阿霉素诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡及其机制

细胞凋亡实验报告

实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：

乙型肝炎与原发性肝癌的关系

慢性乙型病毒性肝炎与原发性肝癌的关系 原发性肝癌为肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿,为我国常见的恶性肿瘤之一。病因有黄曲霉菌,酒精性、病毒性肝炎等,其中最常见为病毒性肝炎,尤为乙型病毒(HBV)感染与肝癌的关系密切，HBV感染是原发性肝癌的首要病因。国外资料表明,原发性肝癌的发生与HBV 在染色体上的整合及整合后染色体的重排有关[1]。HBV在染色体上的整合是随机的,整合于染色体上的HBV - DNA是不完整的,病毒基因组多有一定程度的缺失。HBV - DNA整合后引起肝癌的机制目前尚无定论。HBV - DNA整合后通过激活癌基因或导致抑癌基因失活而引起细胞癌变,通过整合基因片段研究封闭HBV X或Pre - s基因对阻断HBV后肝癌发生尤为重要[2]。 1 ItBV感染与HCC发生的流行病学研究 几项流行病学研究表明，在全球范围内，除了极少例外。慢性HBV感染区与HCC发生区有极大的相似之处[1I ，在低HBV感染的区域HCC的发病率也比较低[3]。还有另外一个证据支持HBV感染与HCC发生之间有密切的关系。那就是80％HCC患者都伴有HBV 的感染，无论这些患者是否生活在高HBV感染的地区，在他们的血液中检测到了HBsAg 和抗一HBc阳性。此现象说明HBV感染与HCC发生之间存在密切的关系[4]。病毒性肝炎是一种世界性的传染性疾病。我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区．大约有60％左右的人群感染过HBV．其中10％的人群为HBV表面抗原(HBsAg)携带者(达1．2亿)，l 200万为慢性肝炎患者。每年有80～100万人患急性肝炎；更为重要的是我国每年有30万人死于与乙肝有关的肝癌及肝硬化[5]。我国肝细胞癌患者的HBV感染指标阳性率很高．近年来呈上升趋势，在我国有70％～90％的PHC病人HBsAg（+），其中约1／3可以PCR 白血清中检出HBV—DNA，提示仍有低水平病毒复制。乙型肝炎病毒与原发性肝癌的相关性可表现在如下几个方面：①原发性肝癌与HBsAg携带者的发生率相平衡；②原发性肝癌患者血液中常有HBV感染抗原抗体之一种和数种，其中以HBsAg与抗一HBc双阳性最为常见．近年发现抗一Hbe阳性亦多见；③原发性肝癌的家族聚集现象亦见于HBV感染聚集的家庭；④HBsAg阳性的原发性肝癌，其癌旁组织的细胞内亦可检出HBsAg；⑤组织培养的人肝癌细胞可分泌HBsAg和AFP；⑥肝癌患者的癌细胞内有HBV—DNA整合。目前，诊断乙型肝炎最常用的指标是HBV血清标志物(俗称“两对半”)，其组合模式多种多样，各项指标不同阳性与HBV复制及疾病不同阶段有关[6]。本文研究资料显示原发性肝癌患者的乙肝病毒标志物阳性率高达98．6％，表明本地区原发性肝癌患者的发生与乙肝病毒感染密切相关，与近期文献报道相似，近年有研究证明感染乙肝病毒的危险度是对照组的1 1．61倍，这说明乙肝病毒感染是肝癌发生的主要危险因素，HBV是部分双链的DNA 病毒，含有S、c、P、x。肝细胞癌患者AFP升高与HBV感染关系密切[7]。肝细胞癌标本进行免疫组化测定,结果显示肝癌细胞中,存在HBsAg、AFP,两者都主要存在于细胞浆中,提示AFP产生与HBV感染直接相关。提示AFP产生与HBV复制无直接关系,可能与HBV - DNA整合有关[8] , HBV - DNA与肝细胞DNA的整合可引起肝细胞遗传特性异常,推测肝细胞遗传特性的改变可能会引起AFP调控基因的改变,在其他因素如肝细胞炎症、坏死等影响下,带有AFP调控基因改变的肝细胞再生,AFP合成再次活跃,从而合成大量AFP。慢性乙型肝炎发生HBeAg 自发血清学转换的确切机制目前仍不清楚, 乙型肝炎病毒前C 区变异可发生在HBeAg 自发血清学转换之前、之中或之后, 但前C 区的变异不是HBeAg 自发血清学转换的必须条件[2]。在乙型肝炎病毒慢性感染的自然病程中, 3岁以前较少出现HBeAg 自发血清学转换, 每年仅有2% ; 3 岁以后, 这种自发转换率逐渐增加到每年

