His-蛋白纯化步骤

原核蛋白表达

1．将pET14b RXL BL21菌在Kan+ LB平板上划线，放置37℃培养箱中培养。2．挑取单克隆入2～4ml Kan+ LB液体培养基中，置37℃摇床中培养过夜。

3．将摇起的菌液以1:100接种量转接入Kan+ LB液体培养基，置37℃摇床中培养2小时30分钟，后加入终浓度1mM IPTG置37℃摇床中诱导3～4小时。

His-CyclinE在BL21中的表达

1.将CyclinE以EcoR I 与XhoI双酶切构建到pET32a(+)上, 转化BL21, 后接菌摇

菌过夜, 后以1:100转接到新鲜的LB培养基;

2.37℃摇菌2小时30 分钟后, 加入IPTG至终浓度0.6mM, 37℃诱导4小时,

5000rpm×10min离心收菌;

3.菌体用PBS洗涤一次, 后加入超声液(20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 10mM

imidazole, 1 mM PMSF), 重悬, 后以5s, 间隔10s, 全程时间20min, 保护温度8℃超声;

4.12000rpm×20min×4℃离心, 后进行His蛋白纯化.

His-蛋白纯化步骤

一.Ni-NTA Beads的再生过程:

1.用2倍柱体积的Regeneration Buffer( 6M 盐酸胍, 0.2M 醋酸)洗涤Beads;

2.用5倍柱体积的水洗涤;

3.用3倍柱体积的2％SDS洗涤;

4.用1倍柱体积的25％乙醇洗涤;

5.用1倍柱体积的50％乙醇洗涤;

6.用1倍柱体积的75％乙醇洗涤;

7.用5倍柱体积的100％乙醇洗涤;

8.用1倍柱体积的75％乙醇洗涤;

9.用1倍柱体积的50％乙醇洗涤;

10.用1倍柱体积的25％乙醇洗涤;

11.用1倍柱体积的水洗涤;

12.用5倍柱体积的100Mm EDTA, pH8.0洗涤10min(鳌合除去多余的Ni离子);

13.用5倍柱体积的水洗涤;

14.用2倍柱体积的100mM NiSO4室温结合30min;

15.用5倍柱体积的水洗涤;

16.用2倍柱体积的Regeneration Buffer;

17.用2倍柱体积Binding Buffer平衡.

备注: 新Beads可以从13步开始

二.His-蛋白纯化过程:

1.将His-CyclinE上清加入Ni-NTA Beads中, 4℃结合2小时, 后打开盖子, 让

液体流下;

2.加入5倍柱体积的Washing Buffer在混合器上洗涤10min, 后打开盖子, 让

液体流下,此步骤重复3-4次;

3.后分别用1 mL 50mM, 75mM, 100mM, 125mM, 150mM的Elution Buffer

进行梯度洗脱;

4.结果显示在125mM imidazole 洗脱蛋白比较纯.

各种试剂的配方

1.Binding Buffer:

20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 10mM imidazole, pH7.4

2.Washing Buffer:

20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 20mM imidazole, 2％TritonX-100, pH7.4 3.Elution Buffer:

20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 500mM imidazole, pH7.4

4.Regeneration Buffer:

6M 盐酸胍, 0.2M 醋酸

备注: 由于加入imidazole溶液的pH升高至碱性, 故pH须回调至7.4

蛋白质的纯化方法

蛋白质纯化的方法蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。（二）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化

