光合细菌嗜酸柏拉红菌5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆与原核表达
园艺育种学-分子育种
多种几丁质酶已被克隆并转入烟草、番茄中，转基因植株表 现了抗真菌的特性。
B：植物抗毒素是植物产生的对一些不同种类 的病原菌具有毒性的物质，亦称植保素。
目前已鉴定了 200 多种植保素，其中以类黄酮 与类萜类植保素研究最多。从葡萄中分离出的 一种植物抗毒素3,4,5-三羟芪合成酶基因导入烟 草后，转基因植株与对照相比表现出对病原菌 （Botrytis cinerea）更强的抗性。 此外导入植物的核糖体灭活蛋白（ RIP ）抗真 菌性病害也有报道。
2 基因工程的作用
（1） 抗病基因工程：抗病毒、抗细菌及抗真菌 抗病毒：研究发展最快，主要采用向植物导入病毒外壳蛋白 （Coat Protein, CP） 基因。 自从1986年Beachy等将烟草花叶病毒的外壳蛋白基因（TMVCP）导入烟草中，发现转基因植株发病时间明显延迟或病害 的症状明显减轻后，已对多种植物病毒进行了试验，将这些 植物病毒的外壳蛋白基因导入植物以增强其抗病毒能力。如 黄瓜花叶病毒（ CMV ）、马铃薯 X 病毒和 Y 病毒（ PVX 和 PVY ）、大豆花叶病毒（ SMV ）、苜蓿花叶病毒（ AIMV ） 等 20 多种病毒的外壳蛋白基因导入植物后，均得到了类似的 结果，使植物获得了对相应病毒的抗性。在我国，导入TMV 和CMV外壳蛋白基因获得的抗病毒烟草已在进行田间试验， 增产效果明显。
转CMV/CP基 因的番茄
除利用外壳蛋白基因途径外，还有利用转移病毒的反义 RNA、 卫星 RNA 、病毒复制酶基因（ replicase ）和核酶（ ribozyme ） 基因，以及利用植物本身编码的抗病毒基因如核糖体失活蛋 白基因（ribosome inactivating protein，RIP）等也有获得成 功的报道。
1.4 发展现状
第一次课现代生物技术综合大实验
2020/4/24
中山大学药学院 王红胜
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载体的分类
• 根据功能
• 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
• 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达
• 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
2020/4/24
中山大学药学院 王红胜
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• 根据来源：
• 质粒载体
• 噬菌体载体
• 柯斯质粒载体
• 真核细胞表达载体
2020/4/24
中山大学药学院 王红胜
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2020/4/24
中山大学药学院 王红胜
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真核表达质粒pEGFP/N3
2020/4/24
中山大学药学院 王红胜
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实验内容
上午
下午
1. 高压灭菌
• 1000、200 ul枪头各1盒，1.5、 0.5mlEP管各一盒，玻璃试管10个 （分两包）用报纸或布包好高压灭 菌；
2020/4/24
中山大学药学院 王红胜
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DH5α
• 是世界上最常用的生物工程菌株之一，特别是 在克隆的应用，其主要特征为：
• endA1突变：
• 使endA (限制性内切酶) 无 酶活性，有利于质粒的稳定。
• (lacZ)M15突变：
• 其表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α 互补，可用于蓝白斑筛选。
