荧光定量PCR详细流程和问题解析

荧光定量PCR详细流程和问题解析
荧光定量PCR详细流程和问题解析

荧光定量PCR详细流程和问题解析

普通PCR与荧光定量PCR技术区别?

简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR 技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。

前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。

Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择?

从实验成本来讲,Sybr Green是最好的,基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可,其信号强度也很好,还可以进行融解曲线分析等,但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测,另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果,当然也有一些技术解决这些问题,后面会讲到。对于研究人员来讲,如果需要检测的基因很多,而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求,则Sybr Green是最好的选择。

如果需要进行多通道实验,即在一个反应管中进行2种或以上的反应,则要选择其他的方法,最常用的是Taqman、Molecular beacon,这两种都是探针的方式,由于增加了探针的特异性,因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线,不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术,以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高,有时设计的探针并不合适,有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题,据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低,但只是据说。

另一种值得一提的是LUX探针,它也可进行多通道实验,但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能,因此只能是一种折中的方案,

如果不考虑多通道实验,则不如Sybr Green法

选择单通道实验还是多通道实验?

这是要根据实验需要来选择的,如果有一个、两个或是三个基因要进行比较,并用看家基因进行对照,可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多,一是条件的优化比较麻烦,即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行,并且效率都要比较高,另一个困难是要求相互之间没有干扰,因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时,因为共用核苷酸等资源的原因,会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些,即一个基因进行多样本比较,用看家基因进行对照。

可以看出,如果单通道实验可以解决问题,就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道,就是有更多的通道,实验条件的优化也是足够麻烦了。

双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难?

对于反应条件的优化,可通过两个单独实验的标准曲线来优化,主要是复性温度,可用PCR仪的温度梯度功能来选择,然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰,则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较,如果差别不大,则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题,可以通过降低引物浓度的方法来实现,即primer limited,在一般的PCR反应中,引物的浓度是足够高的,基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽,在优化引物浓度时,用不同的引物浓度进行实验,找到不影响反应的C值的最低引物浓度。这样在实际反应中,模板数高的基因在引物耗尽后,反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。

引物设计中的几个注意事项

1、引物设计最好用相关的软件来进行设计,考虑引物自身回折、错配、引物二

聚体、复性温度、产物变性温度等问题,其中产物的变性温度是大家不太关心的问题,但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链,会严重影响实验结果。

2、引物所设计的片断一定要有足够的特异性,选择好片段后,最好到互联网中进行相关的搜索,看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等,如果有,则可选择特异性更高的区域。

3、在进行mRNA表达量的定量,可以在引物设计时考虑基因组的污染问题,即在引物设计时让两个引物跨一个内含子,这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来,或因为片段过大而不能扩增

4、由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程,如果逆转录是用poly(T)作引物,则设计的片段尽量靠近poly(A),以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录,则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题

5、产物片段的大小:定量PCR一般产生片段都不大,不会超过600bp。Sybr Green 法一般选择250-600bp,过大会影响到PCR扩增的效率,过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开,但并不是绝对的。Taqman法的扩增片段都很小,几十或是100多,这是其原理造成的。Molecular beacon法对片段大小的要求不高,只要不是太长即可。

Sybr Green法的实验策略:

实验可分为三个阶段,即实验条件的优化、预实验和正式实验。

一、实验条件的优化阶段,这一阶段是最花时间的,

1、要找到一个阳性的模板,可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR 产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验,如果有普通PCR的实验条件,也可以此为基础进行实验。

2、扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小,以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因,有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对,不是自己想要的基因。当然,能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够,个别情况下会出来解键不充分的现象。

3、有了基本的PCR条件后,要将阳性模板进行倍比稀释,一般用10倍稀释。将

稀释的模板带上阴性对照,分成多份进行温度梯度实验,对复性温度进行优化,以找出复性温度范围,复性温度最好能满足以下条件:高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度,这样可以提高实验的稳定性,不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。

4、如果找不到合适的条件,如引物二聚体过多,可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化,然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO 含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。

二、预实验阶段

按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验,每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验,预实验的目的主要有两个,一是了解样本的模板浓度范围,如果有样本的模板浓度在标准曲线之外,如过高或过低,则可能要对标准曲线进行重新优化,当然,如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少,直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响,如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同,则表明没有抑制物的影响,如果不同,如原倍结果为零,而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性,则表明样本中PCR抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。

有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的,也许有更多用户没有进行这样的实验,得到了错误的结论。因为样本RNA的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质,清洗不干净就会影响到定量PCR反应。

