单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究

Glu2C ( Sequencing Grade, Roche App lied Science, 瑞士 ) ; 考马斯亮蓝 G2250购自上海蓝季科技发展 有限公司 ; 其他试剂纯度均为 AR级 。 1. 2 样品采集及稀土含量测定
样品采集自福建省漳州市南靖乐土亚热带雨 林自然保护区 , 采样地点位于东经 117°12′940″, 北纬 24°54′501″, 海拔 327 m。以随机方式采样 , 采集完整的金星蕨科新月蕨属单叶新月蕨的植株 以及根系周围的土壤 。
消解单叶新月蕨方法参照文献 [ 26 ] , 分为叶 、 叶柄 、茎 、根 , 105 ℃的条件下烘 24 h后分别准确 称取 0. 2 g, 加入 5 m l浓 HNO3 , 室温预消解 12 h, 然后加入 1 m l HC lO4 消解 ; 土样自然风干后 , 研 磨 , 过筛 , 使粒度控制在 100～120目范围 , 准确称 取 0. 2 g, 加入 5 m l浓 HNO3 , 1 m l HF室温预消解 12 h, 然后加入 1 m l HC lO4 消解 , 消解至溶液呈无 色或淡黄色 , 并将酸液蒸发至无白烟冒出 。最后用 2% HNO3 溶解根 、茎 、叶 、叶柄和土壤消解残渣 , 定容到 25 m l容量瓶中 , 用 ICP2M S测定稀土元素 的含量 。参照文献 [ 30 ]提取土壤中生物可利用态 稀土 , 准确称取 0. 8 g研细的土样 , 用 32 m l 0. 11 mol·L - 1 HAc作浸取剂 , 在 (25 ±0. 1) ℃的恒温振 荡器中连续振荡浸取 16 h, 离心后 , 取上清液 , 用
第 27卷 第 2期 Vo l127 No12
中 国 稀 土 学 报
JOURNAL OF THE CH INESE RARE EARTH SOC IETY
2009年 4月 Ap r12009
单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究
薛 云 1 , 杨利民 1 , 王秋泉 1, 23
(1. 厦门大学化学化工学院化学系 现代分析科学教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005; 2. 海洋环境科学 国家重点实验室 , 福建 厦门 361005)
称取适量叶片 , 加入液氮 , 低温下研磨至粉末 状 。用 pH 值为 6. 5, 含 50 mmol·L - 1 NH4 HCO3 , 1 mmo·l L - 1 PM SF, 1 mmo·l L - 1 EDTA , 1 mmo·l L - 1 SDS, 20 mmo·l L - 1 22巯基乙醇的蛋白提取液分 3次 充分研磨提取 。离心后 , 用冰乙醇沉淀上清液中蛋 白 , 缓 冲 液 溶 解 后 , 采 用 Superdex Pep tide 10 / 300GL 尺寸排阻层析柱纯化 (流动相为 pH7. 8 的 50 mmo·l L - 1 NH4 HCO3 ) , UV 在线监测多肽组分 , ICP2M S测定其中稀土含量 , 确定稀土含量最高的 多肽馏分 , 并收集该馏分 , 然后采用反相 ZORBAX Eclip se XDB 2C8色谱柱进一步分离纯化 , 流动相在 8 m in内乙腈 (ACN )从 3. 5%线性增加到 70% , 再 以 70%ACN 洗脱至 15 m in; 离线 ICP2M S检测 , 并 进行 MALD I2TOF2M S表征鉴定 。Biblioteka 290中 国 稀 土 学 报
27卷
结合多肽 ; B ruker Reflex III MALD I2TOF2M S (B re2 men, 德国 )用于稀土结合多肽的分子量及纯度鉴 定 ; B ruker ESQU IRE2LCTM 2IT2M S (B remen, 德国 ) 用于分析酶解片断 ; Herm le Z 36 HK型高速冷冻离 心机 ( Herm le, 德 国 ) 用 于 离 心 分 离 多 肽 ; Christ ALPHA122 LD p lus冷冻干燥机 (Christ, 德国 )用于 冻干浓缩稀土结合多肽 。
将纯化得到的单叶新月蕨稀土结合多肽用 G2 250法 [ 31 ]进行定量 。配制 0. 1 m g·m l- 1的牛血清白 蛋白 (BSA )标准溶液 ; 称取 0. 1 g考马斯亮蓝 G2 250, 溶于 50 m l 90%乙醇中 , 加入 85% (m /V )的
稀土氧化物 (纯度 > 99. 9999 % )购自中国科 学院长春应用化学研究所 ; 22巯基乙醇 、牛血清白 蛋白 (B SA , 纯度 ≥99 % )购自 Sigma (美国 ) ; 十二 烷基磺酸钠 ( SDS, 色谱纯 )购自 TC I(日本 ) ; 苯甲 基磺 酰 氟 酶 抑 制 剂 ( PMSF, 纯 度 > 99% ) 购 自 AM ESCO (美国 ) ; 异 硫 氰 酸 苯 酯 ( P ITC, 纯 度 ≥ 99. 0% )购自中国医药集团上海化学试剂公司 , 用 于氨 基 酸 标 记 ; 18 种 氨 基 酸 标 准 品 购 自 BDH Chem icals L td. Poole (英国 ) ; 经甲苯磺酰苯丙氨酰 氯甲酮 ( TPCK)处理的胰蛋白酶用于蛋白酶解 ( Se2 quencing Grade, Promega, 美 国 ) ; Endop roteinase
