降解秸秆的纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件研究

第17卷第2期2009年6月纤维素科学与技术

Journal of Cellulose Science and Technology

V ol. 17 No. 2

Jun. 2009

文章编号：1004-8405(2009)02-0020-07

降解秸秆的纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件研究

武峥，张迎君，周心智

（重庆市农业科学院果树研究所，重庆江津402260）

摘要：从土壤、霉变的农产品和实验室保存的真菌中筛选到15株产纤维素酶的菌

株，其中绿色木霉T206产酶能力最强。利用液体发酵，研究了碳源、氮源、接种

量、起始pH值、培养时间等对菌株产酶的影响，以及该菌株所产纤维素酶的种类。

在最适条件下菌株培养96 h后，羧甲基纤维素酶活（CMCA）最高达到7 654.33 U，

是优化前酶活的1.7倍，滤纸酶活（FPA）达到1 675.12 U。

关键词：绿色木霉；纤维素酶；筛选；产酶条件

中图分类号：S188 文献标识码：A

纤维素是自然界中最大的可再生有机资源，我国的纤维素资源极为丰富，仅秸秆和皮壳产量每年可达7亿吨。但这些原料大部分被烧掉，不仅破坏了生态平衡，还污染了环境，而且能量利用率仅为10%左右。如果将天然纤维素降解为可利用的糖，再进一步转化为乙醇、乳酸、菌体蛋白、气体燃料等物质，将对解决现今世界所面临的资源短缺、能源危机和环境污染问题具有极其深远的意义[1]。

世界各国已纷纷开展利用纤维素的研究。酶法降解纤维素条件温和，且无污染，但纤维素酶活力低一直是阻碍大规模生产应用的瓶颈。因此，筛选酶活高的野生菌株，加强纤维素酶产生菌菌种选育、发酵工艺及降解机制的基础研究，利用高效转化木质纤维素类的微生物技术，对纤维类资源的利用具有重要意义[2-3]。不同菌株来源的纤维素酶的分子特征和催化性质都不尽相同，酶的最适反应条件也有所不同[4]。本文从土壤和霉变的农产品中筛选出15株产纤维素酶的真菌，通过液体发酵获得一株高活性绿色木霉菌株T206，并对其所产纤维素酶的种类及产酶条件进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种来源：在重庆江津区农田和果园内采集富含腐烂秸秆、枯枝的土样及霉变玉米棒、水果样品，从中分离出产纤维素酶菌株；以及本实验室保存的部分真菌。

斜面培养基：PDA完全培养基。

收稿日期：2008-10-06

基金项目：重庆市科委自然科学基金项目（2006BB1268）。

作者简介：武峥（1979~），女，陕西宝鸡人，硕士；从事农产品采后生物技术、农业微生物方面的研究。

第2期武峥等：降解秸秆的纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件研究21

选择培养基：Dubos纤维素培养基。

筛选培养基：纤维素―刚果红培养基。

液体发酵培养基：CMC-Na 0.5%，蛋白胨0.3%，(NH4)2S04 0.2%，KH2PO4 0.4%，CaC12 0.03%，MgS04·7H2O 0.03%，Tween-80 0.02%，自然pH，121℃，灭菌20 min。

1.2 菌种的筛选

将腐枝烂叶和霉变物样品磨碎后置于生理盐水中振荡，土壤样品则配成悬液静置，取上层水样接入Dubos纤维素培养基中连续富集培养3次，培养至三角烧瓶中的滤纸溃烂为止。然后将富集后的菌液在纤维素―刚果红培养基上划线培养（28℃）至菌落长出，挑有透明圈的菌落进行复筛，重复几次直至得到纯菌落，保存于PDA斜面。再将纯化菌株配制成种子悬浮液接种于液体发酵培养基，测定酶活力，筛选出纤维素酶高产菌株。