• 各组取其1ml+9ml水（10mM TrisHCl）
• SOC培养液100ml（3组）
• pET-28a菌种：接种于5ml LB培养液×2管
• Kana (4组）
2020/4/24
中山大学药学院 王红胜
2 鉴定
基因克隆与重组子构建 基因表达与重组蛋白纯化 多克隆抗体制备与鉴定
原核表达(原理、材料与实验方案)
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
自然科学优秀学术论文一等-湖南省化工化学学会
湖南省第十二届自然科学优秀学术论文ﻩ一等优秀学术论文一种基于多目标优化的进化算法用于约束优化蔡自兴中南大学信息科学与工程学院王勇中南大学信息科学与工程学院ﻩ非线性波浪与沙质海床相互作用的耦合模型ﻩ程永舟长沙理工大学王永学ﻩ大连理工大学蒋昌波长沙理工大学基于人工智能网络的具有隐式功能函数的工程结构可靠度分析邓建ﻩ中南大学ﻩ古德生ﻩ中南大学ﻩ李夕兵ﻩ中南大学ﻩ一种以糖基金属卟啉为分子识别元件的荧光增强型丙硫苯咪唑传感器龚福春长沙理工大学科协吴道新ﻩ长沙理工大学科协ﻩ曹忠长沙理工大学科协提高矩阵变换器电压传输比的新型调制策略ﻩ郭有贵ﻩ湘潭大学ﻩ喻寿益ﻩ中南大学朱建林湘潭大学基于小波分析的键合动力学行为监控韩雷中南大学机电工程学院高荣芝中南大学机电工程学院钟掘中南大学机电工程学院时变时滞系统基于自由权矩阵方法的进一步改进何勇ﻩ中南大学信息科学与工程学院林崇ﻩ青岛大学自动化工程学院外部粘贴预应力碳纤维板技术加固桥梁结构的工程应用与评估ﻩ何贤锋长沙市公路管理局彭晖长沙理工大学罗杰ﻩ湖南省交通科学研究院ﻩ高通量表面等离子体成像免标记阅读蛋白质微阵列ﻩ黄昊文ﻩ湖南科技大学ﻩ陈义中国科学院化学研究所ﻩ中国大陆的脊髓小脑性共济失调6型:4个家系的分子和临床特征江泓中南大学湘雅医院神经内科ﻩ唐北沙中南大学湘雅医院神经内科ﻩ夏昆中国医学遗传学国家重点实验室非对称二甲基精氨酸诱导内皮细胞凋亡涉及RＯS－p3８MAPK途径ﻩ姜德建中南大学药学院药理学系贾素洁ﻩ中南大学药学院药理学系ﻩ戴忠广东医学院药理学教研室在混合分布情况下的最优老化及预防替换模型ﻩ蒋仁言长沙理工大学科协ﻩＳcｈwarｚscｈilｄ-aｎtｉ-ｄｅＳｉtteｒ和 Rｅisｓner－Ｎｏｒdstｒom-ａntｉ-de Ｓitteｒ黑洞时空中Dｉrａc场的似正模频谱荆继良湖南师范大学ﻩ潘启沅湖南师范大学超声倒装键合的界面机理ﻩ李军辉中南大学机电工程学院ﻩ韩雷中南大学机电工程学院段吉安中南大学机电工程学院EＲK通路在二烯丙基二硫诱导人胃癌MＧC803细胞分化中的作用凌晖ﻩ南华大学ﻩ张良运ﻩ广东佛山市人民医院苏琦ﻩ南华大学不确定动态网络的鲁棒脉冲同步刘斌湖南工业大学ﻩ刘新芝ﻩ加拿大Wａterlｏｏ大学陈关荣香港城市大学β１肾上腺素受体遗传多态性影响高血压病人美托洛尔单药降压疗效ﻩ刘洁中南大学临床药理研究所刘昭前中南大学临床药理研究所ﻩ余帮宁LA-Louｉsiaｎａ,United Ｓtates Compaｎy:LoｕｉｓianaﻩＳｔａteArｋａdiａ-Smａｄ7介导TＧF-β信号通路的正向调控与肾小管间质纤维化的关系ﻩ刘伏友中南大学湘雅二医院李小照ﻩ中南大学湘雅二医院彭佑铭ﻩ中南大学湘雅二医院ﻩ复合下齐次GrÖbner基的进一步结果刘金旺ﻩ湖南科技大学ﻩ王明生ﻩ中科院软件所ＫＬF4调控RAＷ264.7巨噬细胞中IL-10的表达ﻩ刘俊文中南大学基础医学院ﻩ张华莉ﻩ中南大学基础医学院刘瑛ﻩ中南大学基础医学院不同亚科间远缘杂交多倍体鲫鲂的形成及其进化意义刘少军湖南师范大学ﻩ覃钦博湖南师范大学刘筠湖南师范大学集群式创新与创新能力集成——一个培育中小企业自主创新能力的战略新视角ﻩ刘友金湖南科技大学商学院转ｃrｙ１Ａc/ｓｃk基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落影响的评价刘雨芳湖南科技大学生命科学学院ﻩ贺玲湖南科技大学生命科学学院ﻩ汪琼湖南科技大学生命科学学院引起中国家族性并缺指（趾）遗传病的Ｐ63基因一个新的突变位点的鉴定ﻩ罗桐秀ﻩ湖南师大邓云湖南师大袁婺洲ﻩ湖南师大ﻩ热循环条件下热障涂层系统残余应力场变化规律的预