荧光寿命成像技术及其研究进展
激光与光电子学进展48,111102(2011)L a ser &Opt oe l e ct ro nics P ro
gress 20115中国激光6杂志社
荧光寿命成像技术及其研究进展
刘 超 周 燕 王新伟 刘育梁
(中国科学院半导体研究所光电系统实验室,北京100083)
摘要 荧光寿命显微成像(F LIM )技术是一种新颖的荧光成像技术,具有其他荧光成像方法无法替代的优异性能,
是生物医学工程领域的研究热点。频域调制、门控探测和时间相关单光子计数(T CSP C)是FL IM 的几种主要实现
方法。综述了这些技术的原理、研究现状和已取得的部分成果,比较了这三种方法的时间分辨率和成像速度等参
数的优劣。宽场FL IM 更适用于延时成像和实时成像。荧光偏振各相异性成像和内窥镜FL IM 技术都是FL IM 技
术很有前景的应用方向。
关键词 测量;荧光寿命成像;单光子计数;门控探测;频域调制
中图分类号 O433 文献标识码 A do i :10.3788/L O P 48.111102
Fluore sce nce Life time Imaging Micro sco py and Its Re se arch Progre ss
Liu Chao Zhou Yan Wang Xinwei Liu Yuliang
(Optoelect r onic Sy st em La bor a tor y ,In st itu te of Sem icon ductor s ,Chin ese Aca dem y of Scien ces ,
Beijing 100083,Chin a )
Abstract Fluorescenc e lifetime ima ging microscopy (FLI M)technology has so many outstanding and unique
advantages compared with other fluoresc ence imaging methods that it attracts more and more researchers in
biomedicine engineering field.Frequency domain modulation m ethod and time domain methods including time -gated
detection and time correlated single photon counting (TCSPC),a re the m ain ways to rea lize FLIM.Principles,
current reaseach situation and achievements of these methods a re presented as well as the compa rison of their main
performance pa rameters.Wide -field FLIM is more suitable for delay imaging.Fluoresc ence lifetime polarization
resolved imaging and endoscope FLI M are both promising researc h areas of FL IM.
Key wo rds measurement;fluorescence lifetime ima ging mic roscopy;time -c orrelated single photon counting;time -
gated detection;frequency m odulation
OCIS co des 110.0180;170.2520;260.2510
收稿日期:2011-04-08;收到修改稿日期:2011-05-29;网络出版日期:2011-08-27
作者简介:刘 超(1988)),男,硕士研究生,主要从事光电图像处理方面的研究。E -mail:lcphs820@g https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,
导师简介:刘育梁(1966)),男,研究员,博士生导师,主要从事光电图像处理,光纤传感等方面的研究。
E -mail:ylliu@https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,(通信联系人)
1 引 言
荧光光谱技术等主要基于荧光强度的测量方法容易受激发光强度、样品猝灭和荧光染料的浓度分布等因素的影响,因此难以做到定量测量。荧光寿命一般来说是绝对的,不受激发光强度、荧光团浓度和光漂白等因素的影响,而仅与荧光团所处的微环境密切相关。因此,测量样品荧光寿命的荧光寿命成像显微术(FLIM),可以对目标分子所处微环境中的诸多生物物理参数,如氧压、溶液疏水性等及生物化学参数,如pH 值、离子浓度等进行定量测量
[1]。本文概述频域及时域FLIM 的主要技术方法,介绍一些与FLIM 成像
相关的技术。2 FL IM 技术的分类及总体进展
荧光发射后会以指数规律衰减。荧光寿命通常定义为荧光强度降至其最大值的1/e 时所需的时间,常用S 表示。由于荧光分子所处环境的不同,荧光发射可分为单组分和多组分两类,最简单的情况即单组分
下,荧光信号的衰减可表示为I =I 0exp (-t/S ),(1)
式中I 为t 时刻荧光强度,I 0为最大荧光强度。如果有大量处在相似环境里的荧光分子被激发,那么发射荧光的衰减遵循单指数规律,即单组分。典型的荧光信号通常都是多组分,即多指数规律衰减[2]。
FLIM 技术发展到现在,形成了频域和时域两大类方法。其中门控探测(Time -Gated Detectio n)、时间相关单光子计数(T CSPC)和扫描相机成像(Streak -FLIM )是三种主要的时域实现方法。
国际上从20世纪80年代开始荧光寿命成像方面的研究工作。较早从事荧光寿命成像技术方面研究工作的是日本大阪大学,他们提出了频率调制法来进行荧光寿命测量[3]。频率调制法原理清晰,设备要求低,系统简单且造价低,技术也日趋成熟。随着生物医学测量的需要,可进行纳秒、皮秒甚至飞秒量级荧光寿命成像的实时时域FLIM 技术随后兴起,相对于频域调制法具有成像速度快,时间分辨率高等优点。T CSPC 是一种经典的光子测量技术,在目前时域FLIM 中应用最广泛,技术也很成熟。T CSPC 最早在1975年被美国PT I 公司商品化。20世纪90年代,大阪大学也开始了T CSPC -FLIM 的研究。现在有很多科技公司从事这方面的研究,德国Becker &H ickl GmbH 公司是国际上知名的T CSPC 设备供货商,并在该领域拥有领先的技术。与此同时,时间分辨率不及T CSPC,但成像速度更快的门控FLIM 技术逐渐成为FLIM 领域的研究热点。目前国际上门控FLIM 技术主要的研究单位有伦敦帝国大学