三、正式实验阶段

然后就可以进行正式实验了,只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释,计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了,个别样本中离群的数值可以删除。

Sybr Green法的注意事项

1、最好按照上面提到策略进行实验,以免造成不必要重复实验,从而降低实验

成本

2、 Sybr Green I一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍,最终的使用浓度为4000-10000分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀释倍数不同,可通过实验来证明,但高浓度的Sybr Green I肯定会影响PCR反应。另外用水稀释后的Sybr Green I保存的时间很短,一般1周后就不能用了。DMSO似乎反复冻融会影响性能,但原因不明。

3、在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果,特别是引物二聚体很多时,可以考虑更换引物,因为引物成本低,而优化实验成本很高。

4、当有少量引物二聚体影响荧光结果时,可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响,如将读板时的温度提高到82度,此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应,消除引物二聚体的影响也没有用。

5、大家都知道进行绝对定量需要标准曲线,有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了,可以通过2ΔΔC(t)来计算,但这一计算是有条件的,即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%,可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC(t)来计算了。这是错误的,会得到错误结论。

6、无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒,最好买够试剂,以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂,由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别,如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等,可能会影响到实验结果,甚至要重新进行实验条件的优化。

7、不要在管盖上写字,原因很明显,但有些用户习惯了写字,后来再擦掉,也会对实验有些影响。

8、最好使用高质量的PCR管,低质量管的管间差可能会很大。

9、每次实验一定要有阳性对照和阴性对照,以免出现问题时找不到原因。

10、在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低,理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。

其他方法也可以采用类拟的策略,以节约成本,提高效率。

想到的内容就这些了,希望大家多批评指正。

反应体系的建立及优化

来源:作者:发布时间:2008-10-17

1. SG浓度:

终浓度1:5,000-1:100,000,一般为1:10,000—1:70,000

2. Primer浓度:

终浓度50nM-300nM

固定摸板浓度的梯度实验

不加摸板的对照实验(NTC)——有无非特异信号

熔解曲线的分析——是否单峰

建议使用HPLC纯化的引物

3. MgCl2浓度

降低MgCl2浓度以减少非特异性产物

最低可至1.5nM

同时做梯度实验和NTC对照

4. 反应温度和时间参数

反应温度参考所用酶的种类

退火温度使用温度梯度功能优化

反应时间与常规PCR类似,扩增片断一般为200-300bp 5. TaqMan探针

引物、探针设计:

首先选择探针序列

探针的Tm值为68-70度,长度不应超过30碱基

探针的5’端不应是G,G有可能会淬灭荧光素

引物应尽量靠近探针,扩增片断不超过400bp,通常为80-150bp

引物的Tm值为59-60度,长度约20碱基

避免引物、探针之间的二级结构

委托合成公司设计

使用辅助软件

确定反应参数

一般为两步法,94度10-20s

60度30-60s (Taq酶的5’外切酶活性在60度最强)

通过温度梯度优化退火温度

三步法, 72度45s

优化引物探针浓度

目标:最高的信号/背景比

最小的Ct值

引物浓度:50nM-900nM

探针浓度:50nM-250nM

通过多次实验确定各自的浓度和比例

Real time PCR经验从RNA的提取到PCR 一:引物的设计

引物的设计对于这个实验至关重要,因为real time pcr的检测灵敏度比较高,所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道,还有几点必须注意:

1,引物的错配率(引物错配形成引物二聚体,但是SYBR照样能嵌入进去,结果导致实验结果的误差很大,重复性也不好)。

2,引物的特异性一定要高(不像常规PCR,引物同源性不高,只要两条产物的片段长度相差足够大,在电泳的时候能够区分开就可以。real time PCR只有在熔解曲线的时候能分开,所以这就造成整个实验结果误差很大,不可信)。

3,引物设计要跨内含子,不能在一个外显子上(我们的实验是以cDNA为模板来扩增的,如果有DNA污染的话,因为DNA上含有分子量很大的内含子,不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用)。

4,引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度,方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大,就得分开做,浪费模板,浪费管家基因,所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致,这样就不用每次查退火温度,且对整个实验有利。

5,注意引物设计好后的产物长度。REAL TIME PCR的最佳产物长度在150-250kb左右(书上说这样可以增加荧光的敏感度,减少实验误差,但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大,SYBR嵌入的越多,这样才能够保证最后的荧光值比较可信)。

6,不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大,就不能使用delt,deltCt法来比较基因表达量的高低。

