五种裂腹鱼亚科鱼类外胚层发育不良因子A受体基因Edar的克隆和序列分析

五种裂腹鱼亚科鱼类外胚层发育不良因子A受体基因Edar的克隆和序列分析
五种裂腹鱼亚科鱼类外胚层发育不良因子A受体基因Edar的克隆和序列分析

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性,对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素,高纯度紫杉醇价格昂贵,每公斤200万元人民币左右。因此,近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成,尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率,克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法,但是紫杉醇的合成途径非常复杂,涉及到多种酶以及很多分支途径,单纯依靠转化一、两种限速酶基因,只能保证转入的限速酶表达量提高,使之不再是限速因素,但其它阶段对于最终产量的限制依然存在,而且同时转入多种基因的可行性非常低,这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成,如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇,为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破,目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇,能够利用真菌生长速度快的优势,但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求,而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌,其紫杉醇含量极微,并且这些真菌的培养和大规模发酵困难,菌株衰退也是一个难题。 另外,红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一,是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段,如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前,在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因,它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域,是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因,之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

基因的克隆、表达载体构建与功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证(一般性方法) 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么?它有什么功能? b.这个基因在哪种材料中扩增? c.材料需要怎么处理? ◎实验前准备工作 a.设计引物,准备材料, b.购置试剂:Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具:枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌;Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速裂解植物细胞,抑制细胞释放出的核酸酶,所提取的RNA完整性好且纯度高,以利于下一步的实验。 1)实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水(ddH2O中含0.1%DEPC,V/V,37 ℃过夜处理12 h),高温灭菌后,用DEPC水配制75%乙醇,研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h,所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法(小麦)叶片或根的总RNA实验步骤如下: (1)提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol,然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末,

移入管内,用力摇15 s,在15-30℃温育5 min,使核酸蛋白复合物完全分离。 (2)4℃,12000g离心10min,取上清,离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。 (3)吸取上清液加0.2 ml氯仿,盖好盖,用力摇15 s,15~30 ℃温育2~3 min。(4)在≤12000g,4℃离心10 min,样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层,RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 (5)将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中,加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA,室温静止30 min。 (6)在≤12000g,4℃离心10 min,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 (7)用≥1 ml的75%乙醇洗RNA,涡旋振荡样品,在≤7500g,4℃离心5 min,弃上清。(8)室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟,加无RNase的水100μl用枪头吸几次,55~60℃温育10 min使RNA溶解。 (9)配制以下体系: 10×DNase buffer 5 μl DNase I (RNase-free)(40 μg/μl) 1 μl RNasin Inhibitor(40 μg/μl) 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl (10)37 ℃水浴1h,加DEPC处理的水至总体积为100 μl,加入等体积氯仿抽提一次。(11)取上清,加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液,200 μl的无水乙醇,-80 ℃沉淀30 min。 (12)2~8 ℃,12000g离心10 min,弃清液,干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3)RNA的质量及纯度检测 (1)电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳,在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 (2)分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液,以DEPC水为空白对照,测定A260/ A280 比值,估测RNA质 量。 4)cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA: 1)在Eppendorf管中配制下列混合液:

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

基因克隆技术的研究进展_钟军

第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.360docs.net/doc/f78997062.html,

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

基因工程原理讲义:目的基因的克隆

第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月

目录 一、基因克隆的一般概念 1.基因克隆定义 2.“克隆”的不同含义 3.基因克隆的过程 4.DNA片段的产生与分离 5.基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1.物理策略 2.生物策略 3.克隆样品的选择 4.基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1.概述 2.cDNA文库的构建 3.低丰度mRNA之cDNA克隆 4.稀少mRNA的cDNA克隆 5.全长cDNA的合成 6.cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆

1.cDNA克隆的局限性 2.基因组DNA克隆的优越性 3.构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1.基因定位克隆概述 2.RFLP分子标记 3.RFLP作图原理与步骤 4.染色体步移 5.大尺度物理图谱的构建

目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1.基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning),它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上,构成重组的DNA群体,并转化到寄主细胞进行复制和繁殖,以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作,叫做基因克隆。严格地说,基因克隆应叫做DNA克隆,因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段,而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别!完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离!尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中,甚至于某些正式有关文件中,常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用,不作区分,是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆,即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning),实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容,基因克隆的全过程包括如下四个步骤:

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后,进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果,如图一所示,3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带,说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果,如图二所示,电泳会得到两条带,说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带,证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞,用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板,进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因,所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落,说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长,说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落,证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后,由于倒平板速度太慢,导致 培养基凝固,影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中,离心后,弃 上清的过程中,将沉淀和上清混在了一起,影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功,得到电泳结果如图 四所示,结果表明,1、2泳道的条带约为700bp,说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(6): 1027-1034 http://https://www.360docs.net/doc/f78997062.html,/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@https://www.360docs.net/doc/f78997062.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目(2011208001)资助。 * 通讯作者(Corresponding author): 李文利, E-mail: biolwl@https://www.360docs.net/doc/f78997062.html, 第一作者联系方式: E-mail: yh4018@https://www.360docs.net/doc/f78997062.html, Received(收稿日期): 2013-09-26; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-03-24. URL: http://https://www.360docs.net/doc/f78997062.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院, 辽宁大连 116024 摘 要: F-box 是Skp1-Cullin1-F-box (SCF)型泛素连接酶E3的重要组成部分, 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因, 命名为SiFBX (GenBank 登录号为KC252635.1)。该基因全长510 bp, 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明, 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸, 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明, 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处, 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明, 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下, 表达量出现显著变化。 关键词: 谷子; 干旱响应; F-box; gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene (SiFBX ) Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng, YU Qin-Yang, AN Li-Jia, and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China Abstract: F-box proteins, components of the Skp1-Cullin1-F-box (SCF) protein E3 ubiquitin ligase complex, serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX (GenBank accession number KC252635.1) which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet (Se-taria italic ). The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp, which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine (R), leucine (L), and serine (S) and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG , wa-ter-withholding, and ABA. Keywords: Setaria italica ; Drought response; F-box protein; qRT-PCR 研究表明, 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1], Skp1-Cullin1-F-box (SCF)型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族, 包含了一个35~60个氨基酸组成的F-box 结构域, 在SCF 型E3介导的蛋白降解中, 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合, 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游, 常常伴随一些重要的次级元件, 如LRR (leucine-rich repeat)、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因, 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白, 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明, F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发

基因克隆的技术

基因克隆技术 摘要:基因克隆技术是分子生物学的核心技术,其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝,用于深入分析基因的结构与功能,并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术:目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词:目的基因;限制性内切酶;克隆;重组分子 ABSTRACT:Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords:purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术,可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA,包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA;“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA,或者切出目的基因;“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来,形成重组的DNA分子;“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增;“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因,也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法

基因克隆基础知识

RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1.Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2.禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2+存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。 4.MMLV反转录酶的RNase H-突变体:商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1.随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2.Oligo(dT):是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3.特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR 反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。 二、试剂准备 1.RMA提取试剂 2.第一链cDNA合成试剂盒 3.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4.Taq DNA聚合酶 三、操作步骤 1. 总RNA的提取:见相关内容。 2. cDNA第一链的合成:目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 (1)在0.5ml微量离心管中,加入总RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心。 (2)70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物: 10×PCR buffer 2μl 25mM MgCl2 2μl

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.360docs.net/doc/f78997062.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006

gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计 题目:绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业:生工1001 :会淼 2013年3月13 实验目的:研究绿色荧光蛋白(Greed Fluorescent Protein,GFP)基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白(GFP)外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达,再用IPTG诱导GFP基因表达,如果可以看到显现绿色,判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法: 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种,质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3,引物,限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。(LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %); 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存; 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L

目的基因的克隆表达

目的基因的克隆表达 一.PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链,温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则,通过控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶,dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项:先加多的再加少的;模板最后加;设置阴性对照, 不加模板,加入等量的水 4.反应过程 (1)预变性:94℃,1min (2)变性:90℃,30s (3)退火:45-60℃,45 s (4)延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环

(6)72℃,10min (7)16℃,保温 二.琼脂糖凝胶电泳 1.原理:若将一种分子置于电场中,它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率,它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质,故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小,极性及介质粘度的函数。因此,根据分子大小的不同,构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中,加入适量的溴乙啶或Glodview染料,它能对核酸分子进行染色,而不与琼脂糖凝胶相结合,然后将电泳标本放在紫外线下观察,可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 (1)称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE,混合均匀 (缓冲液TBE的作用:用于稳定体系酸碱度,使溶液两极的PH保持基本不变;是溶液具有一定的导电性,利于DNA的迁移) (2)在微波炉中打化,每20s摇一下 (3)按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料,使DNA带上绿色荧光标记

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