1.3 酶活力的测定

1.3.1 酶液的制备

250 mL三角瓶装入50 mL液体培养基，接种4%孢子悬液（1×108 cfu/mL），28℃，150 r/min，摇床振荡培养至所需时间。液体发酵液在6 000 r/min、4℃离心15 min，上清液即为用于测定的粗酶液。

1.3.2 内切纤维素酶活（CMCA）

取适当稀释的酶液0.5 mL，加入1 mL 1%（W/V）的CMC-Na溶液（溶于磷酸氢二钠―柠檬酸缓冲液，pH 5.0），50℃反应30 min，加入DNS终止反应，沸水浴5 min，测定还原糖含量。

1.3.3 滤纸酶活（FPA）

取50 mg（1×6 cm）新华滤纸，加入酶液0.5 mL，再加1 mL柠檬酸―柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8），50℃反应1 h，加入DNS终止反应，沸水浴5 min，测定还原糖含量。

1.3.4 外切纤维素酶活（C1）

取1 mL粗酶液，与l mL 2%（W/V）的微晶纤维素（溶于0.05 mol/L的柠檬酸―柠檬酸钠缓冲液，pH 4.8）的底物混合，50℃反应2 h，加入DNS终止反应，沸水浴5 min，测定还原糖含量。

1.3.5 β-葡萄糖苷酶活（BGA）

取1 mL粗酶液，底物为2 mL 0.5%（W/V）的水杨苷溶液（溶于醋酸―醋酸钠缓冲液，pH 5.0），50℃反应30 min，加入DNS终止反应，沸水浴5 min，测定还原糖含量。

1.3.6 棉花酶活[5]

取50 mg脱脂棉，加2 mL醋酸缓冲液（pH 4.8），再加入酶液0.5 mL，滴入甲苯1滴，50℃反应24 h，其它同上。以每小时转化底物产生1.0 μg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。

以上酶活均扣除发酵液中还原糖后计算酶活力，酶活采用国际单位，在上述各条件下如

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无单独列出，以每分钟内转化底物产生1.0 μg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。所有酶活测定均重复三次，结果取平均值。

1.4 产酶影响因子的优化试验

参照文献[6-9]略加修改，研究绿色木霉T206产酶条件的影响因子，以确定不同碳源、氮源、接种量、起始pH以及培养时间对该菌株产酶的影响，初步确定该菌株产酶的适宜培养条件。

1.4.1 碳源

麦麸、玉米芯、稻草、麦草、玉米秸杆，自然晾干，粉碎，过50目筛备用。分别以CMC-Na （0.5%，1%）、麦麸、玉米芯粉、稻草粉、麦草粉、玉米秸秆粉、微晶纤维素、新华滤纸、纤维二糖和蔗糖作为液体发酵产酶培养基中的唯一碳源，接种该菌株于以上不同碳源的发酵产酶培养基中，于28℃、150 r/min分别培养至所需时间，测定酶活。

1.4.2 氮源

以“1.4.1”中产酶最高的碳源为基础碳源，分别加入0.3%蛋白胨，0.2%尿素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠以及蛋白胨与其组合的氮源，接种4%该菌株孢子悬液于液体发酵培养基中，于28℃、150 r/min培养至所需时间，测定酶活。

1.4.3 接种量

以上两步筛选的碳源和氮源替换液体发酵培养基中的碳源和氮源，分别接种2%、4%、6%、8%、10%、16%孢子悬液（1×108 cfu/mL）于发酵培养基中，28℃，150 r/min摇床震荡培养至所需时间，测定发酵液酶活。

1.4.4 起始pH值

应用已筛选的碳源和氮源，调节液体发酵培养基酸碱度在pH 3～8的范围内，根据“1.4.3”实验结果确定接种量，于28℃、150 r/min摇床震荡培养至所需时间，测定发酵液酶活。

1.4.5 培养时间

应用已确定的最佳碳源、氮源、接种量和pH值，于28℃、150 r/min分别培养10天，间隔24 h，测定发酵液酶活。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