His-Tag蛋白纯化步骤

变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备 1、用1× PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS），并按上述方法进行超声破菌。 2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。若有必要，用1 × PBS洗包涵体几次。 3、用Binding/Wash Buffer（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30～60分钟。若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。 4、12000rpm离心30min，取上清至一干净管中。 His标签蛋白的重力纯化流程 1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。 1、平衡柱子的工作温度。应在室温或4℃下进行纯化。 2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。 3、用2倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，以0.5～1 ml/min的流速过柱。 4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。 5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。直到流出液的吸光度在280 nm基线处。 6、用两倍树脂体积的Elution Buffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。 7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit（No SK3041）。洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M尿素的缓冲液透析。就地清洗方案如果背压增加或观察到树脂明显污染，通常进行完全性能恢复流程。由于所有的NI-IDA树脂的高螯合强度和低金属浸出率，就地清洗前不需要进行stripping。我们建议使用下面的方法，以清除污染物，如沉淀的蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白。程序 1、用15倍树脂体积的0.5 M NaOH清洗柱子。考虑到需要30min的接触时间，因此需相应地调整流量（如用0.5 M NaOH溶液以0.5ml/min的流速洗1ml的NI-IDA柱，需要相当于15ml总体积的量）。 2、用10倍树脂体积的1 × PBS重新平衡后，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入20～30%乙醇或10～100mM氢氧化钠进行4℃保存。通过洗脱（stripping）和离子重填装进行再生

Protocol蛋白质纯化步骤

Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。

His蛋白纯化原理、方法和问题分析

组氨酸(His)标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。 Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤：大肠杆菌的破碎方法： 1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。) 2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（pH7.4的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理（一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：如何加快透析过程（1）加大浓度差，及时更换透析液（2）利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来（二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析

（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是：碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。因此洗脱顺序应该是：酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法

蛋白质的纯化方法

蛋白质的纯化方法蛋白质在外加电场作用下，带电的蛋白质颗的纯粒在电场中移动的速度(v)取决于化电场强度E，所带的净电荷q，蛋方白质的分子量、分子形状以及与介质法的摩擦系数f。几种常用的电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳) 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦IEF 双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法电影聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳蛋法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰白质胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的的多孔网状凝胶。纯不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品化胶。方法 PAGE分辨率很高。电泳过程 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽蛋链中的氨基酸残基按大约1 比例白结合。质每一个蛋白质分子都因为结合了许多的的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质纯化分子原有的电荷则可以忽略。该法主方要利用了蛋白质分子量大小不同而分法离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。等电聚焦将两性电解质eg:pH3-9，pH5-7同蛋白质样品一起加入到已经灌好的蛋凝胶中，在电场下，两性电解质首白质先达到它的等电点而平衡，蛋白质的样品根据它自身的等电点分别向两纯化极移动，最后也达到平衡。方等电聚焦:这种按等电点的大小，生物法分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称等电聚焦。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。蛋白质双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色连续电泳几种常用的层析法吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析柱层析离子交换层析法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。蛋离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素白质如羧甲基纤维素CM纤维素)等，阴离子交的换纤维素如二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纯纤维素)等。化带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而方带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。法用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法蛋白质的纯化方法凝胶过滤法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或蛋聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的白内部是多孔的网状结构。质的 Sephadex G10-G200葡聚糖凝胶纯

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、 Bl21 codon（DE3）等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。 4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解

蛋白纯化流程

走着，看着，身边的故事是否能“联”到你生活里不经意间的感触；听着，学着，那些零碎的知识是否“联”到你科研里正在探索的实验；知识公园里设计着一位主角，那棵树，笔直的干、侧伸的斜枝是思维的框架，“联着”地下，伸向天空。科研的思维总在不断地规划、设计，梳理知识，以备清晰行动。在设计的流程中不断的吸收新的知识，枝繁叶茂，丰富主干，正如条条大路通罗马，思维也会随之活跃，路也会更加灵活。而今天，我们所要梳理的主干，是蛋白纯化的知识流程，即蛋白纯化的基本策略，愿这些简单的知识点归类能够联到你的科研思维。前奏：释放蛋白，目标：浓缩捕获蛋白；间奏：粗分离蛋白，主要利用离心、沉淀、萃取等方法将蛋白和细胞中的其他成分（DNA 、RNA 等）物质进行分离。主旋律：精细纯化蛋白，去除蛋白质分子量比较接近的蛋白以及痕量杂质。蛋白纯化流程

