一个水稻NADPH氧化还原酶相似基因的克隆及表达分析_陈静
水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备
中图分 类号：Ｑ ８ ７５
Ｃｌ ｎ ｎｇ ｐｒ ｋａ ｙｏ ｉ ｘ ｅ ｓｏ ｆｒ ｃ ｇ ｌ ｃ ｏ － ， －ａ ｔ ｎｅ ｏ ｉ ， ｏ ｒ ｔｃｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｉ ｅＬ— ａ ａ ｔ ｎｏ １４ １ ｃ ｏ ｄ ｈ ｄｒ ｇ ｎａ ｅｇ ｎｅａ ｅ ｒ ｔｏ ｆａ ｔ－ ｅ ｙ Ｏ ｅ ｓ ｅ ｎｄ ｐｒ ｐａ ａ ｉ ｎ ｏ ｎ ｉＧＬＤ Ｈ ｎｔｂｏ ｅ ａ ｉ ｄｉｓ
摘 要 ：应 用 Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ技术从水稻 叶片 中克隆 了水稻 Ｌ半乳糖内酯脱氢酶（Ｌ Ｈ 的全 长基 因．序列分析表明 ， ． ＧＤ）
水稻 Ｇ Ｄ Ｌ Ｈ基 因全 长 １ ５ ｐ 亚克隆其部分成熟蛋 白编码基 因（８ ｐ ， ２ ， ７ ｂ ７ ９ｂ）利用基因重组技术构建了 Ｅｃｌ ｐ Ｔ ０— ． ｉ Ｅ ３ ａ ｏ／
第 ３ 卷第 ４ ６ 期 ２１ ０ ０年 ８月
湖 南农 业 大学 学报 （ 自然科 学 版）
Ｊｕｎ ｌ ｆ ｕ ａ ｒ ｕｔｒｌ ｉｅｓ ｙ（ ｔｒｌ ｃｅ ｃ ｓ ｏ ｒａ ｎ ｎＡｇｉ ｌ ａ Ｕｎｖ ｒｉ Ｎａｕａ Ｓ ｉｎ ｅ） ｏＨ ｃ ｕ ｔ
Ｖ １ ６ ＮＯ ４ ０ ３ ｌ ． ．
ｎ ｉ ｄ ｓａ ｌｚ ｄ ｂ ｓｅ ｂ ｏ ｏ ｔ ｓ ｅ ｉ ｉ ａ ｄ ｔｅ．Ｔ ｉ ｄ ｏ ｌ ｅｏ ｎｚ ａ ｔ ｏ ｙ ｗａ ａｙ ｅ ｙ Ｗｅｔｍ ｌｔｆｒ ｉ ｐ ｃｆｃｔ ｎ ｉ ｒ ｈ ｅ ａ ｔ ｏ ｙ ｃ ｕｄ ｒｃ ｇ ｉｅ ＧＬＤＨ ｒ ｔｉ ｂ ｎ ｓ ｉ ｙ ｔ ｎ ｂ ｐｏｅｎ
Ｓ ｉ ｃ ｓＺ ａ ｑｎ ｉｅｓ ， ｈ ｏ ｉｇ Ｇ ａ ｇ ｏ ｇ ２ ０ Ｃ ｉａ ｃ ｎ ｅ， ｈ ｏ ｉ Ｕｎｖ ｒｉ Ｚ ａ ｑｎ ， ｕ ｎ ｄ ｎ ６ ６ ， ｈｎ ） ｅ ｇ ｙ ｔ ５ １
水稻OsNAD的克隆预测及逆境下的表达分析
分子植物育种，2011年，第9卷，第6期，第680－687页Molecular Plant Breeding,2011,Vol.9,No.6,680－687研究报告A Letter水稻OsNAD-ME1的克隆、预测及逆境下的表达分析周滈杨传平*柳参奎*林木遗传育种与生物技术国家重点实验室,盐碱地生物资源环境研究中心,东北林业大学,哈尔滨,150040*通讯作者,yangcp@;shenkuiliu@摘要植物中的苹果酸酶能够参与光合作用、呼吸作用和脂类生成等多种重要的代谢途径，而且与植物的逆境防御有着密切的关系。
为研究水稻中一个苹果酸酶基因(OsNAD-ME1,Gene ID:4343294)的基本特征及其与逆境间的响应关系，克隆得到该基因的cDNA片段，应用生物信息学对其序列进行分析及预测，并运用Northern检测的方法，对该基因在多种非生物逆境下的表达情况做出研究。
由序列分析结果可知，OsNAD-ME1的ORF为1869bp，编码622个氨基酸，Os NAD-ME1属于植物NAD-ME的α亚组，其理论分子量为68.9kD，理论等电点为6.03。
预测结果表明该蛋白属于苹果酸酶家族，无跨膜结构域，定位于线粒体上。
并利用GFP定位的方法，在拟南芥悬浮细胞中对亚细胞定位的预测结果进行了验证。
Northern检测结果显示，OsNAD-ME1能够响应多种非生物逆境，在NaCl和NaHCO3胁迫下其表达水平在24h时达到最大，在PEG和H2O2胁迫下其表达水平在12h时达到最大。
该结果表明OsNAD-ME1可能与植物对非生物胁迫的响应有关。
关键词OsNAD-ME1,序列分析,亚细胞定位,Northern检测Cloning and Prediction of OsNAD-ME1from Oryza sativa L.and Its Expression Profiles under StressesZhou Hao Yang Chuanping*Liu Shenkui*State Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology,Alkali Soil Natural Environmental Science Center(ASNESC),Northeast Forestry University,Harbin,150040*Corresponding authors,yangcp@;shenkuiliu@DOI:10.3969/mpb.009.000680Abstract Malic enzymes in plants are involved in diverse important metabolic pathways,such as photosynthesis, respiration and lipid biosynthesis.And it was found that malic enzymes were involved in plant defense responses. In order to investigate the characters of a rice malic enzyme gene(OsNAD-ME1,Gene ID:4343294)and confirm the response relationship between this gene and stress environments,OsNAD-ME1was cloned and bioinformatics analysis and northern analysis of the response to stress environments about this gene were performed.The results of sequence