测模型毛卫国湘潭大学材料与光电物理学院周益春湘潭大学材料与光电物理学院杨丽ﻩ湘潭大学材料与光电物理学院人居环境——新城市主义的本质及启示ﻩ冒亚龙ﻩ长沙理工大学土木与建筑学院ﻩ长期稻草还田对土壤球囊霉素和土壤C、N的影响聂军湖南省土壤肥料研究所周健民中科院南京土壤研究所王火焰中科院南京土壤研究所ﻩ晒北滩溢流坝台阶坝面的水力特性欧阳福生ﻩ省水电设计研究院周翠云ﻩ省水电设计研究院ﻩ林珍喜省水电设计研究院ﻩ硒硫化镉合金纳米带颜色可调谐的光发射ﻩ潘安练湖南大学ﻩ杨华ﻩ中科院物理所ﻩ禹日成中科院物理所长期施肥对水稻土耕层微生物生物量氮和有机氮组分的影响彭佩钦中南林业科技大学仇少君湖南农业大学童成立中国科学院亚热带农业生态研究所金属纳米微粒结合能的推广型键能模型齐卫宏中南大学黄伯云ﻩ中南大学汪明朴中南大学中国长颊茧蜂属二新种(膜翅目，茧蜂科，小腹茧蜂亚科）宋东宝湖南农业大学生物安全科学技术学院ﻩ陈家骅福建农林大学植物保护学院杨建全福建农林大学植物保护学院ﻩCaｒnot群上水平凸函数的利普希茨连续性ﻩ孙明保湖南理工学院ﻩ杨孝平ﻩ南京理工大学ﻩ含两耦合侧端结构的量子线中的热输运性质唐黎明湖南大学ﻩ王玲玲湖南大学ﻩ陈克求ﻩ湖南大学瘤蛋白LＭP1调节EＧFＲ核移位及加速细胞周期G1/S期ﻩ陶永光ﻩ中南大学肿瘤研究所宋鑫中南大学肿瘤研究所邓锡云中南大学肿瘤研究所中国人工林桉树木材解剖性质与皱缩收缩特性相关性研究吴义强中南林业科技大学林和男ﻩ日本国立爱媛大学刘元中南林业科技大学ﻬ候选抑瘤基因LRRC４通过LRR结构域调控ＥＲK/AKＴ／NF-κＢ信号通路抑制脑胶质瘤细胞增殖武明花中南大学肿瘤研究所黄琛中南大学肿瘤研究所李桂源中南大学肿瘤研究所钻头螺旋槽的设计和刃磨的CＡD系统向文江邵阳学院ﻩ周志雄ﻩ湖南大学CTＧF-siRNＡ对硬皮病成纤维细胞CTGF,胶原Ⅰ/Ⅲ表达的影响ﻩ肖嵘湘雅二医院皮肤科刘伏友湘雅二医院肾病内科罗婧莹ﻩ桂林医学院附属医院皮肤科养老基金管理的常方差弹性模型及Lｅgeｎｄre变换一对偶最优决策肖建武中南林业科技大学翟弘ﻩ中南林业科技大学ﻩ秦成林ﻩ上海大学ﻩ电导率分块均匀的瞬变电磁2．5维有限元数值模拟熊彬中南大学信息物理工程学院ﻩ罗延钟中国地质大学地球物理与空间信息学院采用阴离子开环聚合方法合成聚酰胺6修饰的多壁碳纳米管ﻩ阳梅ﻩ湘潭大学化学学院高勇湘潭大学化学学院黎华明湘潭大学化学学院ﻩＶＥＧF转染MSＣs心肌移植对心肌梗死后大鼠心功能及血管新生的作用杨进福ﻩ中南大学湘雅二医院周文武ﻩ湖南省儿童医院郑维湖南省人民医院ﻩ非诺贝特通过抑制内皮细胞NF－κ B活性降低ADＭA水平ﻩ杨天伦中南大学湘雅医院陈美芳ﻩ中南大学湘雅医院罗百灵ﻩ中南大学湘雅医院ﻩ外资进入中国传媒业态势与政府规制创新ﻩ姚德权湖南大学曹海毅财富证券研发中心指纹图像的两步分割法ﻩ殷建平ﻩ国防科技大学计算机学院ﻩ祝恩ﻩ国防科技大学计算机学院ﻩ杨学军ﻩ国防科技大学计算机学院小肽对山羊氮平衡、营养物质消化率和若干门静脉血清指标的影响张彬ﻩ湖南农业大学动物科学技术学院ﻩ薛立群湖南农业大学动物医学院李丽立中国科学院亚热带农业生态研究所ﻩ双向增强体复合地基承载机理研究张玲ﻩ湖南大学赵明华湖南大学贺炜长沙理工大学ﻩ光合细菌嗜酸柏拉红菌5－氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆与原核表达张德咏ﻩ湖南省植物保护研究所ﻩ成飞雪湖南省植物保护研究所程菊娥ﻩ湖南省植物保护研究所ﻩ质量贸易条件与农产食品贸易的质量风险控制张汉江湖南大学葛伟娜ﻩ湖南大学ﻩ罗端红湖南大学具时变状态时滞与输入时滞的线性系统的时滞相关稳定化张先明ﻩ中南大学数学科学与计算技术学院ﻩ吴敏中南大学信息科学与工程学院ﻩShe,Jiｎ-HuaﻩSｃhool oｆＢiｏniｃs,Toｋｙo ＵniversiｔｙofTechｎoｌogy,T湖南几种耕地土壤固定添加铵的动力学研究张杨珠ﻩ湖南农业大学资源环境学院ﻩ万大娟湖南师范大学资源与环境科学学院ﻩ黄顺红ﻩ衡阳师范学院外语系ﻩ碳纳米环中的持续电流:结构变形及手性效应ﻩ张振华长沙理工大学科协ﻩ袁剑辉长沙理工大学科协邱明ﻩ长沙理工大学科协中国西南地区降水中氧稳定同位素比率与相关气象要素之间的关系ﻩ章新平湖南师大资源与环境科学学院刘晶淼中国气象科学研究院孙维贞ﻩ中国科学院寒区旱区环境与工程研究所ﻩ掺铕含量对Bi4-x