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

病毒感染与靶细胞凋亡

病毒感染与靶细胞凋亡 【摘要】病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的关系,细胞凋亡在维护机体正常功能中发挥着重要作用,宿主细胞的凋亡,导致被感染细胞的死亡和病毒的清除;病毒为了生存与扩散而抑制凋亡。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中有许多基因和蛋白得到表达,并参与作用。另外，细胞因子和免疫细胞也直接或间接地参与了该过程。对细胞凋亡与病毒感染关系的进一步研究,为病毒感染性疾病的预防和诊治提供新的思路和手段。 【关键词】细胞凋亡病毒感染 细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是一种生理性细胞死亡。细胞凋亡既可自发产生,也可由特殊介导物在一定条件下诱导产生。 病毒（virus）是一种非细胞型的微生物,个体微小,结构简单,由蛋白质与核酸组成,缺乏产生能量的酶系统,只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖,为 严格细胞内寄生。病毒侵入机体并在易感细胞内复制增殖,与机体发生相互作用的过程称为病毒感染。病毒感染细胞后,宿主细胞对病毒感染表现出不同的反应:（1）细胞无明显变化；（2）因病毒的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE ）,引起细胞损伤、死亡；（3）引起细胞增生,继而使细胞死亡或使细胞继续生长失去生长控制,转化为癌细胞。

越来越多的资料表明,病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系。一方面,病毒感染诱导细胞凋亡。另一方面,病毒感染抑制细胞凋亡。本文就近年来有关病毒感染诱导和抑制细胞凋亡的研究进展做一简述。 1 病毒感染诱导细胞凋亡 病毒感染细胞的凋亡,大多数由病毒编码的蛋白产物直接诱导,其次是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫反应间接诱导。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡，主要有以下几种方式。 1.1 病毒蛋白直接诱导病毒进入机体细胞后,表达一些蛋白将会引起细胞凋亡过程。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquire immune deficiency syndrome,AIDS）病因。当HIV侵入人体后,能选择性地侵犯CD4分子的细胞,CD4分子是HIV包膜蛋白gp120的受体,结合后可激活钙通道,使CD4+细胞胞内Ca2+浓度增高,导致CD4+细胞凋亡。最终引起以CD4分子细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷,从而导致机会性感染和肿瘤。再如VBV的HBx蛋白、EB病病毒的gp350、HPV病毒的E2和E7蛋白［1，2］。 1.2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）间接诱导病毒感染机体后,刺激免疫系统,

