冷冻电镜技术
冷冻电镜观察蛋白颗粒
冷冻电镜，也称为冷冻电子显微镜或冷冻EM，是一种在低温下观察生物样品的技术。
它可以观察蛋白质颗粒和其他生物大分子，并提供了高分辨率的结构信息。
在冷冻电镜中，样品被迅速冷冻在低温下，以保持其自然状态。
然后，电子束被用来扫描样品，并收集散射的电子来生成图像。
由于电子束的波长比光波短得多，因此冷冻电镜可以提供更高的分辨率图像。
冷冻电镜在生物学研究中非常有用，因为它可以观察不稳定的、易变的或非常小的蛋白质颗粒。
这使得科学家能够更深入地了解蛋白质的结构和功能，进而了解生命的基本过程。
此外，冷冻电镜还可以与其他技术结合使用，例如单颗粒分析、冷冻电子断层扫描和微电子衍射等技术。
这些技术可以提供更多关于蛋白质结构和动力学的信息，有助于科学家更好地理解蛋白质的功能和作用机制。
总之，冷冻电镜是一种强大的技术，可以提供高分辨率的蛋白质结构和动力学信息，为生物学研究和药物设计提供了重要的工具。
冷冻电镜安装要求标准
冷冻电镜，全称冷冻电子显微镜，是一种在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术。
以下是冷冻电镜的安装要求标准：
低温环境：冷冻电镜需要在低温环境下工作，因此需要配备低温系统，包括低温制冷机和低温冷台等设备，以确保样品在低温下保持稳定。
防震设施：冷冻电镜对震动非常敏感，因此需要采取有效的防震措施，如安装防震脚垫等，以减少外部震动对显微镜的影响。
洁净环境：冷冻电镜需要在洁净的环境下工作，以减少尘埃对显微镜的影响。
因此需要安装空气过滤器等设备，并定期进行环境清洁。
电源和接地：冷冻电镜需要稳定的电源和良好的接地，以确保显微镜的正常运行。
其他要求：根据具体的显微镜型号和规格，可能还有其他特定的安装要求，如光学系统、真空系统等。
总之，冷冻电镜的安装要求标准需要考虑到多个方面，包括低温系统、防震设施、洁净环境、电源和接地以及其他特定的安装要求。
只有满足这些要求，才能保证冷冻电镜的正常运行和使用效果。
冷冻电镜的原理及应用
冷冻电镜的原理及应用冷冻电镜（cryo-electron microscopy，简称cryo-EM）是一种利用冷冻技术对生物样品进行成像的高分辨率电镜技术。
它的原理是将生物样品在极低温下快速冷冻，形成冰冻膜，然后在真空环境下进行成像。
冷冻电镜具有成像分辨率高、样品无需染色等优点，因此在生物医学研究领域有着广泛的应用。
首先，冷冻电镜的原理是利用样品在极低温下形成冰冻膜后，通过电子束对样品进行成像。
冷冻膜的形成可以保持生物样品的天然结构，避免了传统电镜中样品染色和固化过程可能导致的伪装效应。
同时，冷冻电镜可以获得纳米级甚至次纳米级的成像分辨率，能够观察到生物样品的细微结构和分子间相互作用，为生物学研究提供了重要的信息。
其次，冷冻电镜在生物医学领域有着广泛的应用。
在细胞生物学研究中，冷冻电镜可以用于观察细胞器的结构和功能，揭示细胞内部的生物过程。
在生物医药研发中，冷冻电镜可以用于药物与蛋白质相互作用的研究，为新药研发提供重要依据。
在病毒学领域，冷冻电镜可以用于观察病毒颗粒的结构，为病毒防治提供重要信息。
此外，冷冻电镜的发展也为生物学研究提供了新的技术手段。
随着成像分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为研究生物分子结构的重要工具，为科学家们解开生命奥秘提供了强有力的支持。
同时，冷冻电镜的技术进步也为药物设计和疾病治疗提供了新的思路和方法。
综上所述，冷冻电镜作为一种高分辨率电镜技术，具有成像分辨率高、样品无需染色等优点，在生物医学研究领域有着广泛的应用。
其原理是利用样品在极低温下形成冰冻膜后，通过电子束对样品进行成像。
冷冻电镜的发展为生物学研究提供了新的技术手段，为科学家们解开生命奥秘提供了强有力的支持。
相信随着技术的不断进步，冷冻电镜在生物医学领域的应用将会更加广泛，为人类健康事业做出更大的贡献。
冷冻电镜表征
冷冻电镜表征
冷冻电镜（Cryo-Electron（Microscopy）是一种生物学中常用的高分辨率电子显微镜技术，它能够以冷冻的方式观察生物样品的高分辨率结构，特别是蛋白质和生物大分子的结构。
冷冻电镜表征通常包括以下步骤：
1.（样品制备：（样品制备是冷冻电镜表征的关键步骤。
生物样品需要以特殊的方式制备，以确保在电镜中保持其原始结构。
通常，样品会在非常低的温度下迅速冷冻，以保持生物分子在其自然状态下的结构。
2.（数据采集：（冷冻电镜利用电子束来照射样品，并记录样品散射电子的图像。
这些图像被捕获并记录下来，形成一系列2D图像。
这些图像需要在不同角度和方向上采集，以获取关于生物样品三维结构的信息。
3.（三维重建：（通过收集的2D图像，使用特定的计算机程序进行图像处理和三维重建。
这些程序能够处理大量的2D图像数据，并将其转换成高分辨率的三维结构模型。
4.（结构解析与分析：（得到的三维结构模型可以进一步用于分析生物样品的结构。
这包括分析蛋白质、细胞器或其他生物分子的形状、大小、构象等信息。
冷冻电镜表征因其能够在生物样品的原始状态下观察高分辨率结构而备受青睐。
它在生物医学研究、生物化学和药物研发等领域中发挥着重要作用，帮助科学家们理解生物分子的结构和功能。
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冷冻电镜技术