[4]、荷兰乌特勒支大学[5]、伊利诺伊州立大学香槟分校[6]及加州大学戴维斯分校[7]等,研究领域几乎都集中在泛光照明下生物样本荧光强度图
像的获取和荧光寿命探测的理论及实验研究等方面。
国内关于FLIM 技术的研究才刚刚开始,开展的单位较少。深圳大学光电子研究所牛憨笨院士研究小组开展了基于扫描相机技术的FLIM 研究,取得了基于TCSPC 的FLIM 的相关中国专利[8,9]
,并将其应用到了眼部疾病的早期诊断。中国科学院半导体所目前正在开展门控荧光寿命成像的研究工作。3 频域FLIM 技术
图1为频域FLIM 原理[10]。频域FLIM 使用正弦调制的激光器或发光二极管(LED)(调制频率典型值为10~100MH z)作为光源对样品进行激发,样品会产生与激发光同频率但相位差为$U 的荧光信号;然后使用同频调制的CCD 或者PM T 作为探测器解调并接收荧光信号;通过测量相移<和解调系数M ,
即可计算
图1频域FL IM 原理
Fig.1Pr inciples of fr equency domain F LI M 相应的荧光寿命S <和S M [10]:
S <=1X
tan $U ,(2)S M =1X 1M 2-1,(3)
式中X 为调制频率,调制系数M 可表示为
M =AC em /DC em AC ex /DC ex .(4) 国际上对频域FLIM 的研究开展较早。日趋成熟的
技术让研究者对频域FLIM 在医学诊断领域的应用产生了浓厚的兴趣。如何提高成像速率成为频域FLIM 应用首先需要解决的问题。1999年,瑞士环境工程研究所的M izeret 等[11]实现了视频速率的内窥镜频域FLIM 成像,将其应用到了医疗诊断领域。2000年,伊利诺伊大学厄本那)香槟分校的H olub 等[6]实现了帧频55H z 的频域FLIM ,是当时FLIM 技术的最快帧频。时域FLIM 技术可提供更快的成像速度和更好的分辨率,但频域FLIM 由于原理明晰,设备简单仍不失为重要的FLIM 实现方法。2004年,新加坡南洋理工大学的Seah 等[10]使用频域FLIM 完成了对潜在指纹的识别。在某些对成像速率要求不高的场合,频域FLIM 还有很高的应用价值。
4 时域FLIM 技术
时域FLIM 通过脉冲激光器激发荧光团,利用探测器(如ICCD 、PMT 等)直接探测荧光衰减信号成像。
时域设备与频域相比,通常拥有更快的成像速度和更高的时间分辨率,因此对设备的要求更高。T CSPC 有理想的光子计数率和超高的时间分辨率,与门控探测相比,可测量更短的荧光寿命(皮秒量级)。门控法的荧光寿命分辨率虽不及TCSPC,但图像获取速度通常很快,是实现非稳态过程探测的有力技术手段。在几种时域方法中,本文着重介绍门控FLIM 。
图2单光子计数原理Fig.2Pr inciples of T CSPC
4.1 时间相关单光子计数
由于某一段时间内检测到发射光子的概率与此时段
内的荧光强度成正比,那么通过探测荧光强度的衰减即可
实现荧光寿命的探测。TCSPC 即基于上述原理实现。如
图2所示[2],每一次激发脉冲为一个测量周期,每个周期
最多记录一个荧光发射光子;记录该光子出现的时间,并
在坐标上记录频次;经过大量的累计,即可构建出荧光发
射光子在时间轴上的概率分布曲线,即荧光衰减曲线[2,13]。
由于每个周期只记录一个光子,成像速度较慢便成为
TCSPC 无法回避的最大缺点。T CSPC 的时间分辨率很
高,通常只受探测器[如光电倍增管(PMT)、雪崩二极管
(APD)]的渡越时间限制。Becker 等[12]报道使用基于快速
卷积PMT 的TCPSC 可分辨150ps 的寿命,而基于微通道
板PM T 的设备可分辨25~30ps 的荧光寿命。
4.2
门控探测
图3门控F L IM
F ig.3T ime -gated FL
IM
图4典型门控荧光寿命成像系统框图F ig.4T ypical sy stem o f time -g ated FL IM
图3为理想的单指数荧光衰减曲线,在激发光E (t)作用下,荧光团发射荧光,其荧光强度F(t)与时间t 的关系可表示为
F(t)=F 0ex p (-t/S ),
(5)式中F 0为最大荧光强度。在荧光激发经t G 时间的延迟后,开启一个宽度为$t 的时间门,在此时间段内对荧光强度进行积分,经过一定推导后,可以通过两个不同的t G 求得S
S =t G 2-t G 1ln [H (t G 1)/H (t G 2)],(6)即荧光寿命可通过在两个不同延迟时刻开启的相同宽度的门内记录的荧光强度信息求得。因此理论上,使用双门控进行时域荧光寿命成像是可行的。但是光源(激光器、LED 等)的不稳定和探测器图像增强器的增益随机性限制了双门控探测法的精确度。故而在条件允许的情况下,通常采用多门控探测,即选取多个窗口获取多幅图像(通常为5~10幅)来反演寿命图像[14]。一个典型的设置为:取三个不同的延迟时刻(即三个时间门),每个门记录1~5幅图像[15]。
图4是一个典型的门控荧光寿命成像系统简图。生物荧光寿命成像装置通常由激发光源、光电探测器
(成像器件)、延迟装置及图像处理设备组成。门控装置的光源通常为短脉宽超快激光器,以提高生物样品成像的寿命分辨率。CCD 是常见的成像设备,CCD 门宽对成像精度的影响还需要深入的研究。延迟装置提供FLIM 的控制信号,可由光纤产生的光延迟及光学鉴相器,延迟产生器及延迟线等延迟装置产生的电延迟提供[4]。由于光电探测器及CCD 等成像器件输出的都是光强度信息,需要利用强度信息图像反演出荧光寿命图像。由荧光强度图像生成寿命图像的方法主要有两种:Rapid Lifetim e Determ inatio n (RLD)和Weighted Nonlinear Least Square (WN LLS)[16]。前者利用单组分衰减规律即(6)式直接逐点计算两幅图像各像素的
强度比,进而得到荧光寿命,因此也可称为比率法[5]。由于初始数据只有两幅图像,数据量小,该方法的特点
是计算速度快。后者可用最小二乘法拟合各像素点的强度衰减规律,由荧光寿命的定义求得各像素的荧光寿命。测量精度高的代价是计算速度相对较慢。门控控制装置保持整个系统信号的同步。
如何提高门控方法的性能是研究的重点,为此硬件和软件方面的进步都推动了门控方法的进步,使其成为当前FLIM 研究中最引人入胜的领域。
门控系统图像获取帧频较快,但是荧光寿命分辨率不及T CSPC 。光源激发脉冲越短,门控探测的精确度越高。由于短脉冲激光器的成本高、设备复杂,门控方法成像速度快的优势一度表现不明显。但是随着半导体激光器的发展,获取短脉冲激光的成本大大降低,门控探测的研究也越来越受到重视。1999年,伦敦帝国大学的Jo nes 等[17]