从所有样品和供试菌株中筛选到分解纤维素的菌株23株。将纯化菌株反复点种在纤维素―刚果红培养基平板上，通过多次反复比较，得到15株透明圈直径较大的菌株。经液体发酵比较产酶能力（表1），测得2号菌株纤维素酶活力较高，该菌株分离于霉变的玉米棒，初步鉴定为绿色木霉，命名为T206。摇瓶培养96 h达到产酶高峰，羧甲基纤维素酶活（CMCA）为4392.01 U，滤纸酶活（FPA）为1218.25 U。

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表1 不同菌株产酶活力比较

菌株号 1 2 3 4 5 6 7 8

菌株号9 10 11 12 13 14 15

CMCA/ U 1277.39 824.51 1903.43 1603.73 691.31 2023.31 931.07

FPA/ U 162.44 223.38 135.47 151.45 127.47 223.38 199.40

2.2 碳源对产酶的影响

研究菌株T206在不同碳源中产纤维素酶活力。结果发现，T206在培养96 h时达到产酶高峰，单糖、双糖以及纤维素类物质均能促进纤维素酶的产生。不同来源的C对产酶影响较大，以蔗糖、葡萄糖和纤维二糖为碳源纤维素酶活都较低，而以纤维素类物质为碳源CMCA和FPA都明显升高。纤维素酶是诱导性酶，所以培养基中的碳源除了构成菌体结构成分、菌体储藏物质和为菌体生长提供能源外，还起着产酶诱导物的作用。以1% CMC-Na 为碳源，CMCA和FPA最高，分别可达到7559.37 U和1675.12 U，与0.5% CMC-Na相比，CMCA增长41.9%，如表2所示。其它碳源增加添加量，对产酶能力没有明显提升，因此未在表中列出。

表2 不同碳源对产酶的影响

碳源CMCA/ U CMC相对酶活/ % FPA/ U FP相对酶活/ % 1% CMC-Na 7559.37 100 1675.12 100 玉米芯5881.05 77.80 1362.1 81.31 微晶纤维素5534.73 73.22 1344.79 80.28

新华滤纸5135.13 67.93 1315.48 78.53

0.5% CMC-Na 4392.01 58.10 1218.25 72.73

稻草4202.73 55.60 1077.06 64.30

玉米杆4016.25 53.13 971.83 58.02

麦草3563.37 47.14 773.36 46.17

麸皮2484.45 32.87 317.82 18.97

纤维二糖1538.73 20.36 187.28 11.18

葡萄糖1288.31 17.04 173.29 10.34

蔗糖555.71 7.35 159.97 9.55

0.3%蛋白胨，0.2% (NH4)2S04，4%接种量，自然pH，150 r/min，28℃

2.3 氮源对产酶的影响

实验表明，该绿色木霉对多种氮源都能加以有效利用。在考察的几种氮源中，对0.3%蛋白胨和0.2% NH4NO3组合的利用效果最好，为最佳氮源；其次为单独使用0.3%蛋白胨；而单独使用(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3和尿素的效果都很差，尤其对尿素的利用最差；但与蛋白胨组合使用均有利于纤维素酶的产生，蛋白胨对菌体生长和产酶量都起到了关键作用，如表3所示。虽然氮源并不作为诱导纤维素酶的诱导物，但对菌体的迅速增长有很

24 纤维素科学与技术第17卷重要的作用，对产酶影响较大。

表3 不同氮源对产酶的影响

氮源(NH4)2SO4NH4NO3NaNO3尿素蛋白胨CMC相对酶活/ % 29.94 39.74 5.32 3.29 98.39

FP相对酶活/ % 55.93 67.43 80.40 100 64.90 51.94 47.20 1% CMC-Na，0.3%蛋白胨＋0.2% NH4NO3，6%接种量，150 r/min，28℃