二:模板的要求

归根到底,REAL TIME pcr想要检测的是目的基因表达量的高低,所以对整

个实验过程中模板的质量要求必然很高,我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点:

1,用TRIZOL提取RNA有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的RNA,所以我们在提取前必须知道细胞数(一般6孔板中两个孔就可以提取出RNA)。

2,加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层(中间层为基因组DNA,对上机做REAL TIME PCR很不利,会导致起始荧光值很高,无法跑出完整的扩增曲线)。

3,提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉,但是不要过分挥发。(乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有影响。在乙醇存在的情况下,DNA更加难溶,这就是醇沉的道理。但是过分挥发,RNA又不溶于水,会造成后续反转录量不高)。

4,反转录过程的操作尽可能在冰上。我们用的是OLIGO DT18,为了尽可能的消除RNA之间的二聚体,我们将RNA和OLIGO DT18在一起70度变性10分钟后,马上冰浴2分钟,再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一个小时完成延伸过程(也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟,再加入OLIGO DT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在变性完再加OLIGO DT18时,加的比较晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚体,导致前面的变性没有意义)。

5,反转录完后将cDNA -20度保存,尽可能不要反复冻融(可以以10UL为一个单位来分装cDNA)。

6,在加样的过程中需要特别注意:(1)最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上,这样可以消除不同管之间引物浓度的差异。(2)最后加模板的时候需要一把很准确的移液器,以便确保每次加进去的样一致,注意不要沾管壁(大

部分人说需要混匀,但是我认为只要确保加入到体系中就可以,不用刻意混匀。因为我们在反应前有个95度变性,大家可以想象一下,在95度时候体系内的分子运动是很剧烈的,完全可以混匀),有条件的话可以加ROX,来消除不同的加样体系来造成的误差。(3)加样完毕后最好离心一下,防止沾璧。

三:上机操作

在做整个实验之前,应该对实验有个整体的计划,每个管中所加的物质要有计划。在程序上编好号码,选好需要进行的熔解曲线(因为机器刚开始是默认为不进行熔解曲线,切记)。可以选择两步法(产物长度较小,退火和延伸都在60度完成),也可以选择三步法(产物较大,只能分为3步,且应该根据产物的长度来确定延伸时间,因为TAQ酶的延伸速度最少也在50BP/S,因此可以换算出所需要的延伸时间)。扩增完毕后进行熔解曲线,这个是必须要有的,因为这样才能鉴定你产物的特异性和有无引物二聚体。如果前几次做的话最好在做完REAL TIME PCR后将产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳,来确定自己的判断。

四:分析数据

用的比较多的是用双DELT法相对定量,而绝对定量则必须要进行标准曲线的制备,需要对这个基因构建质粒,克隆分离。所以我们对基因表达量高低用双DELT 法(前提是扩增效率要一致)。熔解曲线观察,如果同一基因的熔解曲线不一样,则造成结果不一致,重复性很差,因此要多摸条件,尽可能使熔解曲线一致。

实验步骤:

1.设计引物,溶解成为10mM的浓度。

2.提取RNA,反转录成CNDA

3.常规PCR以实验所得模板扩增看家基因40个循环,电泳看产物多少。如果少,则不能进行REAL TIME PCR操作。

4.编写好程序,加样,上机。

5.分析结果。

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是:1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA,或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得,大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测,免除了标本和产物的污染,且无复杂的产物后续处理过程,高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法: 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合,同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合,产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合,对DNA模板没有选择性,所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下,本法是 一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法,因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测,如果存在DNA污染时,要用DNase I进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解,建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀,37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制: 1)称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中,向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水,放微波炉里溶化。 2)待冷却到60摄氏度左右时,加入1ml甲醛,摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。 2.取各个RNA样品4μl,加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀,加入变性胶加样孔中。3.120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察,照相保存。 4.RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带,无DNA条带污染。 四.RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位:200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断,还是研究药物对基因表达水平的影响,或者监控药物和疗法的治疗效果,定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物,一方面提高了灵敏度,另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定CT值,从而根据CT值确定起始DNA拷贝数,做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同,定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化,得到的结果是百分比;绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同,荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言,探针杂交技术在原理上更为严格,所得数据更为精确;荧光染料技术则成本更为低廉,实验设计更

为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同,是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正,以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因,这一点在实践中往往被轻视或忽视,需要着重强调。当然,与定性实验一样,定量PCR也要设立阴性和阳性对照,以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确? 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程,但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多,扩增规模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求,PCR的效率越来越低,产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后,PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用,不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制。所以,即使是重复实验,各种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的,波动很大(图1)。