首次使用全固态二极管抽运激光器(波长820~850nm ,脉宽40fs)实现了门控FLIM 。相对T CSPC 法,门控FLIM 的特点是成像速度快。2004年,荷兰乌特勒支大学的Ag ronskaia 等[5]在活体细胞钙离子成像实验中获得了100H z 的帧频(即每秒100幅图像),这一速度是目前FLIM 领域的记录。使用宽场显微系统和基于两幅强度图像的比率算法是取得这一速度的技术关键。近年来,基于拉盖尔多项式的指数衰减规律拟合方法因具有更高的精确度而受到研究者欢迎,这一方法被广泛用以实现门控FLIM 寿命图像计算[18]。此外,这种方法因其更快的计算速度,更适用于医疗诊断情境下的寿命反演[7]。5 宽场FLIM 系统
图5(a)激光扫描荧光显微镜;(b)宽场荧光显微镜Fig.5(a)Laser scanning ;(b)w ide -f ield fluor escence m icroscope
宽场FLIM 是宽视场的荧光寿命成像显微镜,图5给
出了宽场显微镜与扫描显微镜的对比[2]。与扫描显微镜
相比,宽场FLIM 技术的优势在于较弱的荧光团光漂白效
应和较快的系统成像速度。在相同探测率下探测相同数
量的光子,宽场成像与扫描成像所需的总激发量是相等
的。但是由于宽场系统的激发光束是未经聚焦的(图5),
所需的激发光强要小得多,则样品受到光漂白的影响会小
于扫描系统。此外,相对于逐点成像的扫描系统,宽场系
统拥有更快的成像速度,适用于要求实时成像的情境。由
于光束未聚焦的本征属性,宽场系统的缺点在于其成像深
度小于扫描系统,无法获得样本深层的图像。这一缺点也
可通过其他手段得到改善,如伦敦帝国大学的Neil 等
[19]运用宽场FLIM 获取了三维荧光图像。6 荧光偏振各相异性成像
偏振也是荧光的特征,包含着可用来计算荧光寿命的信息,这些信息有时是寿命、强度等荧光特征里不包含的,因此荧光偏振成像可作为FLIM 技术的补充。各相异性测量的原理是:若样品被偏振光激发,由于荧光的发射具有各向异性特征,则其偏振方向取决于激发光的偏振方向以及荧光团的分子极化方向。但随之产生的荧光团旋转扩散,将会导致其解偏振。因此,经过一段时间后,荧光的偏振度或各向异性性将降低,降低量取决于荧光团的构像及其所处微环境的变化。通过测量荧光各向异性的衰减时间,就有可能了解更多有关荧光团及其所处微环境的信息[20]。
图6基于T CPSC 的时间相关荧光各相异性成像系统框图
F ig.6System of t ime resolved fluor escence polarization
imag ing microscope 图6为一个基于TCPSC 的时间相关荧光各相异性
成像系统[21]。该装置与普通TCSPC 装置的区别在于,
此装置将正交偏振光的平行光与垂直光成分分开探测以
达到记录荧光偏振信息的目的。线偏振脉冲激光器用以
激发样品荧光,荧光通过偏振分光镜(PBS)后,两个探测
器(D1、D2)分别同步探测被分光镜分开的正交偏振光,
探测器输出进入多通道路由和TCPSC 卡进行处理。荧
光的平行光和垂直光成分的衰减规律分别通过逐像素计
算获得。两幅偏振分辨图像同时生成,进一步合成各相
异性图像[21]。
7 FL IM 技术与癌症诊断癌细胞的自荧光特征与正常组织有较大差异,同时也可用于区分癌细胞的不同生长周期[22]。其自荧光特
图7皮肤癌细胞荧光寿命图像Fig.7Fluo rescence lifet ime imag e o f skin t umo r 征之一的荧光寿命提供了癌症诊断的新依据。伦敦帝国
大学的Galletly 等[23]
证明在体外,FLIM 可分辨基底细
胞癌与正常皮肤组织。如图7皮肤癌组织荧光寿命照片
中,癌组织与正常组织的寿命值相差很大,极易分辨[14]。
这样,应用FLIM 技术可实现癌组织的精确定位,为手术
治疗提供更准确的依据。近年来,国际FLIM 的研究热
点纷纷集中在FLIM 对癌症的辅助诊断上。研究的方向
也逐渐从体外病理检验向体内诊断治疗发展。
内窥镜是临床诊疗,特别是胃癌、食道癌诊断中非常
重要的手段。直接在体内成像的优势使其可分辨体外诊
疗方法(如X 射线成像、核磁共振成像等)无法辨识的病
变。因此,FLIM 与内窥镜的结合,将极大发挥其对癌症组织精确定位的优势。实时成像在内窥镜诊断中是非常必要的。早期瑞士国立环境工程研究所等机构的频域FLIM 研究是实时内窥镜FLIM 方面的有益探索[11]。2010年,加州大学戴维斯分校的研究小组成功利用实时内窥镜FLIM 进行了脑部恶性肿瘤手术[7]。该研究利用基于门控方法的FLIM 内窥镜成像,采用拉盖尔多项式拟合算法获取了寿命图像(成像时间约60s)。这一鼓舞人心的成果大大推进了内窥镜FLIM 的临床化进程。8 结 论
在各种FLIM 方法中,TCSPC 的时间分辨率最高,文献报道可达25ps,门控FLIM 仅次于T CSPC,可进行纳秒量级的寿命测试。但在成像速度上,门控FLIM 是最快的,文献报道帧频可达100H z 。频域FLIM 的成本最低,应用最广泛,但其性能指标均不及TCSPC 和门控FLIM 为主的时域方法。宽场FLIM 可实现更快的帧频,更适合应用于门控FLIM 。荧光偏振各相异性成像可与FLIM 技术相结合,以取得更佳的测量效果。内窥镜FLIM 有广阔的医疗应用前景,可用于癌症等疾病的早期诊断。
参
考文献1L i Dong xu,X u Xiao ,L i N a et al..T ime r eso lutio n fluor escence technolo gy and fluo rescence lifetime measur ement [J].Unv er sity Chemistr y ,2008,23(4):2~11
李东旭,许 潇,李 娜等.时间分辨荧光技术与荧光寿命测量[J].大学化学,2008,23(4):2~11
2W.Becker , A.Ber gmann.L if et ime imag ing techniques fo r o pt ical m icroscopy [J].htt p://w ww.spx.ari https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,/BM E630/lecture%20P ublic/F LIM /T CSPC fo r M icr oscopy.pdf
3X. F.Wang,T.U chida, D.Co leman et al..A tw o-dimensional fluo rescence lifetime imag ing sy stem using a gated imag e intensif ier[J].Ap p lied S p ectr oscop y,1991,45(3):360~366
4D.Elso n,J.Requejo-Isidro,I.M unro et al..T ime-domain fluor escence lifetime imag ing applied to biolog ical tissue[J].