细胞凋亡的信号通路

山东农业大学学报(自然科学版),2015,46(4):514-518VOL.46N0.42015 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2015.04.007 细胞凋亡的信号通路 谢昆,李兴权 红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661199 摘要:细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，与自噬和坏死有明显的区别。细胞凋亡的信号途径比较复杂，在凋亡诱导因子的刺激下经历不同的信号途径。本文就细胞凋亡的三条信号通路——线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径做一综述，以便为人们进一步了解细胞凋亡发生的机制，从而对癌症及其他一些相关疾病的治疗奠定基础。关键词:细胞凋亡;信号通路;线粒体途径;内质网途径;死亡受体途径 中图法分类号:R329.2+8文献标识码:A文章编号:1000-2324(2015)04-0514-05 The Signal Pathway of Apoptosis XIE Kun,LI Xing-quan Department of Life Science and Technology/Honghe University,Mengzi661199,China Abstract:Apoptosis is a process of programmed cell death which distinguishes from autophagy and necrosis.The signal pathways of apoptosis are complex and different under apoptosis induced factor stimulating.Three kinds of signal pathways of apoptosis including Mitochondrial pathway,Endoplasmic Reticulum pathway and Death Receptor pathway were summarized in this review in order to make people further comprehend the mechanism of apoptosis，so that it should make a basis for us all to treat cancer and other related diseases. Keywords:Apoptosis;signal pathway;Mitochondrial pathway;Endoplasmic Reticulum pathway;Death Receptor pathway 细胞凋亡是细胞程序性死亡（Program cell death，PCD）中特有的一种细胞死亡方式，是细胞在一系列内源性基因调控下发生的自然或生理性死亡过程。Kerr等1972年最早提出了凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）的概念[1]，随后Paweletz等对其进行了详细的描述[2,3]。在形态学上，凋亡表现为核浓缩、细胞质密度增高、染色质凝聚、核膜破裂、核内DNA断裂、细胞集聚成团、形成凋亡小体(Apoptosome)等特征，这些凋亡小体最终被巨噬细胞清除，但不会引起周围细胞的炎症反应，另外，凋亡发生在单个细胞之间[4,5]。坏死，通常是由相邻的多个细胞之间发生细胞肿胀，细胞核溶解，细胞膜破裂，细胞质流入到细胞间质中，并伴发一系列的炎症反应，从而与凋亡表现为本质性区别[6,7]。 目前认为，凋亡发生的途径分为三种。第一种是线粒体途径，也称为内源性途径，该途径包括两类，第一类需要通过激活Caspase通路促进凋亡，在一序列凋亡诱导因素刺激下，线粒体中的Cyt C（细胞色素C）释放至细胞质中，从而与Apaf-1(Apoptosis protease activating factor1，凋亡蛋白酶活化因子1)结合形成多聚体，形成的多聚体再进一步与凋亡起始分子Caspase-9结合形成凋亡小体，凋亡小体激活Caspase-9，从而激活下游的凋亡执行分子Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7等诱导细胞凋亡的级联反应；第二类是不依赖于Caspase途径的，通过线粒体释放AIF（Apoptosis induce factor，凋亡诱导因子）直接诱导凋亡的发生。但是在细胞内，直接检测AIF比较困难，而且AIF的变化不一定能代表凋亡发生的程度，因为引起凋亡发生的途径不一。第二种是死亡受体途径（也称为外源性途径），经由死亡受体（如TNF，Fas等）与FADD的结合而激活Caspase-8和caspase-10，进一步激活凋亡执行者caspase-3,6,7，从而促进凋亡的发生；第三条途径是内质网途径，内质网应激（蛋白质错误折叠或未折叠、内质网胁迫）会导致细胞内钙超载或钙离子稳态失衡一方面激活caspase-12，caspase-12进一步激活caspase-9而促进凋亡的发生，另一方面诱导Bcl-2(B细胞淋巴瘤蛋白)家族中促凋亡蛋白Bax和Bak的激活诱导凋亡[8]。 1凋亡的线粒体途径 在哺乳动物中，由于凋亡的激活需要线粒体中细胞色素C（CytC）的释放，因此CytC由线粒体膜间隙释放到细胞质中的多少可以作为判断凋亡发生强弱的指标之一。有研究认为，CytC的释放是通过Bcl-2家族调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），科学 收稿日期:2013-03-07修回日期:2014-09-11 基金项目:云南省科技厅应用基础研究面上项目(2010ZC151) 作者简介:谢昆(1975-),男,云南富民人,博士研究生,研究方向为动物生物化学与分子生物学.E-mail:xk_biology2@https://www.360docs.net/doc/f46549996.html, 数字优先出版:2015-06-03https://www.360docs.net/doc/f46549996.html,