冷冻电镜技术或冷冻电子显微学(Cryo-electron microscopy) (Cryo electron microscopy)梁毅(武汉大学生命科学学院)生物分子的结构分析现代生物学仪器分析中的“四大谱”和“三大法”●传统上最有效的方法是“四大谱”：●紫外-可见光谱、红外光谱、核磁共振波谱和质谱生物大分子（蛋白质和核酸等）结构测定●的最重要和应用最广泛的三大方法：●X 射线晶体衍射分析、核磁共振波谱分析和冷冻电镜什么是电镜？电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器●电镜用于生物样品的结构研究是众所周高分辨率的电镜可以达到0.l 知的，目前0l 乃至水平，这是指在特定条件下nm3Å可分辨的两点的距离。
●虽然这已接近原子分辨水平，但由于种种原因要看到构成生物大分子的碳、氢、氧原子的三维排布仍是很困难的。
●首先，构成生物物质的碳、氢、氧、氮等元素对电子的散射能力较弱；●其次高速电子的轰击会对生物样品造成辐射损伤，后者在生物样品的高分辨率结构分析中是最严重的问题。
●损伤机制包括非弹性散射引起的化学键断裂，也包括电子轰击引起离子、自由基和分子碎片扩散，从而造成生物样品的质量损失。
●因此利用电子显微镜对生物大分子进行研究必须首先把观察对象制备成特殊的样品。
●电镜的样品制备方法有许多种，在有关生物大分子结构研究中，负染、葡萄糖包埋以及冰冻含水（正染）等方法是常用的。
电镜载网●电镜观察的样品需要在特制的金属载网上才能送入电镜镜筒中进行观察。
载网的直径通常为4mm，可以用铜、银、铂、镍等金属或铜镍、银镍合金等制成。
最常用的载网为铜制的，所以电镜载网一般又称作电镜铜网。
铜网网孔的形状多样，有圆形的、方形的、单孔形和狭缝形；网●孔的数目有50目、100目、200目、300目和400目等多种规格。
网孔越大，观察的有效面积越大，但同时对样品的支持稳定性也越差。
冷冻电镜技术
冷冻电子显微镜技术冷冻电子显微镜技术在20世纪70年代时提出，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟，近年来已经进入了快速发展的时期。
它的研究对象非常广泛，包括病毒、蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等。
一方面，冷冻电微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。
因此，大大突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100KD）样品的限制。
另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克了因化服学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。
冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像,包括样品制备、图像采集、图像处理及三维重构等几个基本步骤。
一、样品制备用于冷冻电镜研究的生物样品必须非常纯净。
生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。
现在普遍采用的方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。
冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。
此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同而导致图像产生偏差。
该方法有两个步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。
在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。
其优点在于将样品保持在接近生活状态，不会因脱水而变形，同时可以减少辐射损伤。
二、图像采集冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。
在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。
由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术。
经过透射电子显微镜中一系列复杂的过程，最终在记录介质上会形成样品放大几千倍至几十万倍的图像。
嗯，这是一篇关于冷冻电镜的干货！
嗯，这是⼀篇关于冷冻电镜的⼲货！1、什么是冷冻电镜冷冻电⼦显微镜技术（cryo-electron microscopy）简称冷冻电镜。
冷冻电镜，是⽤于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)，可实现直接观察液体、半液体及对电⼦束敏感的样品，如⽣物、⾼分⼦材料等。
样品经过超低温冷冻、断裂、镀膜制样（喷⾦/喷碳）等处理后，通过冷冻传输系统放⼊电镜内的冷台（温度可⾄-185℃）即可进⾏观察。
冷冻电镜中的冷冻技术可以瞬间冷冻样品，并在冷冻状态下保持和转移，使样品最⼤限度保持原来性状，得出的数据更准确，实验成功率才更⾼。
2、冷冻电镜的分类⽬前我们讨论的冷冻电镜基本上指的是冷冻透射电⼦显微镜，但是如果我们可以使⽤冷冻技术的⾓度定义冷冻电镜的话，冷冻电镜主要可以分为冷冻透射电⼦显微镜、冷冻扫描电⼦显微镜、冷冻刻蚀电⼦显微镜。
2.1冷冻透射电⼦显微镜冷冻透射电镜（Cryo-TEM）通常在普通透射电镜上加装样品冷冻台，将样品冷却到液氮温度（77K）。
⽤于观测蛋⽩、⽣物切⽚等对温度敏感的样品。