Photochemical&P hotobiological Sciences,2004,3(8):795~801
5A.A gr onskaia,L.T erto olen,H.Ger ritsen.H igh fr ame rat e fluor escence lifet ime imag ing[J].Ap p l.Phy s.,2003, 36:1655~1662
6O.Ho lub,M.Seufferheld, C.Gohlke et al..Fluorescence lifetime imag ing(FL I)in rea-l time-a new technique in pho tosynthesis reseach[J].Photos y nthetica.2000,38(4):581~599
7Y.Sun,N.H atami,M.Yee et al..F luor escence lifet ime imaging micr oscopy for brain tumor imag e-guided sur ger y[J].J.
Biomedical Op tics,2010,15(5):056022
8Shenzhen U niversity.T ime r eso lutio n fluorescence spectr um measurement and imaging metho ds and implements[P].China Patent,CN200510092520.0
深圳大学.时间分辨荧光光谱测量和成像方法及其装置[P].中国专利:国家发明专利,专利公开号:CN200510092520.0 9Wang Y an,Zhao L ing ling,Chen T ong sheng et al..Study on cell cy cle using fluor escence liftime imaging micr oscopic system based on a st reak camer a[J].Chinese https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,ser s,2011,38(3):304002
王岩,赵羚伶,陈同生等.利用基于扫描相机的荧光寿命成像显微技术研究细胞周期[J].中国激光,2011,38(3): 304002
10L.Seah,P.Wang,V.M urukeshan et al..A pplicatio n o f fluor escence lifetime imaging(FL IM)in latent f ing er ma rk detectio n[J].For ensic Science I nternational,2006,160(2-3):109~114
11J.M izeret,T.Stepinac,M.H ansr oul et al..Instr umentatio n fo r r ea-l time fluo rescence lifetime imag ing in endo sco py[J].
Review of Scientif ic I nstr uments.1999,70(12):4689~4701
12W.Becker, A.Berg mann,M.H ink et al..Fluo rescence lifet ime imag ing by time-cor related single-photo n counting[J].
Micros cop y Reseach and T echnique,2004,63(1):58~66
13Ping qiao Ruan,Feng Gao,F ang Y ang et al..A n experimental investig ation on tw o-dimensional shape based diffuse optical tomo gr aphy[J].Chi n.Op t.Lett.,2010,8(8):787~790
14R.Cubeddu R, https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,elli, C.D c Andrea et al..T ime-resolved fluor escence imaging in bio lo gy and medicine[J].J.
Phy sics D:A p p l.Phy s.,2002,35(9):R61~R76
15P.U rayama,W.Z ho ng,J.Beamish et al..A U V-V isible-N IR fluo rescence lifetime imag ing micr oscope fo r laser-based biolog ical sensing w ith pico seco nds resolut ion[J].A p p l.Phy s.,2003,76(5):483~496
16J.Requejo-I sidr o,J.M cginty, D.Elson et al..H ig h speed w ide field time-gat ed endo sco pe fluor escence lifetime imaging [J].Op t.Lett.,2004,29(19):2249~2251
17R.Jones,K.Do wling,M.J.Co le et al..F luor escence lifetime imag ing fo r biomedicine using a l-l so lid state ultrafast laser technolog y[J].SPI E,1999.86~91
18P.Paritosh, A.Jo Jav ier.A utomated analy sis of fluorescence lifetime imag ing microscopy(FL IM)data based on the lag uer re deco nv olut ion method[J].IEEE T r ansactions on Biomedical Eng ineer ing,2011,58(1):172~181
19M.N eil, A.Squire,R.Juskait as et al..W ide-field fluo rescence microscopy w ith laser illumination[J].J.Microscop y, 2000,197:1~4
20Liu L ix in,Qu Junle,L in Z iyang et al..F luor escence lifetime imag ing and its biomedical applications[J].J.Shenz hen Univ er sity Science and Engineering,2005,22(2):133~141
刘立新,屈军乐,林子扬等.荧光寿命成像及其在生物医学中的应用[J].深圳大学学报理工版,2005,22(2):133~141 21J.Lev itt, D.M att hew s,S.Ameer-Beg et al..Fluo rescence lifetime and polarizatio n resolved imag ing in cell bio lo gy[J].
Cur r ent Op inion in B iotechnology,2009,20(1):28~36
22Lin X iaog ang,P an Y ing jun,Guo Y ongcai.T he study of cerv ical cancer cells model based o n U V absor ption spectrum[J].