EU xＴｉ3O12铁电薄膜微结构和铁电性能的影响郑学军ﻩ湘潭大学材料与光电物理学院低维材料及其应用技术ﻩ教育部重点实验室ﻩ何林ﻩ湘潭大学材料与光电物理学院低维材料及其应用技术教育部重点实验室ﻩ周益春ﻩ湘潭大学材料与光电物理学院低维材料及其应用技术ﻩ教育部重点实验室ﻩ对苯醌或H2O2电还原触发碳纳米管-壳聚糖-葡萄糖氧化酶生物传感复合膜的电沉积ﻩ周庆美湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室谢青季湖南师范大学化学生物学及中药分析傅迎春湖南师范大学化学生物学及中药分析ﻩ三阶热力学摄动理论的性能与现今液体状态理论的比较研究周世琦ﻩ中南大学物理科学与技术学院ﻩ流感灭活疫苗免疫糖尿病小鼠抗致死性流感病毒攻击的研究ﻩ朱强ﻩ湖南师范大学常海艳ﻩ湖南师范大学陈燕湖南师范大学。
植原体基因组学研究进展
植原体基因组学研究进展杨毅;车海彦;曹学仁;罗大全【摘要】Phytoplasmas are important bacterial plant pathogens transmitted by insects,such as leafhoppers and plant hoppers. Phytoplasmas can infect thousands of plants and also frequently induce witches’broom(prolifera-tion of stems,branches,and leaves),generalized yellowing and phloem necrosis,which can cause devastating yield losses. This review summarized the research history of phytoplasmagenomes,current opinions and phyto-plasma effectors.%植原体（phytoplasma）是一类重要的植物病原细菌，可经叶蝉、飞虱等昆虫介体传播，感染1000多种植物，产生丛枝、黄化、韧皮部黑斑坏死等症状，给农业、林业生产带来巨大的损失。
本文对植原体基因组学研究的历史、现状及当前植原体效应蛋白等方面的研究进展进行了综述。
【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】7页(P1-6,24)【关键词】植原体;基因组;效应蛋白;病原;寄主互作【作者】杨毅;车海彦;曹学仁;罗大全【作者单位】中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口571101【正文语种】中文【中图分类】S432.1植原体(phytoplasma)是一类植物病原原核生物，分类上隶属于软壁菌门(Tenericutes，又称无壁菌门)柔膜菌纲(Mollicutes)植原体暂定属[Candidatus (Ca.) genus Phytoplasma]。
植物赤霉素生物合成和信号传导的分子生物学
植物赤霉素生物合成和信号传导的分子生物学 !
王 伟 朱 平 程克棣 !
（中国医学科学院、 中国协和医科大学药物研究所、 卫生部天然药物生物合成重点实验室 北京 !"""#"）
摘要
赤霉素 （$%&） 在植物的种子萌发、 茎的伸长和花的发育等许多方面起着非常重要的作用。最近几
年， 对 $% 生物合成及其信号传导途径相关基因的研究取得了惊人的进展。这些进展促进了对其生物 合成及其信号传导途径的认识。$% 生物合成相关基因的表达受到多种内源和外源因子的调控，其中 研究较多的是发育阶段、 激素水平和光信号等内源及环境因子的调控。 $% 信号传导通常处于抑制状 态，$% 信号通过去抑制作用激活该传导途径而促进 $% 刺激植物生长和发育。 关键词 赤霉素， 生物合成， 分子生物学 $%!’(醛， $% 信号传导，
植物学通报
（’） ： ’""’，:; !ZO [ !WR
!"#$%&% ’())%*#$ +, ’+*-$.