肝癌与肝硬化的关系

肝癌与肝硬化的关系 肝癌伴发肝硬化据各地的报告从60-80%不等，差别悬殊，其原因有二： (1)各作者所收集的肝癌类型不尽相同，有些作者将肝细胞肝癌和胆管细胞癌放在一起进行统计，我们知道胆管细胞癌很少伴发肝硬锡故将两者混在一起进行统计，必将降低全组的肝硬化伴发率，如单纯以肝细胞肝澎来进行统计可发现各地肝硬化的伴发率都较接近，多在80%以上； (2)各作者采用的肝硬化诊断标准不一，也是造成统计数字差异的另一因素。在各类肝硬化中以大结节性肝硬化(包括坏死后性肝硬化、肝炎肝硬化或混合性肝硬化)最常伴发肝癌，约占40-60%，而小结节性肝硬化较少，仅占10%左右。在肝癌的高、低发区中常见的肝硬化类型有显著的差别，如东南亚地区以大结节性肝硬化为多见，而欧美地区以小结节性肝硬化为多。日本Shikata和北美Gall对肝硬化的统计具有一定的代表性见下表。 鉴于大结节性肝硬化具有更大的癌变危险性，因而非洲和东南亚地区肝细胞肝癌的发病率较欧美为高是有其病理基础的。

大结节性肝硬化与病毒性肝炎的关系较为密切。据国内某肝癌高发区的调查发现68例肝癌中有77.9%件发肝炎肝硬化，其中98.2%同时有典型的慢性活动性肝炎病变，血清HBAg检出率达64%，至于癌周肝细胞内HBsAg阳性率在我们的56例肝癌中达74.1%，这些结果反映肝癌常伴发的肝硬化与乙型肝炎有密切的关系，其中不少是直接从慢性活动性肝炎发展而来的。Blumberg对84例肝硬化病例进行随访，发现其中有些发展为肝癌，其发生率与HBsAg有关，84例肝硬化中有24例为HBsAg阳性，其中6例(2800)发展成肝癌，而抗-HBs阳性的17例中无一例演变为肝癌，HBsAg和抗-HBs两者都是阳性的14例中仅1例发生癌变。 以上随访结果表明HBAg阳性的肝炎后肝硬化容易发展为肝癌，在肝硬化形成的过程中肝细胞反复遭受损害，发生增 生和间变，显然为肝癌的发生提供了基础。 除了肝硬化之外，不少作者均注意到肝癌也常伴发肝纤维化，Shikata等报告17例肝癌伴有肝纤维化，其中10例呈阳性地衣红染色，显然不少肝纤维化是从乙型肝炎发展而来，在这些病例中肝癌与肝炎的关系除了偶然巧合外，也可 考虑是同一病因所致的两种不同的病变。

细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有

细胞凋亡信号转导途径及调控的研究进展

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究 进展 学科：基础兽医学 专业：药理毒理学 姓名：ma cai hui 学号：13203023

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究进展 摘要目的：为了研究抗肿瘤药物促使细胞凋亡的作用机理，探讨细胞凋亡的信号转导途径以及相关基因对其的调控。方法：查阅近年的国内外相关文献，归纳整理细胞凋亡的信号转导途径和相关的调控基因。结果：介绍了细胞凋亡存在三条主要通路：线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路，各通路间互相联系，共同调节细胞凋亡。以及调控凋亡的主要基因，Bcl-2、p53、c-myc、P16、Rb。结论：研究抗肿瘤药物的作用机理应从以上三条凋亡途径和相关调控基因出发。 关键词细胞凋亡；信号转导途径；基因调控；caspase Progress study on signal transmission pathways and regulation of cell apoptosis Wang Saiqi School of Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou, 450001 Key words : cell apoptosis; signal transmission pathways; gene regulation; caspase Abstract Aim : To check the mechanism of apoptosis induced by anticarcinogen and research the cell apoptosis signal transmission pathways and related genes on its regulation. Methods: Signal transmission pathways and related genes were concluded by referring to related papers at home and abroad in recent years. Results: Three main signal transmission pathways, death receptor-mediated pathways, mitochondrial pathway, endoplasmic reticulum pathway and several main regulator genes,Bcl-2,p53, c-myc,P16,Rb were introduced. Conclusions: Research on the mechanism of anticarcinogen should start from the said signal transmission pathways and genes. 1 细胞凋亡概述 细胞凋亡，又名细胞程序性死亡，是诱导性的细胞自杀过程，它使生物体可以有序地清除受损伤或无用的细胞。自从1927年John Kerr第一次提出凋亡这一概念后，人们发现它在多细胞生物的基本生命活动中起着十分重要的作用。它对于