Acta Op tica S inica,2009,29(5):1328~1331
林晓钢,潘英俊,郭永彩.癌细胞细胞周期自体荧光谱特征[J].光学学报,2009,29(5):1328~1331
23N.Galletly,J.M cG inty, C.D unsby et al..F luor escence lifetime imaging distinguishes basal cell carcino ma fro m sur ro unding uninv olved skin[J].T he Br itish J.Der matolog y,2008,159(1):152~161
小动物近红外二区荧光活体影像系统
仪器名称：小动物近红外二区荧光活体影像系统 百购生物网为您提供 型号：Series II 900/1700 简介： 针对传统活体荧光成像技术面临的低组织穿透深度（<3毫米）和低空间分辨率（~毫米）、高自发荧光背景等瓶颈，苏州影睿光学科技有限公司的研究团队历经多年潜心研究，于2012年推出了第一款基于近红外二区荧光（NIR-II,900-1700nm）的小动物活体影像商业化系统（Series II 900/1700），实现了高组织穿透深度（>1.5cm）、高时间分辨率（50ms）和高空间分辨率（25μm）的活体荧光成像。 Series II 900/1700可针对不同的研究体系，在小动物活体水平进行实时、无创、动态、定性和定量的影像研究，包括肿瘤早期检测、肿瘤发展、转移和治疗过程、药物筛选、靶向药物和靶向治疗、干细胞活体示踪及其再生医学研究等。影睿光学拥有世界领先的量子点制备和应用专利技术、活体荧光影像设备，以及强大的数据处理和分析功能，为用户提供完整的科研产品及解决方案。 目前，影睿光学Series II 900/1700系统已成功销往美国埃默里大学，并与美国哈弗大学医学院、美国康奈尔大学、美国埃默里大学、北京大学、复旦大学附属华山医院、南京大学附属鼓楼医院、中国科学院北京动物研究所、中国科学院上海药物研究所等数十家国内外优秀研究机构建立了良好的商业伙伴及合作关系。
技术优势： 荧光活体成像解决方案：近红外二区荧光成像
活体组织对近红外二区荧光（1000-1700nm）具有更低的吸收和散射效应，以及可以忽略的自发荧光背景，因此，在活体荧光成像中，与传统荧光（400-900nm）相比，近红外二区荧光具有更高的穿透深度、更高的时间和空间分辨率，以及更高的信噪比。 近红外二区荧光探针解决方案：Ag2S 量子点
荧光成像的原理和方法
荧光成像的原理与方法 荧光成像在基因组学和蛋白质组学等生物学领域应用中的独特优势： 高灱敏度：灱敏度进超比色法，在大部分应用中其灱敏度近乎放射性同素。 多组样品一次成像：将不同样品（如：对照、处理）通过不同发射波长的荧光素标记（如 Cy3或 Cy5等）可以同时检测多样品荧光信号。 稳定性高：较放射性同位素相比，荧光素标记的抗体、杂交探针、PCR引物等的信号稳定性优势明显，可稳定存在数月以上，这使需要大规模标记并多阵列之间的标准化比较成为了可能。 低毒性成本低：多数情况下，荧光标记和检测的全过程试验用手套即可对实验者提供足够的保护。易于运输和实验后处理，多数情况下实验成本低于放射性同位素。 商业可获得性：许多重要的荧光标记型生物大分子如各种单抗、多抗、CAT等及荧光标记用试剂盒都可以方便获得,同时一些公司提供荧光标记的外包服务。 荧光信号的产生及信号捕获原理： 荧光物质被特定外界能量激发（如激光等高能射线），引起其电子轨道向高能轨道跃迁， 并最终释放能量回归基态的过程中会产生可被检测的荧光信号。当然不是所有的物质都能被激发产生荧光，只有当该物质与激发光具有相同的频率并在吸收该能量后具有高的荧光效率而非将能量消耗于分子间碰撞过程中，其荧光信号才可被光学设备所检测（Fig.1）。 Fig.1 ①激发能②无辐射弛豫能③荧光发射能。三种荧光素（绿色：fluorescein；黄色：DNA-bound TOTO TM；红色：DNA-bound EB）的激发光波长(a)和发射光波长(b)。 荧光成像系统的组件和工作原理： 荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系的，这是荧光成像系统应用于生物学研究的理论基础，激光扫描系统的性能指标主要有：系统分辨率、线性范围、均一性、灱敏度。 为了实现荧光信号的激发、捕获和放大的检测过程，按照顺序荧光成像系统主要包括以下组件：激发源（Excitation resource）、激光传输组件（Light delivery optics）、荧光收集组件（Light collection optics）、发射滤镜（Emission filter）和信号检测放大组件（Detection and amplification）（Fig.2）。在荧光成像系统工作的过程中，每个组件的性能都关系着最终荧光信号的收集和检测结果。
Xenics红外相机在第二近红外小动物活体荧光成像方面的应用-4
Xenics液氮制冷相机在第二近红外小动物活体荧光成像方面的应用 1、应用背景介绍 癌症作为四大不治症之一，一直以来都是全球各国希望攻克的难题。World Cancer2014报告指出：全球范围内每年癌症新增病例高达1400万，死亡病例高达820万，而2010年全球在癌症上投入的资金为1.16万亿美金，为全球生产总值的2%。 影像方法一直以来都是癌症研究、药物开发，以及一般医疗行业重要的辅助研究手段；传统的获取影像的方法主要包括X-Ray成像、可见光成像以及核磁成像。X-Ray 成像主要是通过X光探测器来探测穿透人体组织后的X光影像，主要包括DR、CT、PET 等设备，但是X光成像由于有辐射，对人体有伤害，且这些成像技术的空间分辨率有限，很难实现微小病灶的早期检测，进而影响早期治疗。同样，由于这些设备的时间分辨率有限，不适合外科医生长期手术使用；可见光成像主要通过探测400nm—700nm范围内的可见光来获取影像信息，但是可见光无法获得被探测人和物内部的信息；MRI也是医疗行业一个有力的手段，但是MRI设备拍摄时间长、费用昂贵，无法在术中使用。 图1：CT、PET探测设备 基于上述背景，越来越多的生命科学工作者开始了其他影像方法对癌症检测价值的研究。近红外成像由于能够获得更高的空间分辨率和更高的时间分辨率，获得了越来越多研究者的喜爱。同时，由于更深的探测深度，以斯坦福大学为首的众多科研院所和高
校开始了第二近红外成像的研究。 图2：红外成像探测深度VS 可见光成像探测深度 2、第二近红外荧光成像研究原理 近红外成像，由于时空分辨率都比Micro-CT和PET高，又没有辐射，同时可以在手术中使用等，被广泛研究。近红外成像主要分为第1近红外（0.75um—0.9um）成像和第2近红外（1.1um--1.4um）成像，而第2近红外成像由于可以获得更深的探测深度（1 - 3毫米），更高的空间分辨率（~ 30毫米），更高的时间分辨率（< 200 ms 每帧），更受期待。 图3：可见光成像、红外成像，以及可见光和红外成像融合图 小动物体内的荧光基团，在激光的照射下，会辐射出比激发光波长更长的光子信号，辐射出来的光子穿透组织到达体表，被能够探测到900nm-1700nm近红外谱段的InGaAs材料的液氮制冷相机获取并成像，通过对荧光信息成像的分析，进而获取小动物体内血管、肿瘤等信息；
小动物活体成像技术_浙江大学汇总