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
（ /05-.:7/05-.:7 >:5?>9?’>9-20， 环化而成。中间体 %%@@ 是由异戊二烯焦磷酸 （ A’?>0.$ %%@@） 分别在质体或胞质中合成的。最近发现在植物的质体中 B@@ 是由 20.:7 >:5?>9?’>9-20， B@@） 甘油醛$($磷酸和丙酮酸缩合成的 +$磷酸木酮糖转化而成的， 而不是由甲羟戊酸直接合成 的 （C0880. -.8 @5?0D’2A./，!"""） 。甘油醛$($磷酸 E 丙酮酸途径涉及到一类转酮酶， 其中 !$ 脱氧$<$+$磷酸木酮糖合成酶基因分别已从胡椒 （ !"#$%& ’(’")($& ） 和薄荷 （ *&’+(,-. &##--. ） 中克 隆 出 来， 这 为 甘 油 醛$($磷 酸 E 丙 酮 酸 途 径 的 存 在 提 供 了 有 力 的 证 据 （ ,-./0 "$ &/ ， ； 该途径与经典的存在于细胞质中的甲羟戊酸途径同时存在， 从 !""1；F?4GA05 "$ &/ ，!""1） 而提供更多的类异戊二烯底物。因此， 植物中存在两条 B@@ 合成途径， 且这两条途径位于
嗜酸乳杆菌的亚油酸异构酶基因克隆及其pMG36e表达载体的构建
堡鱼塾王些》：至Ｑ！Ｑ垂笪呈！堂笪至Ｑ塑
嗜酸乳杆菌的哑油酸异构酶基因克隆及其 ｐＭＧ３６ｅ表达载体的构建
郎建华赵国芬李志刚郑婷包秋华
摘要：以嗜酸乳杆茵基因组为模板，对亚油酸异构酶基因进行ＰＣＲ，ＰＣＲ产物克隆到ｐＭＤ一１９Ｔ
质粒中，经茵落ＰＣＲ、酶切分析和ＤＮＡ测序鉴定克隆成功后，亚克隆入乳酸茵表达质粒ｐＭＧ３６ｅ，构建 乳酸茵表达载体ｐＭＧ３６ｅ—ＬＡＩ并转化到大肠杆菌ＤＨ５０ｔ中，经茵落ＰＣＲ和酶切分析初步证明表达载
下游引物Ｐ２： ５ｔ—ＡＡＡＧＣＡ’ｒＧＣ７ＩＴＡＧＡＣＴＡＡＡＴｌＴＧＣＴｒＣ一３７。（下戈Ⅱ 线为Ｓｐｈ Ｉ酶切位点）。 １．２实验方法 １．２．１嗜酸乳杆菌总ＤＮＡ的提取
用ＣＡＴＢ法提取。 １．２．２嗜酸乳杆菌ＬＡＩ基因的ＰＣＲ扩增
ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性３ ｍｉｎ，循环条件为： ９４℃变性３０ ｓ，４７℃退火４５ ｓ，７２℃延伸２ ｒａｉｎ；循环 ３０轮后，７２℃保温６ ｍｉｎ并终止反应。 １．２．３ ＬＡＩ基因ＰＣＲ产物的克隆及鉴定
克隆菌落ＰＣＲ结果见图２。图２中１、３，４号泳道均
得到一条长约１．８ ｋｂ的特异性条带，与预期的相同；
提取其质粒Ｓｐｈ ｌ、ＳａｌＩ双酶切后，电泳检测结果见
图３。图３中２、３号均为阳－件克隆质粒（ｐＭＤ一１９ｒｒ— ＬＡＩ）经过双酶切后，得到约１．８ ｋｂ和２．７ ｋｂ左右的
片段，与我们插入的片段（１ ７７６ ｂｐ）和质粒ｐＭＤ－１９Ｔ
嗜酸乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）为本实验 室从益生菌酸奶发酵剂中分离出的菌株。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９，为内蒙古农业大学分子生物实验室保存，用于 质粒ｐＭＧ３６ｅ及其衍生质粒的保存。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭｌ０９ （ｐＭＧ３６ｅ）为内蒙古农业大学乳品楼生物实验室赠送ｊ １．１．２培养基
杨梅和桃UDP-鼠李糖合成酶基因克隆及生化功能研究
摘要UDP-鼠李糖是植物糖苷类衍生物的重要糖供体，参与各种鼠李糖苷的形成。
鼠李糖苷广泛存在于植物不同组织部位，具有重要生物活性。
然而，商品化的UDP-鼠李糖难以获得，限制了植物鼠李糖苷相关的生物学研究。
本论文以杨梅（Morella rubra）和桃（Prunus persica）为研究材料，鉴定不同组织中黄酮醇鼠李糖苷的种类，克隆UDP-鼠李糖合成酶基因，并对其生化功能进行研究。