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介 一.实时荧光定量PCR的基本原理 理论上,PCR过程是按照2n(n代表PCR循环的次数)指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中,随着反应的进行由于体系中各成分的消耗(主要是由于聚合酶活力的衰减)使得靶序列并非按指数方式扩增,而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法(利用EB染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物(mRNA)的起始拷贝数,实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中,靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号,实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle(循环),“t”代表检测threshhold(阈值),其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数;也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数,y代表Ct值)。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响,因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量,这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度),可以看到Ct值具有很好的重复性,而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外,采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的,当实验完成后即可获得定量结果,

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。 2. 荧光域值(threshold)的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2)SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1.几种传统定量PCR方法简介: 1)内参照法:在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在PCR 产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。2)竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3)PCR-ELISA法:利

实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤

实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件,然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时,请输入: 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中,单击Target Name列中的一个单元格,并输入: c. (可选)单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中,单击Sample Name列中的一个单元格,并输入: c. (可选)单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. (可选)定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中,单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列,以便为该生物学平行测定组添加注释。 注:实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。

q-pcr结果分析报告

摘要: 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2-△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法,即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导,假设及其应用。另外,在本文中我们还介绍了两种2-△△CT衍生方法的推导和应用,它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词:反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR (RT-PCR )是基因表达定量非常有用的一种方法(1 - 3 )。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术(4 ,5 )。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种:绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数;相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道(6 - 9 ),包括已发表的两篇研究论文(10,11 )。在有些情况下,并不需要对转录本进行绝对定量,只需要给出相对基因表达差异即可。显然,我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2-△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化:2-△△CT公式的推导,以及实验设计,有效性评估在Appl ied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859)中有介绍。用2-△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道(5,6)。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外,本文还介绍了2-△△CT两种衍生方法的推导和应用,它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。 1. 2-△△CT方法

荧光定量PCR实验指南(一)

荧光定量PCR实验指南(一) 一、基本步骤: 1、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比对; 2、引物、探针的设计; 3、引物探针的合成; 4、反应体系的配制; 5、反应条件的设定; 6、反应体系和条件的优化; 7、荧光曲线和数据分析; 8、标准品的制备; 二、技术关键: 1、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比对; 从https://www.360docs.net/doc/f816488321.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种:一为打开某个序列后,直接点击“save”,保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后,再打开DNAstar软件中的Editseq 软件,点击“file”菜单中的“import”,打开后点击“save”,保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件,点击“file”菜单中的“open entrez sequence”,导入后保存为“.seq”文件,保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件,点击“sequence”菜单中的“add”,选择要比较的“.seq”的所有文件,点击“add”或“add all”,然后点击“Done”导入要比较的序列,再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列,所有红色的碱基是不同的序列,一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定

比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因,可能分为几组(contig),若想全部放在一组中进行比较,就调整“project”菜单下的“parameter”,在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80,可调低即可。再选择几个组,点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下,尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因,会出现重复序列,碱基的缺失或插入,要对“contig”的序列的排列进行修改,确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后,点击“save”保存即可。分析时,主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色,对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点: 序列选取应在基因的保守区段; 扩增片段长度根据技术的不同有所分别: sybr green I技术对片段长度没有特殊要求; Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp; 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对; 避免引物自身形成环状发卡结构; 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 (一)定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 (二)实时原理 1、常规PCR技术: 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术: 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量? 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念: (1)扩增曲线: (2)荧光阈值:

(3)Ct值: CT值的重现性:

5、定量原理: 理想的PCR反应:X=X0*2n 非理想的PCR反应:X=X0 (1+Ex)n n:扩增反应的循环次数 X:第n次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1)确定未知样品的C(t)值 2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

7、DNA的荧光标记: 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一:SYBR Green法 (一)工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时,DNA双链分开,无荧光 4、复性和延伸时,形成双链DNA,SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测 2、Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 (二)应用范围 1、起始模板的测定; 2、基因型的分析; 3、融解曲线分析:可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer 的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 (三)优点及缺点 优点:对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA;使用方便;不必设计复杂探针;非常灵敏;便宜。 缺点:容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件;对引物特异性要求较高。

实时荧光定量PCR全方位解析

实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值(threshold)的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下: 1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析