小动物活体成像技术 李冬梅万春丽李继承 摘要：随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用。本文围绕五种小动物成像专用设备，综述其特点及主要应用，比较各种设备的优势和劣势，总结小动物活体成像设备的发展趋势。 关键词：小动物；活体；成像技术 Small living animal imaging technology LI Dong-Mei1 WAN Chun-li 2 LI Ji-Cheng 1 （1Medical college of Zhejiang university，2Shanghai sciencelight biology sci&tech Co.,Ltd.）Abstract: With the development of small animal imaging technology, non-invasive imaging in small living animal models has gained increasing importance in pre-clinical research. Based on five kinds of small animal imaging special equipments, this article reviews their characteristics and illustrates their main applications. Meanwhile, this article also compares the advantages and limitations of these equipments and summarizes the trends of small living animal imaging equipments. Key words: small animal;living; imaging technology 动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施，同时大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物由于诸多优势在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域应用日益增多。近年来各种影像技术在动物研究中发挥着越来越重要的作用，涌现出各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。 动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。动物活体成像技术主要分为光学成像(optical imaging)、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、计算机断层摄影（computed tomography，CT）成像和超声（ultrasound）成像五大类。 活体成像技术是在不损伤动物的前提下对其进行长期纵向研究的技术之一。成像技术可以提供的数据有绝对定量和相对定量两种。在样本中位置而改变，这类技术提供的为绝对定量信息，如CT、MRI和PET提供的为绝对定量信息；图像数据信号为样本位置依赖性的，如可见光成像中的生物发光、荧光、多光子显微镜技术属于相对定量范畴，但可以通过严格设计实验来定量[1]。其中可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，称为结构成像，MRI介于两者之间。 1 可见光成像 体内可见光成像包括生物发光与荧光两种技术[2]。生物发光是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的光信号；而荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP）或荧光染料（包括荧光量子点）等新型纳米标记材料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而后者则需要外界激发光源的激发[3]。 1.1 生物发光：哺乳动物生物发光，一般是将萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达[4]。标记后的荧光素酶
光声成像与近红外光学成像的完美结合
1，光声成像结合近红外光学，两种成像模式的融合： 近红外超声成像技术的原理：当近红外脉冲激光照射到生物组织上,生物组织吸收光能量而产生热膨胀，在脉冲间隙释放能量发生收缩。伴随着热胀冷缩的过程会产生高频超声波，吸收光能量的多少决定了产生的超声波的强度。因为不同的组织对近红外光的吸收不同，于是就会产生不同强度的超声波，这个技术对于血管成像十分理想，因为血红蛋白是近红外超声成像内源性的造影剂。利用这个技术，在肿瘤学的研究中可以用来区分正常组织和病变组织（因为癌症组织的血管十分丰富）。另外，光声成像技术检测的是超声信号（该技术克服了纯光学成像技术在成像深度与分辨率上不可兼得的不足），反映的是光能量吸收的差异（补充纯超声成像技术在对比度和功能性方面的缺陷），结合近红外光学和超声这两种成像技术各自的优点，能实现对组织体较大深度的高分辨率、高对比度、高灵敏度的结构成像和功能成像的结合，并且能对感兴趣区域（肿瘤部位）做断层成像，效果要优于小动物CT。并且近红外成像由于其穿透力较深和组织背景低等特点，特别适合于体内的成像；并且该系统所配备的近红外实时成像系统，可实时指导小动物乃至大动物的手术操作，在造影剂的辅佐下，可完成靶向部位的探测成像，指导手术的细微操作。因此，该成像平台不仅可以完成无标记的组织结构和功能成像（光声部分），又可在造影剂的增强效果下完成手术的导航（近红外光学部分），是科研定量研究和转化医学的结合产物。近红外超声成像平台是近年来发展起来的一种无损医学成像方法，它结合了纯光学成像的高对比度特性和纯超声成像的高穿透深度特性，可以提供高分辨率和高对比度的组织成像。并可对组织进行3D定量分析，可完成多波长激发的断层扫描，可实时指导动物模型的手术操作过程，它是近几年来新兴的无损医学成像方法，也是动物模型研究中不可或缺的工具之一。 目前应用近红外超声技术的文章多在国际前沿杂志上发表，如nature等，它代表了新型的小动物成像发展的趋势，也给小动物成像带来了技术上的革新。所以能够购买此平台将会大大提高科研技术水平，缩短与国际领先实验室的技术差距。 近红外光学部分在染料、探针或造影剂的选择上与光声成像是兼容的，因为光声成像的波长就是在近红外区域，所以从实验设计上来讲，就能够做到完全与光声成像同步。不需要设计和增加额外的探针或造影剂，就能够实时同步确证的实验，从而节约了研究成本，也能够确保数据对比的可靠性。 近红外光学部分具有实时光学成像的特点，可以持续对研究对象进行成像并录制成连续动态的电影，观察探针或造影剂在体内分布的时间分布。这种实时成像同时还具有开放的特点，即不需要专业暗室，动物也不需要进行麻醉，只要将近红外光学探头对准动物即可。这种简单易用的操作，不需要特殊试验条件的特点使得近红外光学更具有较强的实用性。由于它具有实时成像、实时录影的特点，因此对于某些吸收较快、清除较快的探针具有特别重要的现实意义。任何一个时间段的荧光信号变化都能够被完全捕获下来，不会漏掉某
专家解答体内荧光成像技术难点
专家解答体内荧光成像技术难点 1.如何解决组织吸收问题 来自斯坦福大学放射学系助理教授Jianghong Rao领导的研究小组在进行“Examining protease involvement in tumor metastasis and cell migration”（肿瘤转移与细胞迁移过程中涉及的蛋白酶）这一项研究中遇到了一个难题：利用标准的荧光分子标记观测深部组织，激发荧光的光源必须能穿透具有强吸收力和光散射的组织，并且当标记分子发出光时，也要能通过同样的组织块，从而被检测到。 为了解决这个难题，研究人员采用了一种称为生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）的方法进行组织成像。不同于利用生物体外激发光源的能量转移方法，BRET主要依赖于生物发光的荧光素酶来提供荧光标记需要的能量转移。一般而言，进行BRET实验的研究人员是将与荧光素酶与荧光蛋白相交联，后者会吸收生物荧光，并重新发出光，但是由于这些BRET交联物的光仍然有大部分会被吸收和散射掉，因此剩下的信号依然很弱。 Rao改进了这一方法，他将荧光素酶交联在quantum dots (QDs)，而不是荧光蛋白上，这就将发出的光线变成了依然是长波长，但吸收和散射不强的光。为了能对深部组织进行成像，Rao等人又将luciferase-QD这个结构连接上了一个配体——这个配体与目的分子相连。这样当将底物，复合体（包括荧光素酶的荧光基团）注入小鼠的尾静脉的时候，BRET标记就能发出两种特殊的光：蓝色的生物荧光和红色的quantum-dot光，这样就能更清楚的观测组织。 这里Rao用于解决组织吸收问题的是一类新型的荧光探针，即量子点Qdot或称为半导体纳米晶体，所谓Qdot，指的是准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100纳米(nm)以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应(quantum confinement effect)特别显著。 这种纳米材料对于体内光学成像来说有着得天独厚的光学特点，这就是吸收性高、量子产量高、发射谱带窄、斯托克司频移大以及光褪色抗性强等，能够发射不同波长光谱，可以为单一波长所激发，适用于在一个实验中检测多靶点，因此非常适合活细胞成像和动态研究，甚至有人认为这种纳米荧光是纳米技术的真正代表，给荧光技术带来革命性的突破。 其具体特点如下： ·QDs的发射谱单一而且很“窄”。其半峰宽（FWHM）大都在40nm以下，更好的可以达到30nm甚至十几个nm，因此，QDs作为探针，可以很方便的区别于背景信号或者其它探针的信号。 ·QDs的激发谱很宽，可以在低于发射谱的广泛区间内任意选择激发波长。这个属性使得对设备（光源）的选择变得更加方便，而不必受限于特殊激光器。QDs的这个特点还可以让我们在同一固定激发波长下，同时激发不同颜色的QDs，从而使需要实时观测多种目标分子运
