蛋白质精氨酸甲基转移酶的研究进展
木瓜蛋白酶
发酵工程与设备课程论文 题目木瓜蛋白酶 班别学号 姓名 成绩
木瓜蛋白酶 摘要：木瓜蛋白酶是一种能分解蛋白质的蛋白酶。先了解木瓜蛋白酶的制备及保存，接着分析它的化学修饰和酶活力的影响。最后，木瓜蛋白酶的固定化及方法以及它在各个行业的应用。Abstract: Papain is a protease that breaks down proteins.To understand the preparation and preservation of papain and then analyzed its chemical modification and enzyme activities.Finally, the immobilized papain and the method and its application in various industries 关键字：木瓜蛋白酶化学修饰酶活力固定化行业的应用Keywords:papain Chemical modification enzyme immobilization industry applications 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。它是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。 作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 一、木瓜蛋白酶的制备及保存 木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下，入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
木瓜蛋白酶的研究进展
木瓜蛋白酶的研究进展2010-2011学年第2学期《食品添加剂》课程论文 得分
摘要 木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，具有较高的热稳定性。在食品工业中主要用于啤酒和其他酒类的澄清，肉类嫰化，饼干、糕点松化及蛋白质水解生产等，在医药工业中也有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域。由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。 关键字:木瓜蛋白酶固定化食品工业
1.木瓜蛋白酶的概述 木瓜蛋白酶（papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素，别名番木瓜酶,木瓜朊酶,番瓜酵素。木瓜酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 纯木瓜蛋白酶系由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23.406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶。 2.木瓜蛋白酶的特点 木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。 3.木瓜蛋白酶的作用机制 作用方式：木瓜蛋白酶是一种内切酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精以及低聚糖中的a-1,4糖苷键。酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格。 木瓜蛋白酶（Papain）是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。 木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。 4.木瓜蛋白酶在各个行业的应用 （1）医药工业应用： 含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 （2）食品工业应用： 可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，广泛适用于如：鸡、猪、牛、海产品、血制品、大豆、花生等动植物蛋白酶解、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有
木瓜蛋白酶在美白护肤中的应用
南宁东恒华道生物科技有限责任公司——专业酶制剂生产厂家 销售热线4000-0771-80 木瓜蛋白酶在美白护肤中的应用美白产品在行业中的现状 人体到了25岁以后，身体的新陈代谢功能减慢，黑色素无法正常排解，而在角质层沉积形成斑点，形成黄褐斑、黑斑和色斑等。统计资料显示，13亿人口的中国，祛斑美容产品每年的市场份额已超过100亿元,年利润在千万元以上。国内美白、祛斑类产品已成为护肤品中的主流产品之一，而美白护肤产品绝大多数属于化学试剂或植物提取物，效果有限而且副作用明显，严重影响了用户的持续使用和行业的发展。 美白产品在行业中存在的问题 美白是全世界的难题，有一些不良商家为了使护肤品达到良好的美白效果，在护肤品中添加一些金属元素如汞、铅等。添加汞后，汞化合物会破坏表皮层的酵素活动，使黑色素无法形成。铅的氧化物具有一定遮盖作用，也可用于美白。如果化妆品中添加了砷、汞、铅，长期使用对人体造成的损害最大。在SK—II 之后，又有4大著名化妆品品牌(迪奥、雅诗兰黛、兰蔻、倩碧)的6款粉饼产品被香港媒体披露含有重金属铬和钕。消费者不仅感到恐惧，也对化妆品的安全性产生怀疑。 木瓜蛋白酶在行业中的应用 木瓜酶是从番木瓜水果中提取而得含有多种生物酶的美白去斑生物产品，主要作用为嫩肤及美白去斑。其生物机理学： 第一，木瓜酶作用于人体皮肤老化角质层，促使其分解退化、去除，达到嫩肤效果及促进细胞生长的效果，且木瓜酶水解物在皮肤表层形成一层氨基酸衍生物薄膜，使肌肤保持润湿与光滑； 第二，木瓜酶易于与形成色斑的黑色素中的铜离子形成络合物，减少黑色素的形成和去除色斑的黑色素，且木瓜酶水解的三钛物质可直接抑制形成黑色素的络氨酸活性，消除自由基作用，从而达到美白去斑的效果。 归结起来，木瓜酶通过去除老化皮肤角质层及与色斑中铜离子快速反应，抑制形成黑色素的络氨酸活性和去除氧化自由基，达到嫩肤美白去斑的功效。 1