荧光定量PCR的原理、方法及结果分析 而实时荧光定量PCR技术,顾名思义,就是在PCR的基础上加入荧光基团,通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程,最后通过对未知模板进行定量分析的方法。 目前,实时荧光定量PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去十几年中,该方法迅速流行,涉及科学的多个领域,包括农业、环境、工业和医学研究。 实时荧光定量PCR的应用 目前,qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业,应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等,除此之外,还包括: ● 基因扩增 ● 扩增特异性分析 ● 基因定量分析 ● 基因检测 ● 基因分型 ● SNP分析

● RFLP多态性分析 ● 单/多基因表达研究 ● 高通量基因表达谱研究 …… 实时荧光定量PCR的常用方法 染料法 荧光染料可与双链DNA结合,每个循环的延伸阶段,染料掺入双链DNA 中,其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时,其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时,该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合,发出荧光,从而干扰对特异性产物的准确定量。 常用的染料为SYBR Green I,各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进,也推出了很多新的染料供大家选择。 Promega采用新型荧光染料BRYT Green? Dye,对qPCR反应没有抑制作用,与双链DNA结合后荧光信号更强. 探针法 在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸:5’端标记一个报告荧光基团,3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的

实时荧光定量PCR具体实验步骤

以下实验步骤仅供参考: 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下: RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为: 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。 2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS,pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板

实时荧光定量PCR操作步骤

实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考: 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心乙醇(75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下: RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为: 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。 2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS,pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量pcr步骤: 荧光定量PCR 实验步骤:①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:RNA溶于40 μl DEPC

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA 沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项

相对定量方法实际操作 (三种常用方法) 本人用的是相对荧光定量PCR法,在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。实验进行很多次,感受颇深,同时遇到了一些问题:扩增效率、标准品选择(及赋值)、标准曲线、重复性等问题,希望有同行朋友一起探讨和指教。 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程(RG6000软件设置) 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线,通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近;将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增,分列在两页中 公式: P1 P2 相同的样品在两页里命名成相 同的名称,并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入,并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看对照组目的 基因平均Ct 对照组看家 — 待检样品目 ——

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法,其最大特点 是,当优化的体系已经建立后,在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线,而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是,每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致,而并非真 实扩增情况的反映,这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前,在预实验中,必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息,如果两组标准曲线的斜率,即M值的差小于 0.1,那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量 分析。反之,如果M差值大于0.1,就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种,一是优化实验,使两组标准曲线的斜率差值小于0.1,二是换用其它的相对定量方法。 应用实例:

荧光定量PCR数据分析

利用实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量 METHODS 25, 402–408 (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2-△△CT Method Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1 *Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534 摘要: 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2-△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法,即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导,假设及其应用。另外,在本文中我们还介绍了两种2-△△CT衍生方法的推导和应用,它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词:反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR (RT-PCR )是基因表达定量非常有用的一种方法(1 - 3 )。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术(4 ,5 )。实时定量 P CR 的数据分析方法有两种:绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数;相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道(6 - 9 ),包括已发表的两篇研究论文(10,11 )。在有些情况下,并不需要对转录本进行绝对定量,只需要给出相对基因表达差异即可。显然,我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2-△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化:2-△△CT 公式的推导,以及实验设计,有效性评估在Applied Biosystems User Bulleti n No.2(P/N4303859)中有介绍。用2-△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有

荧光定量PCR全攻略

荧光定量PCR完全攻略 1、什么是定量PCR? 以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 2、定量PCR定量的理论依据是什么? 特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,则无论原来样品中起始模板含量多少,最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果:Y=X×2n其中Y代表扩增产物量,X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数;理论上PCR扩增效率为100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈2的倍增长;实际应为:Y= X(1+E)n,其中E 代表扩增效率:E = 参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X 在1~105拷贝、循环次数n≤30时,E 相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30次),E值逐渐减少,Y 呈非固定的指数形式增加,最后进入平台期。 3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么? PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量,使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践,研究了相对准确的定量PCR方法,即荧光定量PCR。 PCR扩增通式:① T n=T0(1+E)n ② T n=Tn-1(1+E)n 注:[0

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR: 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。 原理: 所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法: 在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性) 2.TaqMan探针法:

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单,提供待检基因相关信息; 2.签订技术服务合同,支付预付款(30-50%); 3.设计合成定量PCR引物(或客户提供文献引物委托本公司合成); 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录; 5.PCR预实验,主要检测引物的特异性和扩增效率; 6.正式定量实验:对所有样品上机检测; 7.实验结果和数据分析,形成报告。 收费标准 优惠包干价:120元/样/基因(SYBRgreenI法,相对定量) (含RNA提取,反转录,引物合成费用,上机测试费用(3个重复);一个内参免费(内参3个重复) 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系

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