多功能荧光成像仪
多功能荧光成像仪 一、技术参数 1.设备用途： 采集化学发光（chemiluminescence）、比色（colorimetric）、荧光（fluorescence）及Stain-Free免染成像等核酸凝胶、蛋白凝胶、印迹膜等的数字图像，并对获得的图像进行数据分析。 2.技术规格： 2.1硬件功能 *2.1.1:功能涵盖：化学发光，光密度成像，荧光成像，Stain-Free免染成像等， 2.1.2：CCD检测器：增强型超冷CCD检测器，分辨率6.1M pixel（2,758x2,208） 2.1.3:12.1英寸触摸屏控制，支持多点触控功能（2点） 2.1.4:425nm处绝对Q/E（光电转化率）值：70％，绝对Q/E峰值：75%@525nm 2.1.5:CCD暗电流：0.002 e/p/s；CCD读出噪音：6 e-rms，提供弱光成像所 需 2.1.6:使用f/0.95快速对焦镜头，提高进光量的同时完成自动聚焦 2.1.7:自动优化曝光功能，所有成像过程均保持自动对焦 2.1.8:16bit数据采集（65,536灰度级，4.8OD），所有样品动力学范围>4个 数量级 2.1.9智能样品托盘技术，自动识别插入的样品盘类型，选择成像功能 2.1.10三种样品托盘设计：Chemi/UV/Stain-Free样品盘（化学发光、紫外和 免染样品成像）；白光样品盘（将透射紫外转换为透射白光，考染、银染及其他蛋白成像）；蓝光样品盘（SYBR?等荧光染料） 2.1.11:光源：反射白光，透射紫外，透射白光（可选），透射蓝光（可选） 2.1.12:滤光片转轮位置：8位（5色荧光、标准滤光片、平场校正、化学发 光） 2.1.13:紫外光源：302nm *2.1.14:最大成像面积16.8 x 21 cm
小动物活体成像技术的原理及操作方法
活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因（Luciferase）标记细胞或DNA，而荧光技术则采用绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等荧光报告基因和FITC、Cy5、C
2. 生物发光成像 活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放。然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子，成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。 生物荧光实质是一种化学荧光，萤火虫荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长广泛的可见光光子，其平均波长为560 nm(460—630 nm)，这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。在哺乳动物体内血红蛋白是吸收可见光的主要成分，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；水和脂质主要吸收红外线，但其均对波长为590—800 nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长超过600 nm的红光虽然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被高灵敏的CCD检测到。 生物发光成像的优点可以非侵入性，实时连续动态监测体内的各种生物学过程，从而可以减少实验动物数量，及降低个体间差异的影响；由于背景噪声低，所以具有较高的敏感性；不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察；此外还有无放射性等其他优点。 然而生物发光也有自身的不足之处：例如波长依赖性的组织穿透能力，光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性也不尽相同，其中血红蛋白是吸收光子的主要物质；由于是在体外检测体内发出的信号，因而受到体内发光源位置及深度影响；另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物，且底物在体内的分布与药动力学也会影响信号的产生；由于荧光素酶催化的生化反应需要氧气、镁离子及ATP等物质的参与，受到体内环境状态的影响。 二、小动物活体成像 1. 制作动物模型 可根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞或组织。在建模时应认真考虑实验目的和选择荧光标记，如标记荧光波长短，则穿透效率不高，建模时不宜接种深部脏器和观察体内转移，但可以观察皮下瘤和解剖后脏器直接成像。深部脏器和体内转移的观察大多选用荧光素酶标记。 2. 活体成像 小鼠经过常规麻醉（气麻、针麻皆可）后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯（明场）拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下（暗场）拍摄由小鼠体内发出的特异光子。明场与暗场的背景图叠加后可以直观的显示动物体内特异光子的部位和强度，完成成像操作。值得注意的是荧光成像应选择合适的激发和发射滤片，生物发光则需要成像前体内注射底物激发发光。
菁染料及其功能化的纳米材料在生物分析和近红外荧光成像方面的应用研究进展
Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2016, 6(4), 109-115 Published Online November 2016 in Hans. https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,/journal/aac https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,/10.12677/aac.2016.64017 文章引用: 黄红香. 菁染料及其功能化的纳米材料在生物分析和近红外荧光成像方面的应用研究进展[J]. 分析化学 Research Progress in Cyanine Dyes and Their Functionalized Nanocomposites Used for Bioanalysis and Near-Infrared Molecular Fluorescent Imaging Hongxiang Huang Department of Macromolecular Science of Fudan University, State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers, Shanghai Received: Oct. 11th , 2016; accepted: Nov. 1st , 2016; published: Nov. 7th , 2016 Copyright ? 2016 by author and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/f412909094.