乙肝与肝癌的关系

乙肝与肝癌的关系 文章目录 乙肝与肝癌的关系 1、乙肝与肝癌的关系 肝癌(原发性肝癌)是我国常见的癌症,据普查资料证明,肝癌年死亡率仅次于胃癌和肺癌,居第三位。而肝脏是人体多种重要物质的代谢中心,同时肝脏还有解毒、分泌、排泄等重要功能,一旦肝脏出现癌肿,对人体的健康危害极大。 临床上注意到肝癌患者有急性肝炎—慢性肝炎—肝硬化—肝癌的病史,可见肝炎与肝癌关系极为密切。国内对肝癌的研究中还注意到:肝癌高发区人群中肝炎比例高,肝癌患者中乙型肝炎表面抗原(HbsAg)阳性者显着高于HbsAg阴性者。慢性肝炎还可不经过肝硬变阶段直接导致肝癌的发生。

2、乙肝怎么检查 ALT及胆红素 反复或持续升高,AST常可升高,部分患者r-谷氨酰转肽酶、精氨酸琥珀酸裂解酶(ASAL)、碱性磷酸酶也升高。胆碱酯酶及胆固醇明显减低时提示肝功严重损害。靛青绿留滞试验及餐后2小时血清胆汁酸测定可较灵敏地反映肝脏病变。 中、重度慢性肝炎 患者清蛋白(A)降低,球蛋白(G)增高,A/G比值倒置,γ球蛋白和IgG亦升高。凝血酶原的半寿期短,可及时反应肝损

害的严重程度,凝血因子V、Ⅶ减少。部分患者可出现自身抗体,如抗核抗体、抗平滑肌抗体,抗线粒体抗体,类风湿因子及狼疮细胞等阳性。 3、乙肝的用药原则 用药不宜过多过杂很多药物经过肝脏解毒,用药过多过杂增加肝脏负担,对肝病不利。 根据慢性乙肝病人的具体情况,针对性用药乙型肝炎病毒复制明显的病人用抗病毒药物;有免疫功能紊乱的用调整免疫功能的药物;有肝细胞损伤的用保护肝细胞的药物;有

肝脏微循环障碍的用活跃微循环的药物。中医在我国历史悠久,其精髓在于辩证论治。通过辩证论治,可改善慢性乙肝病人的临床症状,提高他们的体质,增强抗病能力,促进免疫系统清除病毒,促进疾病恢复。 乙肝如何预防 1、阻断血液传播:了解传染途径后,预防传染就要阻断传染途径。像血液传播,平时生活中就要注意下,如果身体部位流血了,要及时处理。尤其是患有乙肝的朋友们更要注意这点,莫要让自己的血液成为了传染源,从而增加亲朋好友感染病毒的概率。 2、阻断母婴传播:母婴传播这种传播途径是比较广的,但也是可以阻断的。患有乙肝的女性朋友们,在怀孕前要咨询医生,医生或根据你的情况给你制定方案,比如什么时候怀孕最好、什么时候打乙肝免疫球蛋白、孩子出生后多久打乙肝疫苗等等。 3、阻断“性”传播:如果夫妻一方有乙肝的话,那么在过“性”生活的时候就要注意最好防护措施,戴避孕套。