组蛋白甲基转移酶活性or抑制分析试剂盒(H3K27)
EpiQuik组蛋白甲基转移酶活性/抑制检 测试剂盒（H3K27） EpiQuik? Histone Methyltransferase Activity/Inhibition Assay Kit (H3-K27) 产品名称：EpiQuik组蛋白甲基转移酶活性/抑制检测分析试剂盒（H3K27），EpiQuik? Histone Methyltransferase Activity/Inhibition Assay Kit (H3K27) 产品货号：P-3005 规格：48次、96次分析 产品简介： EpiQuik组蛋白甲基转移酶活性/抑制检测试剂盒（H3K27）是方便实验人员专门检测组蛋白H3第27位赖氨酸(H3-K27)的组蛋白甲基转移酶活性/抑制分析的一整套工具。该试剂盒即时使用，提供全部必需的试剂用于成功进行组蛋白甲基转移酶活性/抑制性试验，不接触放射性物质或任何特殊设备（启维益成有售）。 这个试剂盒具有如下优点： ●快速操作，3小时内可完成。 ●安全独创的比色测定，不接触放射性物质，无需提取和层析分析。 ●专一性检测H3-K27组蛋白甲基转移酶活性/抑制。 ●可剥离的微孔板让实验人员灵活选择手工或高通量分析。 ●极其简便，结果可靠，一致的分析条件。 背景信息： EpiQuik组蛋白甲基转移酶活性/抑制检测试剂盒（H3K27）是为了专门检测组蛋白H3第27位赖氨酸处组蛋白甲基转移酶活性而设计的。在该试剂盒在实际检测中，组蛋白底物紧密结合在微孔表面，组蛋白甲基化转移酶把腺苷基蛋氨酸（Adomet）的一个甲基基团转移到组蛋白H3基质的第27个赖氨酸上将其甲基化。甲基化的H3-K27能被一种高亲和性抗体识别，其数量与组蛋白甲基转移酶活性成线性关系，并且可通过HRP偶联的二抗显色系统进行定量。因此，组蛋白甲基转移酶活性可以依据其所转换的甲基化H3-K27的数量进行计算（启维益成有售）。 试剂盒组分： HM1 (10X 冲洗缓冲液) HM2 (组蛋白检测缓冲液) HM3 (腺苷基蛋氨酸)* HM4 (生物素标记的底物, 25 μg/ml)* HM5 (组蛋白甲基转移酶标准品, 10 μg/ml)* HM6 (结合抗体, 100 μg/ml)* HM7 (检测抗体, 200 μg/ml)* HM8 (显色溶液)
木瓜蛋白酶应用及研究进展
木瓜蛋白酶应用及研究进展 摘要本文主要介绍了木瓜蛋白酶的作用机理，在医药、食品、化工、科研等方面的应用，以及在木瓜蛋白酶的固定等方 面的最新研究进展。 关键字木瓜蛋白酶应用酶的固定化发展 一、简介 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，主要应用于啤酒及食品工业。 二、作用机理 木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。这种酶属于内肽酶，能切开蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。是一种存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。木瓜蛋白酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。这种酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观
为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）
从毛霉中提取蛋白酶
实验一：从毛霉中提取蛋白酶及分离方案 组员：周云线周丽玲陆江妙 1 实验原理 毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝，在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。毛霉常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。工业中利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。 酶活定义：在4 0℃， p H7.2条件下， 1分钟内水解酪蛋白产生 l微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。蛋白酶水解络蛋白，其产物络氨酸能在碱性条件下使福林-酚试剂还原，生产钼蓝与钨蓝，在680nm下测定其吸光度，可求得蛋白酶活力。考马斯亮蓝是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，这种现象称为盐析。在蛋白质的盐析中，硫酸铵最为常用，这是由于硫酸铵在水中的溶解度最低而且温度系数小不影响酶活性，分离效果好。 2 仪器 恒温培养箱、振荡摇床、恒温振荡器、离心机、722分光光度计、pH计、恒温水浴锅 3培养基 斜面培养基PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL 煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10mL（视试管大小而定），121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 固体培养基：麸皮10g，水12mL，自然pH值，适量装入250mL三角瓶中，l2l℃灭菌30min后趁热及时摇散，备用。 液体培养基：蛋白胨20g、葡萄糖10g、氯化镁2g、磷酸二氢钾2g，250mL锥