通过对样品的冷冻，可以降低电⼦束对样品的损伤，减⼩样品的形变，从⽽得到真实的样品形貌。
⼀台冷冻透射电镜的价格在600万美元左右，价格及其昂贵，它的优点主要体现在以下⼏个⽅⾯：第⼀是加速电压⾼，电⼦穿透厚样品；第⼆是透镜多，光学性能好；第三是样品台稳定；第四是全⾃动，⾃动换液氮，⾃动换样品，⾃动维持清洁。
2.2冷冻扫描电⼦显微镜扫描电镜⼯作者都⾯临着⼀个不能回避的事实，就是所有⽣命科学以及许多材料科学的样品都含有液体成分。
很多动植物组织的含⽔量达到98%，这是扫描电镜⼯作者最难对付的样品问题。
冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）技术是克服样品含⽔问题的⼀个快速、可靠和有效的⽅法。
这种技术还被⼴泛地⽤于观察⼀些“困难”样品，如那些对电⼦束敏感的具有不稳定性的样品。
各种⾼压模式如VP、LV和ESEM的出现，已允许扫描电镜观察未经冷冻和⼲燥的样品。
冷冻电镜技术速冻到液氮的原理
冷冻电镜技术速冻到液氮的原理
冷冻电镜技术中，速冻到液氮的原理涉及到样品的快速冷冻以及其后续的处理过程。
在冷冻电镜技术中，样品通常是生物组织或细胞，需要在其自然状态下进行观察。
因此，为了保持样品的原貌并避免伪形态的产生，需要将样品迅速冷冻以固定其结构。
首先，样品通常被置于一种称为冷冻固化剂的物质中，这种物质可以迅速将样品冷冻并固化。
常用的冷冻固化剂包括液氮和乙烷等。
以液氮为例，液氮的温度极低，约为-196摄氏度，能够迅速将样品冷冻至极低温度，从而防止样品内部结构的变化。
在冷冻过程中，样品会迅速形成冰晶，这有助于保持其原始形态。
其次，冷冻后的样品需要进行进一步的处理，以便在电子显微镜中观察。
通常，冷冻固化的样品会被转移到真空中，并通过升温和脱水等步骤，使其逐渐从冷冻状态转变为可观察的状态。
在这个过程中，样品会被逐渐加热并脱除水分，最终形成适合在电子显微镜中观察的样品。
总的来说，冷冻电镜技术中，速冻到液氮的原理是利用极低温度的液氮迅速将样品冷冻固化，以保持样品的原始结构，然后通过
逐渐升温和脱水等处理，将样品转变为适合在电子显微镜中观察的状态。
这一过程确保了样品在电子显微镜中的观察结果准确性和可靠性。
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冷冻电镜技术课程学习报告一、课程所讲基础知识回顾
1、电子显微镜成像技术的发展历史
（1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）：
该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。
但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。
此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。
（2）上世纪60年代的三维重构技术
三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。
因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。
显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。
在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。
（3）上世纪70年代的电子晶体学
即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。
被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。
该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。
在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。
（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）
主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液精彩文档．
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中相同，呈天然状态。
因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。
2、冷冻电镜技术介绍
（1）关于玻璃态冰：
冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。
若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟10摄氏度。
4此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。
（2）操作步骤概要：
冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构（3）图像采集的质量要求：
应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。
此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A，明显超过最适剂2量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。