细胞凋亡实验步骤及注意事 项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。

(完整word版)细胞凋亡过程

细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。

常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂

表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂 诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂 激素地塞米松T细胞 细胞因子IL—2 胸腺细胞 TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞 IL—10 髓样白血病细胞 IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞 抗IgD抗体B细胞 抗HLA—II抗体静止B细胞 超抗原SPE CD4+T细胞 胞内信号分子调节 剂 放线菌酮T细胞 PKC激活剂胸腺细胞 其他DNA拓扑异构酶抑制 剂 白血病细胞放射线淋巴样细胞 抑制剂 细胞因子IL—2 T H1细胞 IL—4 T H2细胞 IL—10 B、T细胞 IFN—ΥT细胞 IL—4 B细胞 黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞 VLA—4、VCAM—1 B细胞 胞内信号分子调节 剂 PKC激活剂T、B细胞 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。

1．形态学变化： 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： 1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。 上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 2．细胞凋亡的生化改变： 1）胞内Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。 2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。 3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法： 1．形态学方法 借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2．电泳法 对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。

肝炎和酗酒是诱发肝癌的主要因素

肝炎和酗酒是诱发肝癌的主要因素 安普先生 据世界卫生组织统计，在世界范围内肝癌死亡率列第五位。我国普查每十万人口中有15~46人罹患肝癌。在我国，原发性肝癌更为常见，每年新发患者40万人以上，死亡人数超过37万。“原发性肝癌恶性程度如此之高，但大多数患者在就诊时已处于中晚期，丧失了最佳治疗时机，因此对于肝癌的预防和早期检查就显得相当重要。” 两千多年前，我国的《黄帝内经》就提出“上医治未病，中医治欲病，下医治已病”，而对于肝癌三级预防中的一级预防就是预防各种肝癌易感因素。肿瘤专家认为：“虽然肝癌的病因尚未完全清楚，但已经证实与肝炎病毒感染、长期大量饮酒、环境以及饮食因素密切相关。”因此，肝癌的预防就要从规避这些高危因素做起。 1控制乙肝病毒感染 流行病结果显示，乙肝感染率高的地区也是肝癌高发地区，如东南沿海地区，其中乙肝病毒与肝癌关系更为密切。人感染乙肝病毒之后，病毒在体内复制、活跃，对肝脏造成损害。长期的这种损害导致肝硬化，进而引发肝癌。 预防乙肝，在某种程度上说也预防了肝癌发生；对于已感染乙肝病毒且处于慢性肝炎者，采用恰当的抗病毒治疗，可减少肝癌的发生。

2戒酒或者限量饮酒 长期酗酒也会导致肝癌。因为酒中的乙醇需要通过肝脏来完成体内代谢过程。而乙醇代谢的中间产物乙醛对肝脏细胞有直接性毒害作用。同时乙醇的代谢还会干扰脂肪代谢、激素代谢等体内多种物质的代谢过程。乙醇代谢不仅破坏肝脏细胞，造成肝脏损害；还会加重肝脏解毒和代谢的负担，导致肝细胞脂肪病变，进而发展成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化。最后发展成肝癌。 3健康饮食 长期食用霉变、含亚硝胺食物，卫生条件差等也是促发肝癌的重要因素。多种研究均表明，黄曲霉毒素是最强的化学致癌物，在诱发肝癌的能力上，它比已知的二甲基亚硝胺致癌性强约75倍。其中黄曲霉素B致癌性最强，而其中的黄曲霉毒素B1又和肝癌密切相关。 安普先生提醒大家，注重饮食健康，尤其是已霉变食物，坚决不碰。少饮酒，坚决不酗酒，浅尝辄止。按时入睡，少熬夜保持充沛的体力，平衡膳食、适当参加体育运动、定期进行身体检查，对肝癌的预防有非常积极的作用。 备注：部分资料摘自凤凰网

细胞凋亡诱导剂

细胞凋亡诱导剂 在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。 放线菌素D（Actinomycin D） 放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。Camptothecin 可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。可抑制Tat介导的HIV-1的转录。常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。Cycloheximide 是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白

质的合成，而多数原核生物则无效。在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。可诱导多种细胞的凋亡。 Dexamethasone 是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时） Etoposide 是拓普异构酶II的抑制剂。是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。Staurosporine Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激