组蛋白甲基化转移酶G9a对NK细胞功能调节作用的研究
中文摘要 目的： 自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK细胞）作为一种固有免疫细胞，在免疫系统中发挥着重要作用。目前关于NK细胞的研究主要集中于NK细胞表面受体以及相关信号通路对其发育和功能的影响等方面，我们研究发现NK细胞在发挥功能时，会伴随着染色质及其组蛋白修饰状态的变化，而组蛋白甲基化转移酶G9a 在组蛋白修饰中具有重要的作用，并且组蛋白甲基化转移酶G9a对造血干细胞以及T细胞发育有着重要的影响，另外组蛋白甲基化转移酶G9a是否会影响NK 细胞的发育及其功能尚未报道，因此探讨组蛋白甲基化转移酶G9a在NK细胞的作用具有重要意义，本研究主要从表观遗传学的角度探讨G9a如何影响NK 细胞的功能及其作用机制。 方法： 第一部分：从GEO数据库中分析相关数据，在NK细胞免疫信号通路被激活的情况下，寻找表达水平变化最显著的组蛋白甲基化酶和去甲基化酶，发现G9a 在NK细胞激活之后显著下调，并用qPCR实验验证G9a的变化。从外周血中分选获得原代NK细胞，加入抑制G9a酶活性的小分子抑制剂，采用western blot 方法检测加入小分子抑制剂后，G9a修饰的NK细胞中IFN-γ启动子区域H3K9me2的修饰水平；并用流式细胞术分析NK细胞在被激活的情况下，抑制G9a的酶活性后IFN-γ的表达变化。 第二部分：采用qPCR在转录水平检测不同条件激活的NK细胞系的IFN-γ的表达变化，并用流式细胞术和ELISA等技术检测IFN-γ在蛋白水平的表达变化；ChIP-qPCR检测在抑制G9a酶活性前后，NK细胞系中IFN-γ启动子区域H3K9me2的修饰水平变化。 结果： 第一部分：高通量分析结果显示，NK细胞在被激活的情况下，G9a的表达量下调；在抑制NK细胞中G9a甲基转移酶活性后，可以增强NK细胞分泌IFN-γ的能力。 第二部分：通过在转录水平和蛋白水平两个层次上的检测发现，抑制NK细胞G9a甲基转移酶活性后，NK细胞分泌IFN-γ的能力增强；ChIP-qPCR实验结果 I
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展 赵电波，陈茜，张丽尧 (郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002) 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶的组成，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Progress of Extraction and Application of Technology of PapainZHAO Dianbo, CHEN Xi, ZHANG Liyao（College of Food and Biotechnology Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, HenanZhengzhou 450002, P. R. China）Abstract: The composition of papain was described, and its extraction methods, research of extractiontechnology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing itwas further described, and its applicationsinpharmaceutical, chemical industry and the future prospects offood processing have been prospected in this article.Key words: papain;extractiontechnology; food processing; application 中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：1001-8123(2010)11-0019-05 木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M）[1]，其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。1木瓜蛋白酶的提取工艺 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等[2]用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，且产品的纯度较低。木瓜蛋白酶的提取也曾广泛采用单宁沉淀法，乙引等[2] 用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀 单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。1.2目前较为常见的提取方法 目前生产中多采用超滤、絮凝、盐析等方法提取木瓜蛋白酶。 1.2.1超滤法提取木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶酶活力检测方法