主要结果如下：1、利用HPLC，在杨梅不同组织中检测到三种黄酮醇鼠李糖苷，即杨梅素-3-O-鼠李糖苷（M3Rha）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（Q3Rha）和山奈酚-3-O-鼠李糖苷（K3Rha）；在桃不同组织中检测到四种黄酮醇鼠李糖苷，即槲皮素-3-O-鼠李糖基-葡萄糖苷（芸香糖苷）（Q3Rut）、山奈酚-3-O-芸香糖苷（K3Rut）、异鼠李素-3-O-芸香糖苷（I3Rut）和K3Rha。
2、从杨梅中克隆了两个UDP-鼠李糖合成酶基因，命名为MrRHM1和MrNRS/ER，编码区长度分别为2016 bp和909 bp。
MrNRS/ER氨基酸序列与MrRHM1的C端序列高度相似。
重组蛋白体外催化反应表明，MrRHM1可以催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖，其催化反应最适pH为9.0，最适温度为25℃。
MrNRS/ER不能独立催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖，但可以与AtRHM2的N端（AtRHM2-N）共同催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖。
3、从桃中克隆了两个UDP-鼠李糖合成酶基因，命名为PpRHM1和PpRHM2，编码区长度分别为2028 bp和2016 bp。
PpRHM1和PpRHM2氨基酸序列相似度为84.47％，重组蛋白体外催化反应表明，PpRHM1和PpRHM2均可以催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖，催化反应最适pH分别为9.0和8.5，最适温度分别为35℃和30℃。
本研究结果表明，MrRHM1，PpRHM1和PpRHM2均能催化UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖，对于后续开展植物鼠李糖相关的糖苷类物质生物合成及调控研究具有重要意义。
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光合细菌嗜酸柏拉红菌 !" 氨基乙酰丙酸合成酶 基因的克隆与原核表达
张德咏1 ，成飞雪1 ，程菊娥1 ， 张战泓# ， 刘 勇1"
（1 湖南省植物保护研究所 （ 湖南省蔬菜研究所
#
长沙 长沙
!1$1#H） !1$1#H）
摘
要： （*I*） 可作为除草剂、 杀虫剂和植物生长调节剂在农业上应用， 但由于其成本较高而限制 H6氨基乙酰丙酸
（H68;<F>54Y+5<F<A 8A<C， 以下简称 H6氨基乙酰丙酸 ， 是卟啉、 （ 亚铁） 血红素和维生素 /1# 等四吡 *I*） 咯类化合物的共同前体， 是一种广泛存在于细菌、 真 菌、 动物及植物等生物机体活细胞中的非蛋白氨基 酸。*I* 对植物无毒副作用， 易降解无残留， 在农业 生产中可作为绿色无公害的壮苗剂、 增产剂、 抗逆 剂、 除草剂、 杀虫剂、 增色剂、 绿化剂、 落叶剂等， 在临 床 医 学 上 可 以 作 为 抗 癌 药 物66光 化 疗 剂
［1］ （P=>.>CDF8;<A 8,4F.） ， 具有广阔的应用前景和市场 开发价值。但在自然条件下 *I* 细胞外分泌量很
*I* 的研究。 ［H］ 从污水中分离了一株光合细菌 Z/61 ， 经鉴定
［ H］ 为嗜 酸 柏 拉 红 菌 （ !"#$#%&’()*( ’+,$#-",&*( ） ， 田间 试验结果显示该菌可促进作物生长、 防治作物病毒 ［& ) %］ ， 进一步研究表明 *I* 是其中的活性成分 病害 之 一。 本 文 从 嗜 酸 柏 拉 红 菌（ !"#$#%&’()*(
［!］ 少， 只有刘秀艳等 在 #$$# 年 有 关 于 光 合 细 菌 产
公司， 按照 S8NA=+V 等（1((1） 的方法制备 P/5+4-AN<P. ［(］ （6） 受 体 菌 为 0ZH ； 表达载体 O[ 3 克隆载体 ， " （T4N;8FD） ， 受体菌为 RS1$(、 PQ:’$ 购自 Q<8,4F 公司