我们需要根据目标蛋白质的各种性质选择合适的蛋白纯化方法。亲和层析因其高分辨率的特点，常用于精制纯化蛋白，根据目标蛋白与配体之间特异性结合的能力、重组标签蛋白螯合金属离子的能力、带有糖基化修饰蛋白可于外源凝集素结合的能力，亲和层析具有高的目的蛋白分辨率，但是在进行精纯化蛋白之前，需要对蛋白质进行粗纯化，常用的有硫酸铵盐析法。例如分享来自一位网友的纯化蛋白的经验帖子，其目标在于纯化大肠杆菌表达的可溶性sigma32蛋白，该蛋白可以与细胞内的Core RNA polymeras结合形成复合体，最终确定采用免疫亲和柱来纯化蛋白复合体，但为了提高纯化的效率，首先对复合体进行粗纯化，利用带正电的PEI（聚乙烯亚胺）沉淀酸性蛋白和核酸，接着高盐洗脱蛋白，为了去除洗脱液中的PEI溶剂，采用硫酸铵沉淀蛋白，将蛋白和PEI分开，粗分离纯化后，再采用免疫亲和柱的方法进行精细纯化目标蛋白。凝胶过滤层析可以应用蛋白分子间的分级分离，也可以去除蛋白混合物中分子量差别较大的杂质。例如从Hela细胞中纯化一种叫AP-1的转录因子，就采用凝胶过滤的方法去除混合物中的核酸酶，因为核酸酶能够降解DNA亲和柱，并能够和其他非特异性蛋白结合，影

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

蛋白纯化方法大全

蛋白纯化方法大全蛋白纯化的技术很复杂，以下就会大家熟知蛋白纯化步骤。那为什么蛋白质要纯化呢，去掉蛋白质含有的一些杂质与其他蛋白质一起沉淀。那么又要去除蛋白质的杂质又要保证蛋白质的营养不被流失，于是就要制作不同的方案来应对，称为蛋白纯化技术。根据蛋白的相似度和差异去除蛋白中的杂质! 1、粗分级分离当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 2样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括

区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 3结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 41.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种

(完整word版)蛋白纯化AKTA操作说明

AKTA pure操作说明分子筛层析操作步骤： 1. 开机：打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。 2. 打开系统：打开电脑：双击Unicorn 7.0打开系统，进入log on 界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---Execute Manual instructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。 3. 洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在System Control界面下，点击manual---Execute Manual instructions---Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse。 4. 设置系统参数：设柱压：Alams---alam systerm pressure---high alam---设置柱压---Execute；设流速：Pumps---System flow ---设置system flow（1mL/min）---Execute。注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。 5. 装柱子(先上后下)：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。 6.平衡柱子：分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。 7.设置系统及收集参数：命名：先end---Manual instructions，点击browse，弹出select result name&location 界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。设流速：Pumps---System flow---设流速（1 mL/min）---Execute；设柱压：Alams--- alam systerm pressure---high alam---设置柱压---点击Execute；洗A泵：Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse；紫外调零：Monitors---Auto zero UV---Execute；

GST纯化步骤(精)

GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体； 2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h； 3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF （终浓度1 mM）；以下步骤均在冰上操作： 4 超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h； 5 2000 g，3min离心弃上清； 6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清； 7 重复步骤6 两次； 8 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min； 9 2000 g，3 min离心，收集上清； 10 重复步骤8-9至少两次； 11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度； 12将蛋白置于-20℃保存。 P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条件。

制备细胞裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS; 2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min; 3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min; 5. 4℃ 3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 纯化融合蛋白： 7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml 树脂，于室温下轻摇30min; 8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 11.重复步骤9和10两次； 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白；用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清；蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以 500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。

蛋白质分离纯化步骤

一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提