ICP2M S测定稀土元素的含量 。 1. 3 单叶新月蕨的 Nd3 +胁迫培养
虽然选用混合稀土进行胁迫培养实验更接近 于自然条件 , 但情况将会很复杂 , 不利于单叶新月 蕨富集特性的基础研究 。本研究采用单个稀土元 素 Nd对单叶新月蕨进行胁迫实验 , 首先考虑到 Nd的天然丰度较高 , 并且其具有较多同位素 , 便 于后续质谱的检测和鉴定 。将单叶新月蕨分别放 入含 0, 100和 500μg·m l- 1 N d3 +的 Knop 植物培养 液中 培 养 , 其 中 含 有 1000 μg·L - 1 Ca ( NO3 ) 2 , 250μg·L - 1M gSO4 ·7H2 O , 120 μg·L - 1 KCl, 2. 86 μg·L - 1 H3 BO3 , 0. 22 μg·L - 1 ZnC l2 , 0. 08 μg·L - 1 CuSO4·5H2 O , 0. 02 μg·L - 1 H2MoO4 , 0. 08 μg·L - 1 M nC l2 , 4μg·L - 1 FeSO4·7H2 O ( Fe2 + 转化为 Fe2ED2 TA ) 。为了补充植物生长所需要的磷 , 同时又要防 止稀土磷酸盐沉淀 , 采用 250μg·L - 1 KH2 PO4 叶面 喷施 。每 3 d 更 换 一 次 培 养 液 以 保 证 培 养 液 中 Nd3 +的浓度 , 培养时间为 4 周 。根据文献 [ 26 ]改 进的细胞分级提取方法 III, 对单叶新月蕨培养前 、 后的叶片细胞分级 , 分别得到脂类 、蛋白类 、多糖 类及组成细胞壁的纤维素和果胶 , 消解后用 ICP2 M S对每一部分中的稀土的含量及分布进行分析 。 1. 4 稀土结合多肽的提取纯化和鉴定
关键词 : 单叶新月蕨 ; 超富集 ; 多肽 ; 稀土 中图分类号 : O614. 33; Q946. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 - 4343 (2009) 02 - 0289 - 08
稀土元素的广泛使用造成潜在的环境和健康 风险已经日益引起人们的关注 [ 1, 2 ] , 尤其是稀土元 素日允许摄入量与农用安全性探讨已成为最新的 研究热点 [ 3, 4 ] 。稀土含量过高时 , 不论对植物的生 长还是对动物的骨骼 、脑部 、脏器和内分泌系统等 均具有潜在毒性 [ 5～8 ] 。事实上稀土元素 ( rare earth element, 简称 REE)类似于一般毒物 , 对生物体具 有 hormesis效应 [ 9, 10 ] , 即低剂量时表现促进作用 , 高剂量时表现抑制作用 。相关研究表明 , 轻稀土元 素的离子半径 (9. 6～11. 5 nm )与 Ca2 + (9. 9 nm )十 分接近 , 它很容易竞争 Ca2 + 在生物体内的结合位 点 , 特别是 La3 + 还具有“超钙离子 ”的别称 , 植物 缺钙症状可通过加入 La3 + 来缓解 [ 11～13 ] ; L a3 + 还可 以竞争结合到 PS2II中 Ca和 Mg的结合位点上来影 响光合 作 用 效 率 [ 14～16 ] 。此 外 , 稀 土 与 多 糖 [ 17 ] 和 DNA[ 18 ]等生物大分子的相互作用 、与细胞壁上的 蛋白通道或主动运载蛋白结合进而通过细胞壁进 入细胞内部 [ 19, 20 ]的研究也有报道 。近年来出现的 植物修复技术具有成本低 、不破坏生态环境 、不引 起二次污染等优点 [ 21 ] , 为人们提供了一条有效的 污染环境的修复途径 。但是与植物超富集重金属
摘要 : 以单叶新月蕨 ( P roneph rium sim plex, 金星蕨科新月蕨属 )为研究对象 , 研究其在自然条件下对稀土元素的超富集能力 。其叶片主动富集 的稀土含量高达 1249. 37μg·g - 1 , 是母土的 51. 8倍 、土壤中生物可利用态的 650. 7 倍 , 且稀土元素分异现象与母土一致 。在 100 μg·m l - 1 Nd3 +胁迫下 , 单叶新月蕨生长状况良好 , 且体内 Nd含量提高 , 同时结合多肽的表达增加 , 证明单叶新月蕨具超富集稀土元素的特性 ; Nd结 合多肽经酸处理脱掉 Nd后 , HPLC / ESI2IT2MS的结果显示 632 Da的肽段是 Nd在结合多肽中所处的区域 。利用细胞分级 、HPLC分离纯化 、氨 基酸组成分析以及分子量和酶解肽段的 MALD I2TOF2MS及 ESI2IT2MS测定富集过程中起着重要作用的稀土结合多肽 , 结果显示 , 稀土结合多 肽的分子量为 (5. 07 ±0. 02) KDa, 其中含有 2E2T2M 2E2, 2P2N 2L2L 2G2E2, 2F2V 2I2Y2E2和 2F2V 2I2A 2的肽段 。