葡萄与葡萄酒中酚类物质的测定方法

Folin-Ciocalteus法

1.1配制试剂

配制Folin—Ciocalteu试剂和20％饱和碳酸钠溶液。

Folin—Ciocalteu试剂：

100．Og钨酸钠和25．Og钼酸钠，将二者溶解于700mL蒸馏水中，倒入2000mL 圆底烧瓶中，加入50mL 85％磷酸和100mL浓盐酸，放入几粒玻璃珠，混匀，连接回流冷凝器，用文火回流lOh。用50raL水冲洗冷凝管上的附着物，边摇边加入150．Og硫酸锂和数滴溴水，开口煮沸约15rain(至溴水挥尽为止)，冷却，定容至1000mL的容量瓶中，过滤并置棕色瓶中保存备用。

20％碳酸钠溶液：

称取无水碳酸钠Csa2c03)2009溶于1000mL沸水中，混匀，冷却至室温，加数块结晶碳酸钠晶种，24h后过滤。

酚母液(0．5％)：称取O．5009五倍子酸，用蒸馏水溶解，倒入100mL容量瓶中定容。

1.2标准曲线制作(Folin．Ciocalteu法)

取6支1 00mL容量瓶，按表2—1配制0～500mg／L标准溶液；

表2．1标准溶液配制

(1)用刻度吸管分别精确吸取0mL、1．0mL、2．0mL、3．0mL、5．0mL、10．0mL 酚母液分别到100mL容量瓶中，用水定容至刻度。这些溶液可以分别表示为0mg ／L、50mg／L、100mg／L、150mg／L、250mg／L、500mg／L(以相应的没食子酸表示)。

(2)从上述不同浓度的标准溶液中分别移取1．OmL加入到100mL容量瓶中，再分别加入60mL去离子水，混合，各加入5mL Folin．Ciocalteu试剂，充分混合。

(3)在0．5"一8min内各加入15mL20％碳酸钠溶液，混合后用蒸馏水定容。

(4)将上述标准溶液在20。C下放置2h后，在765nm波长下测定吸光值。制作标准曲线，以标准溶液的吸光值为纵坐标，以相应酚浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图2．1所示，根据方程求出葡萄汁中总酚的含量。

样品测定：取lOmL葡萄汁样品稀释至100mL，再取lmL稀释的样品按上法进行测定。用测得的样品的吸光值，根据标准曲线求出样品中总酚含量。红葡萄汁需乘上稀释倍数。

Folin-Denis法

1.1样品预处理

1.2总多酚的提取

1.3测定

使用5 mL刻度吸管吸取1．0 mL滤液(若多酚含量过高，可适当稀释)或一水合没食子酸标准溶液，分别用刻度吸管加入FD显色剂及7．5％碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10 mL，混匀，室温显色(下同)，测定765 nin吸光度，根据稀释倍数和从标准曲线中查出的浓度，计算样品多酚含量

高锰酸钾滴定法

分光光度法快速测定葡萄酒中总酚的含量

1.1原理

正常发酵生产的葡萄酒中富含多酚类化合物。试样中的多酚化合物在碱性条件下，与Foline phenol试剂形成蓝色物质，在765nm处测定吸光值，并与标准曲线比较来对葡萄酒中多酚类化合物进行定量检测。

1.2仪器与试剂

（1）紫外-可见分光光度计

（2） Foline-phenol试剂：试剂公司购得

（3） 5%（w/v ）碳酸钠溶液：称取50g 无水碳酸钠（分析纯），用水溶解并定容至1000ml 。

（4）400mg/L 没食子酸标准溶液：称取0.1000g 没食子酸，用蒸馏水溶解，定容至250ml ，移入棕色瓶中，避光低温保存。

（5）40mg/L 没食子酸标准使用溶液：吸取上述溶液10ml ，再用蒸馏水定容至100ml ，现用现稀释。

1.3步骤

（1）标准曲线的制备

分别吸取0.0, 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5ml 没食子酸标准使用溶液（40mg/L ）于看比色管中（相当于含没食子酸0.0，20，40，60，80，100，120 ，140μg ），各管分别用蒸馏水补至3.5mL ，再分别加入1ml Foline-phenol 试剂，用5%（w/v ）碳酸钠溶液定容至刻度，摇匀，放置10分钟后，于765nm 处，1cm 比色皿测定吸光值，绘制标准曲线。