因此，必须采用低剂量技术（≤20e/A），用1k~3k倍的低倍镜寻找，在目
2标域的临近区聚焦，使记录区域仅在拍摄时（1s左右）受到电子辐射，保证样品不被损坏。
二、课外补充学习：冷冻电镜技术难点的扩展阅读
1、冰晶污染
冰晶污染是冷冻电镜的主要问题和最重要的难点，可发生在冷冻电镜的各个步骤。
在每个步骤中，冰晶污染的形成的主要原因不同。
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在冷冻制样阶段，冰晶污染形成的原因主要有三点：
（1）冷冻速率不够；
（2）冷却剂的温度未接近凝点；
（3）容器边缘的小冰晶坠入液氮中．黏附在样品上，或在样品转移过程，空气中的水分子凝结在样品表面。
2、电子辐射损伤
电子辐射损伤的原因几乎均可归结为热效应，被辐照区域的损伤大致可分为晶化、升华、起泡和漂移4种类型。
（1）晶化——与电子束的加速电压和电子剂量有关，一般发生在样品表面，玻璃态的冰晶化形成立方晶相，失去各向同性。
（2）升华——也发生在样品表面，本身现象与电子剂量无关，但是升华速率与电子剂量有关．电子辐射会增加样品表面分子的动能，从而增加样品表面分子脱离样品表面的几率。
（3）起泡——对于较厚的含水样品。
非弹性散射将造成能量沉积，大部分发生在接近样品表面的内层，此外，水是热的不良导体，因此会出现起泡现象。
随电子剂量的增加，起泡的范围和形态也会有所不同。
（4）漂移——样品的物理漂移来自于样品本身的形变，而样品的象漂移原因为电子在样品内的沉积，对电子束的偏转方向产生影响。
一般来说，使用尽可能低的电子剂量和尽可能小的照明光斑是避免上述四种辐射损伤的最佳方法。
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3、图像去噪
由于冷冻电镜特殊的低电子剂量和低衬度成像技术，使得图像反差弱，信噪比低，不易提取有效的结构信息。
而滤波是图像去噪的主要方法。
其原理为将信号和噪声都视为随机信号，利用它们不同的统计特征，通过最小方差估计某点的最似信号类型，若为噪点则予以除去。
此外，图像增强和图像复原也可相对地减轻噪点对信号图像的影响，其中图像增强是将人们主观感兴趣的部分亮度提高，而图像复原则是针对图像中客观存在，但受到了噪点干扰（称为退化）的样品信号，将它们的结构性信息予以恢复。
对于图像增强，一般会综合采用滤波、掩模、灰度变换、直方图均衡化等方法对感兴趣区域的信息进行增强；而图像复原的典型方法是根据先前的样品经验，建立一个退化模型，以此模型为基础采用滤波等手段处理，使得复原后的图像符合一定的准则，达到改善图像质量的目的。
其中信嗓比是评价图像复原程度的主要标准之一。
三、我国冷冻电镜技术的新应用
2011年1月，中科院生物物理所利用冷冻电镜平台，获得了呼肠孤病毒科的质型多角体病毒近原子分辨率的三维结构，并独立构建了全原子模型。
这是我国首次利用冷冻电镜技术解析生物大分子原子结构模型，也是世界上首次利用冷冻电镜图像获得的生物大分子复合体的全原子模型。
该研究确认了呼肠孤病毒mRNA的流出通道，定位了该病毒的两个甲基转移酶，并揭示了该流出通道是如何引导mRNA依次经过这两个甲基转移酶以完成“加帽”过程的。
在论文《Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure 精彩文档．
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provides insight into the mechanism of mRNA capping》中，研究人员通过冷冻电镜技术，得出以下结论：（1）CPV与其他呼肠孤病毒科相比，其主要衣壳蛋白缺乏特异的氨基酸序列，但它具有结构保守的酶蛋白VP3和衣壳蛋白VP1，表明具turret蛋白的呼肠孤病毒科的mRNA转录机制和衣壳组装机制有共性。
（2）CPV五聚体turret蛋白顶部独特的结构组织区是其指导mRNA完成“加帽”过程的关键区域。
（3）CPV的VP5蛋白由RNA第7节段编码，是由P50蛋白在转译后分裂产生的。
四、冷冻电镜技术的应用前景
随生物成像技术的发展，电镜技术已不再限于单纯的形态结构研究，而发展为不同水平上的显微学技术综合应用。
同时，显微学技术与细胞生物学、分子生物学等其他生命科学技术的结合应用正在成为研究热点。
例如，免疫细胞化学与电镜技术相结合，使原位杂交技术已从理论走向实际，得到相当普遍的应用。
因
此，冷冻电镜技术在对物质细微结构与功能的分析上必将极大地推动生物医学的发展。
参考资料：
[1] 尹长城老师《现代生物医学成像技术》选修课内容
冷冻电镜技术与冷冻电镜图像去噪研究[D].中山大学.2005
[2] 李鲲鹏
Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure
[3] Cheng L, Sun J. et al.
provides insight into the mechanism of mRNA capping. Proc Natl Acad Sci USA.
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2011 Jan 25;108(4):1373-8.
电子显微技术的发展趋势及应用特点，现代科学仪器. 2008.1 刘安生，[4] 张德添，朱衍勇：6-11
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