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2.6 培养时间对产酶的影响

在以上实验所筛选的适宜条件下进行产酶试验，每隔1天取样。菌株在生长的前24 h 纤维素酶的活性较低，当进入对数生长期后，该菌株开始大量产酶，发酵4天（96 h）后，CMCA和FPA均达到最高值，此为该菌的最佳发酵产酶时间。此后发酵液中两种酶活均呈现降低趋势，但均保持在一个相对较高水平，并没有急剧下降，如表6所示。这可能是由于随着培养时间延长菌体发生老化，产酶能力逐渐下降，酶浓度也达到一定的饱和状态。

表6 不同培养时间对产酶的影响

培养时间/ d 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CMC相对酶活/ % 4.84 95.75 97.66 100 96.60 94.90 89.73 88.09 86.39 81.71

1% CMC-Na，0.3%蛋白胨＋0.2% NH4NO3，6%接种量，pH 5.0，150 r/min，28℃

2.7 对不同类型纤维素的降解能力

取适量发酵液与不同类型的纤维素底物进行反应，研究发酵液的酶组分对不同类型纤维素的降解能力。该菌种发酵条件经过优化后，收集到的发酵上清液对CMC-Na和滤纸有很好的降解作用，培养96 h，CMCA最高达到了7654.33 U；以微晶纤维素为底物的外切纤维素酶活和β-葡萄糖苷酶活相对较低；棉花酶活更为不明显，与底物作用96 h仅为926.07 U，如表7所示。实验表明，该菌有较好的CMC酶发酵效果，对纤维素衍生物类物质的降解能力较强，而对天然纤维素的分解利用能力相对较弱。由于该菌株所产纤维素酶的最显著特点为CMCA和FPA活力较高，在对纤维素水解过程中，可与其它来源的纤维素酶配合使用，提高水解度。

表7 T206产纤维素酶系不同组分活性

培养时间/ h CMCA/ U FPA/ U C1酶活/ U BGA/ U 棉花酶活/ U

48 6532.73 1214.19 390.64 583.68 488.18

96 7654.33 1675.12 616.92 795.47 926.07

1% CMC-Na，0.3%蛋白胨＋0.2% NH4NO3，6%接种量，pH 5.0，150 r/min，28℃

3 结论

从土壤、腐败农产品以及现有菌种中分离筛选得到15株产纤维素酶的真菌，通过对15个菌株发酵液的CMC酶活和滤纸酶活进行测定，初步得到产纤维素酶活力较高的绿色木霉T206菌株。

通过对产酶过程中纤维素酶的分析，初步确定了菌株T206适宜的产酶条件。产酶最佳碳源为1% CMC-Na，氮源为0.3%蛋白胨和0.2% NH4NO3组合，接种量为6%，起始pH值为5，培养时间控制在96 h，此条件下纤维素酶活最高。

T206所产纤维素酶的酶系组成特点为：以内切葡萄糖苷酶（CMCA）和滤纸酶（FPA）为主，β-葡萄糖苷酶（BGA）活力较高，其次是以微晶纤维素为底物测得的外切纤维素酶（C1），

26 纤维素科学与技术第17卷

棉花酶活最弱。

本研究筛选到的产酶菌株酶活较高，有一定的应用潜力，为秸秆生物降解的实际生产应用提供了部分参考依据。

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WU Zheng, ZHANG Ying-jun, ZHOU Xin-zhi （Fruit Research Institute, Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 402260, China）

Abstract:15 strains with performance to hydrolyze cellulose were screened from soil, rotten produce and preserved fungi in our laboratory. A Trichoderma Viride T206 with relatively high cellulase activity was isolated. The isolated sample was fermented in liquid state after isolation, and its fermentation conditions (carbon source, nitrogen source, inoculating volume, initial pH and cultivating time) and enzyme component were studied. Under optimum condition, its hydrolysable efficiency upon carboxymethyl cellulose and filter paper reached 7654.33 U and 1675.12 U.

Key words: Trichoderma Viride; cellulase; screening; fermentation