木瓜蛋白酶酶活力检测方法 南宁庞博生物工程有限公司企业标准 Q/NPB 01-2019 食品添加剂木瓜蛋白酶制剂 1、范围 本标准规定了食品添加剂木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂木瓜蛋白酶制剂。 2、规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 191-2019 包装储运图示标志 GB/T 601-2002 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准 GB/T 4789.2-2019 食品卫生微生物检验菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验沙门氏菌检测 GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检测 GB/T 4789.10-2019 食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定 GB/T 5009.74-2019 食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则 GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄糖 JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY/T 691-2019 番木瓜
毛霉制腐乳
毛霉制腐乳 1腐乳的发现 早在公元5世纪的北魏古籍中，就有关于腐乳生产工艺的记载“于豆腐加盐成熟后为腐乳”。 明李晔的《蓬栊夜话》亦云：“黟（移）县人喜于夏秋间醢腐，令变色生毛随拭之，俟稍干……” 千百年来，腐乳一直受到人们的喜爱。这是因为经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鲜美，易于消化吸收，而腐乳本身又便于保存。腐乳品种多样，如红豆腐乳、糟腐乳、醉方、玫瑰红腐乳、辣腐乳、臭腐乳、麻辣腐乳等。品种虽多，但酿造原理相同。 2制腐乳的原因——其意想不到的功用 发酵豆制品营养丰富，易于消化，在发酵过程中生成大量的低聚肽类，具有抗衰老、防癌症、降血脂、调节胰岛素等多种生理保健功能，对身体健康十分有利。 具有降低血液中胆固醇浓度、减少患冠心病危险的功能。发酵豆制品中含有丰富的苷元型异黄酮，它是大豆和豆腐中原有的异黄酮经发酵转化的，但比原有的异黄酮功能性更强，且更易吸收。60克豆豉、60克豆酱或100克腐乳就含有50毫克的高活性异黄酮，达到美国食品与药物管理局推荐预防冠心病的每日摄取量。 具有降血压功能。国外已经用大豆蛋白化学分解的办法生产降血压肽的保健食品，我们的实验发现中国的传统豆豉、腐乳就含有高活性的降血压肽。其实大豆在发酵时，微生物要首先把大豆蛋白分解为更小的分子，这就是所谓的肽。 具有预防骨质疏松症功能。发酵豆制品中的大豆异黄酮能提高成骨细胞活性，促进胰岛素样生长因子的产生，从而防止骨质疏松症。日本的营养调查发现：每天喝豆酱汤或吃发酵豆制品的人，骨质疏松症患病率明显降低，尤其是老人和妇女。 豆腐中含有的抗氧化成分，如维生素E、异黄酮等酚类物质，以及一些肽类，使豆腐具有清除自由基的能力，而经过发酵制得的腐乳清除自由基能力比豆腐高5～10倍，比番茄、葡萄等果蔬还高10多倍。 豆豉含有大量能溶解血栓的纳豆激酶，还富含一些能产生大量B族维生素和抗菌素的细菌，被称为是最有效的防治老年心血管疾病、保持血管健康的食品。 发酵豆制品具有防治老年性痴呆症的功效。人体产生的乙酰胆碱酯酶是分解神经末端传达物质的酶，现代医学认为它的存在与老年痴呆症发病有关。笔者在和日本专家的共同研究中发现，我国腐乳具有明显乙酰胆碱酯酶抑制活性。也就是说，发酵的腐乳，对防治老年性痴呆症有效。 3毛霉制腐乳 3.1原理 毛霉是一种丝状真菌，广泛分布于土壤、空气中，也常见于水果、蔬菜、各类淀粉食物、谷物上，引起霉腐变质。它的菌丝可分为直立菌丝和匍匐菌丝。繁殖方式为孢子生殖，新陈代谢类型为异养需氧型。应用于腐乳等发酵工艺。 毛霉在腐乳制作中的作用：在豆腐的发酵过程中，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。 传统腐乳的生产中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代的腐乳生产是在无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品质量。 豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。豆腐坯上接种毛霉，经过培
m6A甲基化酶的种类及功能盘点——m6A专题
m6A甲基化酶的种类及功能盘点| m6A专题 图1 m6A甲基化加工过程 m6A这种甲基化修饰被证明是可逆化的，包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等共同参与。其中甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A 修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。 表1 RNA甲基化酶类型总结