（2）样品的测定

先将样品稀释10倍，取适量体积V （视样品总酚含量确定）稀释液于25ml 比色管中，再分别加入1ml Foline-phenol 试剂，用5%（w/v ）碳酸钠溶液定容至刻度，摇匀，放置10分钟后，于765nm 处，1cm 比色皿测定吸光值，与标准系列比较。

（3）计算公式 N V

m X ?=

X ——样品中总酚（以没食子酸计）的含量，mg/L ；

m ——测定样品中总酚（以没食子酸计）的含量，μg ；

V ——测定样品的体积，ml ；

N ——稀释倍数。 m 可以通过A K m ?=求得，也可用回归方程计算得出。

固相萃取高效液相色谱法测定葡萄酒多酚物质

1.1模拟酒样（将乙醇和酒石酸加入到容量瓶中，然后再加入一定量的几种多酚类物质，混匀备用）

1.2仪器和试剂

仪器：岛津高效液相色谱仪，包括：泵，检测器，柱温箱，积分仪；真空抽滤器；超声波脱气机；纯水机；薄膜旋转蒸发仪，天平；固相萃取小柱

试剂：甲醇，乙腈（色谱纯）；酒石酸，乙酸，乙醚，乙酸，乙酯，甲醇，乙醇（分析纯）

1.3实验方法

1.4色谱条件

参考成宇峰等的方法，并稍加修改

色谱柱：反相柱(250*4.0mm,5um)；流速：0.8ml/min ；柱温：30℃检测波长：280nm

梯度洗脱：流动相A ：水乙酸（98:2 ）；流动相B ：乙腈

洗脱程序： 0—8min，B为18%—40% ；20—25min

1.5标准曲线制备

分别称取约0.0100g 没食子酸安息香酸儿茶素咖啡酸香草酸槲皮酮阿魏酸香豆酸标样，用色谱甲醇定容于10ml 容量瓶中，配成混合溶液，将此溶液稀释成不同浓度梯度的标准溶液，-30℃保存备用

1.6 SPE柱萃取方法

活化吸附剂：在萃取样品之前先进行活化，具体操作为，用5ml 甲醇冲洗小柱，流完后加 5ml水冲洗

上样：取 5ml待测模拟酒样装入活化后的固相萃取柱

洗涤：酒样在柱中停留一段时间，用 2 倍上样液体积的蒸馏水冲洗小柱，弃去废液

洗脱：加入 15ml乙醚将多酚类物质洗脱下来

测定：洗脱液经旋转蒸发干燥后（<40℃），色谱甲醇溶液（1:1 ）定容，经微孔滤膜过滤，HPLC 测定

1.7数据统计与分析

实验所得数据均采用数理统计软件DPS V7.55版处理，其结果以平均值表示1.8结论

实验建立了25min 内同时检测葡萄酒中多种多酚类物质的方法并通过对固相萃取柱萃取参数：洗脱溶剂洗脱溶剂用量以及葡萄酒pH 值进行选择优化，建立了一种利用 HPLC测定葡萄酒中多酚类物质时样品前处理的方法，在此方法下，利用HPLC 检测葡萄酒中几种常见的多酚类物质时，各物质间分离效果好且提取率较高

葡萄中单体酚的分析测定方法

具体步骤方法：葡萄中单体酚的提取方法取赤霞珠葡萄果实5 g研磨后溶于25 mL70%甲醇中,加入80 mg抗坏血酸(溶于15 mL纯水中),再加入10 mL6 mol 盐酸,将所有溶液置于100 mL的容量瓶中,超声波处理10 min,密闭后在35℃条件下避光提取12 h,12000×g 4℃离心20 min,将上清液在40℃条件旋转蒸发去掉甲醇,用30 mL乙酸乙酯萃取一次之后再用20 mL乙酸乙酯萃取两次,合并所有萃取液,在40℃条件旋转蒸发至干再溶于5 mL50%色谱甲醇中,经0.45μm有机滤头过滤后HPLC测定。