基金项目： 基金项目： 国家 “十一五” 科技支撑计划项目 （#$$&/*01"/$%） ； 国家 “%&’ 计划” （#$$&**1$2!$1）
" 通讯作者。 345： %&6"’16!&(11"&； 789： %&6"’16!&(11&&； :6;8<5： =8>8-5<+? 1&’@ A>;
作者简介： 张德咏 （1("’ B ） ， 男， 山西河曲人， 副研究员， 博士， 主要从事生物防治和分子植物病毒学研究。 :6;8<5： CDE=8F,"’ ? =>.;8<5 G A>; 其他作者： 谭新球， 戴建平 收稿日期： 接受日期： 修回日期： #$$&6116#"； #$$&61#61!； #$$"6$’6#(
（ 下划线为引 $&$%!$$%&!!--8**-**88>8->8J)L， 入的酶切位点） 。对 ’,- 进行特异扩增， 得到完整 的 -%-D 基因扩增产物。扩增条件： M+N #1?@； M+N H"N )C6， O&N HC6， )# 个循环； O&N 延伸 "C1?@。 +#6， .89 产物用 "FCP 琼脂糖凝胶电泳检测。 !"( &)&* 基因原核表达载体的构建及诱导表达 获得的 .89 产物经琼 !"("! 原核表达载体的构建： 脂糖电泳验证片段大小， 割胶回收后对目的片段进 行纯化。利用限制性内切酶 ’"( #和 )*+ 5$将纯化 后的 .89 产物及 AV()C 载体分别双酶切， 酶切产物 经琼脂糖电泳后分别回收目的片段。并对回收片段 进行粗略定量后连接并转化大肠杆菌菌株 W!"CM。 转化产物涂布于含 "CC 3T% 的氨苄青霉素的 %$ 平 " 板， 提取质粒后， )ON 过夜培养。挑取阳性单菌落， 利用 .89 以及酶切进一步确认目的片段已经连接 到 AV()C 载体上。与 -%-D 基因片段连接成功的载 预期的表达蛋白含有组氨酸 体命名为 -%-DJAV()C， （H X S?6） 标签标记， 以便于纯化。 !"("# 重组 -%-D 的诱导表达及蛋白的纯化与检 测： 含有 -%-DJAV()C 质粒的 W!"CM 菌株在 %$ 培养 基中 （含有 "CC 3T1% 氨苄青霉素） )ON 培养过夜后， " 以 " Y "CC 浓度接种于 &C1% 的 %$ 培养基放大培养至 加入诱导剂 7.*> 至终浓度为 ,-HCC 为 CFH Z CFO 时， 诱导前取 "1% 菌作为对照， "110=T%， )ON 继续培养 每隔 &[ 取 "1% 菌液， 离心收集菌体。菌体中加 H[， 入 +CC % 裂 解 液（ #C110=T% ,4S& .\+ 、)CC110=T% " ， 冰 "C110=T% ?1?54]0=、 "C 3T1% 溶菌酶， AS^FC） ,48=、 " 离心分别收集上清和沉淀。 "#P 上放置 )C1?@ 后， 考马斯亮蓝染色 "#1?@， 脱色 "#1?@ 后 D’DJ.->( #[， 观察电泳结果。 用亲和层析法纯化上清中可溶性形式的重组蛋 白 -%-D。-%-D 蛋白的纯化参照 V?432@ 公司的 ,?J （ V7- 2_A/266?0@?6:， ,*- 树 脂 亲 和 层 析 方 法 E2/6?0@ 。纯后的蛋白 "#P D’DJ.->( 检测。 )FC， C)T&CC"） !"+ &)&* 活性测定 （ "MOC） 方法 -%- 合成酶活性测定参照 $Q/@[41 ［"&］ 稍加改动 。菌抽提液 #CC % 与等体积反应试剂 " （含 #C110=T% */?6JS8=， AS OF#， &C110=T% 氯 化 镁， CF"10=T% 琥珀酸二钠， CF"10=T% 的甘氨酸， CF"110=T% 的磷酸吡哆醛， "#110=T% -*.， CF&110=T% 的辅酶 -） 加入 混 合， 分 别 反 应 "C1?@、 &C1?@ 和 )C1?@ 后， #CC % "CP 的 三 氯 乙 酸 终 止 反 应， ")CCC/T1?@ 离 心 " （ AS +FH） ， #1?@。取上清加入 "1% &10=T% 的醋酸钠 混匀后沸水浴 "#1?@， 混匀后加入 )CC % 乙酰丙酮， "