1．m6A甲基化转移酶 甲基化转移酶（methyltransferase）也叫Writers，是一类重要的催化酶，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物（complex）共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种，所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。 图2 METTL3-METTL14蛋白复合物晶体结构示意图 结构生物学研究表明，METTL3和METTL14这两种蛋白有关键的催化结构域，两者之间会形成杂络物（hetero complex）。其中METTL3是具有催化活性的亚基，而METTL14会在底物识别上起到关键作用。另外WTAP、Vir以及其他类型的factors也是杂络物的重要组成部分。其中WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。这些蛋白无论在体内（in vivo）还是体外（in vitro）都会一起对腺苷酸进行甲基化修饰。除了人和小鼠等哺乳动物，果蝇、酵母甚至拟南芥中也发现了类似的同源蛋白（homologous protein）。 2．m6A去甲基化酶 在真核生物中，已发现的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。1999年，FTO基因首次在小鼠中被克隆。2007年，三项独立的队列研究分别证实当FTO基因产生突变时，会增加肥胖的风险。同样在小鼠模型中，FTO被敲除或过表
木瓜蛋白酶在食品工业中应用的研究进展
木瓜蛋白酶在食品工业中应用的研究进展 江甜 （武汉轻工大学，湖北武汉430023） 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Applications of papain in the food industry JIANG Tian （Wuhan Polytechnic University，Wuhan, 430023） Abstract: The papain was described, and its extraction methods, research of extraction technology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing it was further described, and its applications in pharmaceutical, chemical industry and the future prospects of food processing have been prospected in this article. Key words: papain; extraction technology; food processing; application 木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内，未成熟果实的乳汁中含量最丰富[1]。木瓜蛋白酶的作用范围很广，水解温度为10℃～80℃，在pH值3～9的范围内对底物均有作用，且稳定性好。在密封容器内，4℃的条件下或阴凉干燥处保存6个月酶活力仅下降0～10 或10 ～20 [2]。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白酶水解和合成能力，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，利用木瓜蛋白酶的酶促反应，可把大分子的蛋白质水解成容易消化吸收的小分子多肽或氨基酸[3-4]，不仅可以用来改善植物蛋白的营养价值或功能性质，而且也广泛应用于食品行业，如啤酒的澄清、肉的嫩化以及制革、纺织和日化用品等行业中，同时也受了医学界的极力关注和重视[5-6]。 1木瓜蛋白酶的制备 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，
毛霉蛋白酶的催化特性及动力学研究
毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种，在腐乳生产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在的，具有相当高的水解程度，并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽[1-2]。而对众多腐乳产品的感官分析也表明，腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上 结果来看，毛霉蛋白酶在解决大豆蛋白水解率低、水解物的苦味等难题方面具有很大的潜力。毛霉虽然在发酵工业中的应用有着悠久的历史，但是对这类菌种胞外蛋白酶系的研究却并未完全开展。仅有极少数学者对该菌种的发酵产酶特性及粗酶的催化、水解特性进行过探讨[3-5]。然而，毛霉由于长期受到高蛋白环境条件的驯化， Catalytic and kinetic properties of one protease from Mucor PAN Jin-quan (Life Science and Technology School,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048)Abstract:One protease was purified from extracellular of Actinomucor elegans AS3.2778and its catalytic and kinetic properties were also investigated.The results show that the purified protease was one alkaline serine protease,which has relatively higher activity at pH8.5～9.5and 60℃,and is stable at pH6.0~9.0at ＜45℃.At 40℃,the kinetics of casein hydrolysis by