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Cyanine (Cy) compounds can produce strong fluorescent emission in the near infrared region after radiation and be easily modified with various substituents, thus they have been recently widely used as fluorescent probes to bind with bio-molecules, cells and tissues. The as-prepared lumi-nescent materials have provided a facile route for the bioanalysis, molecular fluorescent imaging and clinicopathologic analysis, especially for the tumour diagnosis and treatment. In this work, we reviewed the latest achievement of applications of several well-known cyanine derivatives such as Cy3, Cy5, Cy7, Cy3.5, Cy5.5, and their bio-nanocomposites produced with inorganic nanoparticles as luminescent probes in the fields of bioanalysis and near infrared molecular imaging. Keywords Cyanine, Bioanalysis, Near Infrared Image, Bio-Nanocomposite, Fluorescence 菁染料及其功能化的纳米材料在生物分析和 近红外荧光成像方面的应用研究进展 黄红香 Open Access
植物叶绿素荧光成像技术在国内的应用
植物叶绿素荧光成像技术在国内的应用（第四期） 植物叶绿素荧光成像技术作为最早实用化的叶绿素荧光成像技术，是目前世界上最权威、使用范围最广、种类最全面、发表论文最多的叶绿素荧光成像技术。涵盖了从叶绿体、单个细胞、微藻到叶片、果实、花朵，乃至整株植物和植物灌层，几乎可以测量所有的植物样品，甚至包括含有叶绿素的微生物和动物。 叶绿素荧光成像技术最早在21世纪初引进到国内，但一直到2010年后国内的科学家才在国际交流中逐渐发现这项技术的巨大价值，在短短数年中也利用这一技术发表了几十篇高水平SCI 文献。本期主要介绍目前叶绿素荧光成像技术在国内的应用情况。 一、 植物光合生理研究 叶绿素荧光可以直接反应植物光系统的生理状况，因此从叶绿素荧光技术发明之初，就被用于各种植物光合生理研究。 山东农科院使用FluorCam 叶绿素荧光成像技术研究了小麦旗叶与外露花梗光合能力的差异[1]。研究中发现在小麦生长前中期，旗叶与外露花梗的最大光化学效率Fv/Fm 和量子产额ΦPSII 基本相同。但在生长后期，旗叶的光合能力显著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗叶（图1）。这证明了在生长后期的灌浆期，花梗对维持籽粒的生长更为重要。 之后，他们又研究了小麦叶片和颖片季节衰老过程中以及颖果发育过程中光合特性的变化[2；3，图2]。 图2. 不同生长期小麦叶片和颖片的最大光化学效率Fv/Fm （A ）、量子产额ΦPSII （B ）和非光化学淬灭NPQ （C ）的变 化 图1. 不同生长阶段的旗叶（A ，C ）和外露花梗（B ，D ）的Fv/Fm （A ，B ）和ΦPSII （C ，D ）典型叶绿素荧光成像图
化学发光、荧光、可见光成像系统的技术...-中山大学(精)
项目编号:中大招（特）[2011]023号 项目名称：中山大学公卫学院激光共聚焦扫描显微镜采购项目 附件: 激光共聚焦扫描显微镜，1套，要求如下： （一）光学共聚焦扫描系统： 1) 检测成像通道：物理通道数5个，其中荧光通道4个，透射光DIC通道不少于1个。 2) 荧光检测通道均可使用狭缝光谱扫描技术，可进行400～800nm连续无极的光谱扫描； 3) 荧光检测器的要求：有1个荧光通道采用磷砷化镓（GaAsP）超高灵敏度探测器；对极弱荧光信号或者单分子荧光信号可进行检测。另外，荧光检测器提供2个的大靶面探测器（PMT）。 4) 采用单针孔, 各通道扫描图像无错位问题； 5) 激光能快速的双向来回扫描，在扫描完的回程中可进行图象采集，便于快速的FRAP试验； 6) 自动焦面控制系统，通过850nm的LED光对焦面进行实时自动校准； 7) 扫描图像分辨率（不管是二维还是三维图象）均可达到8192X8192以上，线扫描速度可达2800线/秒； 8) 扫描镜：扫描镜采用X2Y三镜扫描； 9) 扫描旋转：自由旋转200°，可在扫描过程中任意旋转； 10) 扫描视场：22mm； 11) 扫描速度: 5帧/秒(512x512 象素)； 12) 共聚焦分析软件系统能控制快速制冷CCD，在不开激光的情况下，共焦软件系统能与CCD、显微镜、快速外置滤块转盘、荧光光源、CO2系统组成完整的活细胞观察系统； （二）激光器及相关配置： 由AOTF声光调制器控制所有激光谱线: Ar：458/476/488/514 nm 65mW，有4条谱线； HeNe: 543 nm 1mW， HeNe: 633 nm 10mW。 近紫外激光器：405nm 50mW （三）智能型倒置显微镜主机配置： 1) 采用全自动研究级倒置荧光显微镜。由计算机的激光共聚焦扫描软件系统全自动控制；含明场、荧光、DIC、等基本功能 2) 显微镜通过一个智能外置控制器控制，快速方便，无需接触显微镜，减少样品的污染机会和显微镜震
小动物活体成像技术的原理及操作方法
小动物活体成像技术是采用高灵敏度制冷CCD配合特制的成像暗箱和图像处理软件，使得可以直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。实验者借此可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。 由于具有更高量子效率CCD的问世，使活体动物体内光学成像技术具有越来越高的灵敏度，对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高；另外，该技术不涉及放射性物质和方法，非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高、实验成本低等特点，在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。 一、小动物活体成像概述 1. 荧光发光成像 荧光成像的标记对象较为广泛，可以是动物、细胞、微生物、基因，也可以是抗体、药物、纳米材料等。 常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(DsRed)及其它荧光报告基团，标记方法与体外荧光成像相似，荧光成像具有费用低廉和操作简单等优点。同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在体内比蓝绿光的穿透性效率高，近红外荧光为成像观察的最佳选择。 虽然荧光信号远远强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。虽然许多公司采用不同的技术分离背景光，但是受到荧光特性的限制，很难完全消除背景噪音。这些背景噪音造成荧光成像的灵敏度较低。 尽管目前大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。但是，荧光成像有其 方便，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和观察小分子体内代谢方面也得到应用。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法。 例如利用绿色荧光蛋白和荧光素酶对细胞或动物进行双重标记，用成熟的荧光成像技术进行体外检测，进行分子生物学和细胞生物学研究，然后利用生物发光技术进行动物体内检测，进行活体动物体内研究。荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。考虑到不同荧光物质的发射光 谱EX (excitation spectrum )和激发光谱EM( emission 8pectrum )的不同，要选择对应的激发和发射滤片。常用荧光蛋白和荧光染料的激发和发射波长见表1。 EM(mm表1常用荧光蛋白和荧光染料的激发和发射波长 EX(m m) GFP480520 dsRed/RF 530600 P Cy5630680 630700 Cy7700780 2. 生物发光成像