drobyshev A,Mologina N,Shik V,et al.G ene,1997,188:45～52 24Guo Z,Guilfoyle FA,Thiel AJ,et al.Nucleic Acids Res,1994,22

(24):5456～5465

25Lipshutz RJ,Morris D,Chee M,et al.BioFeatue,1995,19(3):442～447

26Hacia J G,Brody LC,Chee MS,et al.Nature genetics,1996,14(4) :441～447

27Livachc T,Fouque B,Roget A,et al.Anal ytical Biochemistry1998, 255:188～194

28Hodgson J Nat Biotechnology1998,16:725～727

29Milner N,Mir KU,Southern EM,Nat Biotechnol.1997,15:537～541

?实验研究?

功夫对印鼠客蚤杀灭效果试验研究

蔡文凤　吴鹤松　冯星明　王国良　董兴齐　马永康　宋志忠

(云南省地方病防治所大理671000)

摘　要　目的:观察杀虫剂功夫对印鼠客蚤实验室的杀灭效果。方法:用瓶膜法。结果:(1)半数致死浓度LC50:0.00167514%(0.00180113%～0.00155798%);(2)随着药物浓度的逐渐增加,KT50呈现有规律的缩短,24小时死亡率也逐渐增高:(3)当药物浓度为0.005%、0.01%时,KT50在7分钟以内,16分钟内击倒率均大于80.0%, 24小时死亡率均大于55.0%;(4)残效:0.0025%、0.005%、0.01%三种浓度150天内残效实验30分钟内的击倒率均为100.0%,24小时死亡率均大于64.0%:结论:功夫2.5%乳油对印鼠客蚤杀灭效果较好,具有高效、速杀、残效较好、对人畜安全等优点,可用于大面积灭蚤。

关键词　功夫　印鼠客蚤　灭效