the protease fit the Mchaelis-Mentonequation:V=22.8S S+8.857,and the energy of activation (Ea)of this hydrolysis reaction below 45℃is 44.09kJ.The protease was unstable at 50℃,and the kinetics of deactivation fit the model:a=exp(－0.218t). Key words:Actinomucor elegans;protease;catalytic properties;kinetics 潘进权 (湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江524048) 摘要：从雅致放射毛霉胞外分离纯化出一蛋白酶组分，以酪蛋白为底物对其催化特性及动力学 进行了分析。结果表明：该蛋白酶组分是一种碱性丝氨酸蛋白酶；在pH8.5～9.5、60℃具有最大催化活性，在pH6～9和低于45℃具有很好的稳定性；在40℃该蛋白酶水解酪蛋白的反应符合米氏方程：V=22.8S S+8.857；在4～45℃的范围内，该蛋白酶水解酪蛋白反应的活化能Ea 为44.09 kJ ；该蛋白酶在50℃不稳定，其热失活规律符合一级指数衰减动力学模型：a=exp(－0.218t)。关键词：雅致放射毛霉；蛋白酶；催化特性；动力学 中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2010)11-0036-05 毛霉蛋白酶的催化特性及 动力学研究 收稿日期：2010-03-13 基金项目：广东省自然科学基金项目(9452404801001943)。 作者简介：潘进权(1978—)，男，博士，讲师，主要从事酶与发酵工程相关领域的研究工作。 ·36 ·
木瓜蛋白酶中英文对照
Papain Papain [9001-73-4] Papain is a purified proteolytic substance derived from Carica papaya Linné(Fam.caricaceae).papain,when assayed directed herein, contains not less than 6000 units per mg. Papain of a higher digestive power may be reduced to the official standard by admixture with papain of lower activity ,lactose,or other suitable diluents. One USP Unit of papain is the activity that releases the of 1μg of tyrosine from a specified casein substance under the conditions of the Assay， using the enzyme concentration that liberates 40μg of tyrosine per mL of test solution. Packaging and storage－Preserve in tight,light-resistant containers in a cool place. USP reference standards (11)—USP papain RS. pH<791>:between 4.8 and 6.2 in a solution (1 in 50). Loss on drying <731>—Dry it in a vacuum oven at 60℃ for 4 hours : it losses not more than 7.0% of its weight. Assay (casein digestive power)— Dibasic sodium phosphate.,0.05M—dissolve 7.1g of anhydrous dibasic sodium phosphate in water to make 1000mL.add 1 drop of toluene as a preservative. Citric acid,0.05M—dissolve 10.5g of citric acid monohydrate in water to make 1000mL. Add 1 drop on toluene as a preservative. Casein substrate—Disperse 1 g of Hammersten-type casein in 50 mL on 0.05M Dibasic sodium phosphate. Place in a boiling water bath for 30 minutes with occasional stirring.Cool to room temperature ,and add 0.05 M Citric acid to adjust to a pH of 6.0±0.1.stir the solution rapidly and continuously during the addition of the 0.05M Citric acid to prevent precipitation of the casein. Dilute with water to 100 mL .prepare fresh daily. Buffer solution (Phosphate-Cysteine Disodium ethylenediaminetetraacetate Buffer)