中成功地克隆了 H6氨基乙酰丙酸合成酶 ’+,$#-",&*( ） （ 以下简称 *I*O） 全长 6*;<F>54Y+5<F<A 8A<C -DF.=8-4， ! 基因， 并完成了 *I*O 基因序列的分析、 原核表达载 体构建及大肠杆菌原核表达， 为今后 *I*O 基因重 组工程菌产 *I* 的开发利用打下了基础。
H+C
（&CCO） （+） +O ‘S-,> ’2J<0@3 ./ "0 a T $(/" 1*(234*3035*(" ’*+*("
（ ’()） 。除特别注明， 所用培养基均为 !"# 及 $%&" （氨苄青霉素或卡那霉素） 。 %$ 中加入相应抗生素 试剂和仪器： 限制性内切酶、 连接酶 !"!"# *+ ’,等工具酶为 ./01234 公司产品； !"# 酶、 5,*.6 等为 上海申能博彩公司产品； 蛋白分子量标准为 !$7 公 司产品； .89 产物回收试剂盒为上海生工公司产品； 常用 生 化 试 剂 为 国 产 分 析 纯 试 剂。 .89 仪 购自 (AA2@50/B 公司。 （!46:2/;<;=2/ >/45?2@:） 光合细菌总 !"# $%& 的抽提 单胞纯化并发酵培养的光合细菌经离心收集后 ［"C］ 采用 8*-$ 法 进行 ’,- 抽提， 琼脂糖检测 ’,的浓度与完整性。 !"’ 目的基因的克隆 用 !"’"! -%-D 基因核心片段的扩增及序列测定： （ ） 软件对 中光合细菌 ’,-D:4/ E2/6?0@ #FCC >2@$4@G -%-D 基因序列进行同源性比较分析后设计了以下 通用引物， .89 片段的预期大小约 HCCIA。引物序 ： （ >） 列 为 正 向 引 物（ -%-DJK0/ ） #LJ>>8>>8-88 （ *） 反向引物 （ -%-DJ 8>8--8-*8> 8>>>8-8J)L； ：#LJ>8->8>->>*8>->（ - ）-->-*-（ > ） 9(E ） -->888>J)L。 .89 反应条件： M+N #1?@； M+N )C6， #CN )C6， O&N +#6， )C 个循环； O&N 延伸 "C1?@。 .89 产物经 "FCP 的 琼 脂 糖 胶 检 测 后 割 胶 纯 化， 并与 （J） 转化大肠杆菌 ’S# 。 A$=Q26;/?A: DR * 载体连接， ! 蓝白斑 涂布在含 "CC 3T% -1A 的 %$ 固体培养基上， " 筛选的阳性克隆经质粒 .89 及酶切鉴定后送上海 生工生 物 工 程 有 限 公 司 测 序。 具 体 方 法 参 照 文 ［"C］ 。 献 因 -%-D 基因在不同 !"’"# -%-D 完整基因的获得： 菌种中的保守度较低， 利用上述 .89 法得到的核心 片段 不 是 完 整 的 -%-D 基 因。 为 了 获 得 全 长 的 利用载体介导 .89 （ E2;:0/2::2 .89）方 -%-D 基因， ［""］ 法 获得旁 测 序 列。具 体 操 作 步 骤 按 *4R494 %并根据 .89*! ?@ U?:/0 ;=0@?@3 R?: 试剂盒说明进行， 已知 的 核 心 序 列 设 计 两 对 中 间 引 物。 DK"： #LJ >**>>---8>*->888>->>*>--8->J)L； DK&： #LJ *-8->>8*8*8>--8>8>J)L； D9"：#LJ>**8>>8*>8 8*8>>8>>8*-8-*8-8J)L； D9&： #LJ>8*-8-*8-88> 。 和 为 DK& #L 端 序 列 的 扩 增 引 >8-->-8>J)L DK" 物， 扩增产物经纯 D9" 和 D9& 用于 )L端序列的扩增， 化后采用 * 克隆法克隆并测序。利用 ’,-D:4/ 软件 对测序结果进行拼接及氨基酸序列分析。并根据分 析结果重新设计光合细菌 -%-D 基因特异 .89 扩增 引物， 引物两端引入酶切位点。引物序列如下： K： ； ： #LJ !$%%%$%&!&$ *>>-**-8-88-->J)L 9 #LJ