analysis indicated that the open reading frame of OsNAD-ME1was1869bp in length,encoding622 amino acid residues.Os NAD-ME1belonged toαgroup of plant NAD-ME with predicted molecular weight of 68.9kD and isoelectric point of6.03.Os NAD-ME1was a member of malic enzyme family,whereas it didn't have transmembrane domain.Sub-cellular location prediction showed that Os NAD-ME1was located in mitochondria, and the predicting result was verified in Arabidopsis protoplasts using green fluorescence protein to track the location of this protein.The results of northern analysis indicated that OsNAD-ME1had response to several abiotic stresses.In the presence of NaCl and NaHCO3,transcripts of OsNAD-ME1reached peak level at24h of treatment, and the expression of OsNAD-ME1was induced drastically at12h under PEG and H2O2stresses.The results indicated that OsNAD-ME1was involved in response to abiotic stresses.Keywords OsNAD-ME1,Sequence analysis,Sub-cellular location,Northern detecting苹果酸酶(Malic enzyme)广泛存在于动物、植物及微生物中，它能在二价金属离子存在的条件下，与氧化型辅酶NAD(P)+结合，催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸盐和二氧化碳，在此过程中NAD(P)+还原分子植物育种Molecular Plant Breeding为NAD(P)H(Chang and Tong,2003)。
水稻羧酸酯酶基因OsCDAP的克隆及表达分析
水稻羧酸酯酶基因OsCDAP的克隆及表达分析李臻;潘教文;王庆国;刘炜【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2018(050)011【摘要】羧酸酯酶是一大类水解酶家族,催化短链脂肪酸酯键水解,在植物中参与除草剂代谢、信号分子激活、植物胁迫响应等过程.前期通过感染黑条矮缩病水稻数字表达谱鉴定到一个在病毒侵染后表达明显上调的羧酸酯酶基因.本研究以水稻中花11为材料克隆了该基因,将其命名为OsCDAP.生物信息学分析显示,该基因属于羧酸酯酶家族,与烟草中羧酸酯酶Nthsr203 J的相似性最高,可达95％.组织表达模式分析显示,该基因在水稻茎中表达量最高,且为赤霉素诱导表达,并受赤霉素合成抑制剂PAC的抑制.该研究为进一步解析羧酸酯酶基因功能奠定了基础.【总页数】6页(P10-15)【作者】李臻;潘教文;王庆国;刘炜【作者单位】山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南250100;山东师范大学生命科学学院,山东济南 250014【正文语种】中文【中图分类】S511;Q785【相关文献】1.嗜卷书虱羧酸酯酶CarE基因克隆及表达分析 [J], 唐培安;李非凡;王进军;沈飞;宋伟2.褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析 [J], 杨之帆;何光存3.水稻OsFAH基因启动子的克隆及表达分析 [J], 胡超;陈彦成;任春梅;张学文;黄丽华4.水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析 [J], 陈立杰;方远鹏;杜巧丽;陈俊;蒋君梅;陈美晴;李向阳;谢鑫5.野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析 [J], 王东;李兵;王燕红;刘衬丽;赵华强;许雅香;沈卫德因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
水稻渗透胁迫抑制表达基因的克隆与表达分析
水稻渗透胁迫抑制表达基因的克隆与表达分析摘要通过基因芯片技术，鉴定了一个PEG6000胁迫抑制表达基因。
该基因编码MYB转录因子，命名为OsSRMYB1。
荧光定量PCR研究结果表明，该基因的表达显著受PEG6000抑制，受氧化胁迫诱导，而低温和ABA处理下该基因的表达未发生显著变化。
组织表达分析结果表明，OsSRMYB1基因在水稻不同组织中均有表达，在叶中表达量较高。
在不同生长阶段的穗中，OsSRMYB1基因在发育中的穗中表达较高，在成熟穗和幼穗中表达量较低。
本研究为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供参考。
AbstractA gene encoding MYB transcription factor was identified as a PEG6000-repressive gene by microarray，designated OsSRMYB1.Real-time RT-PCR assay suggested that expression of OsSRMYB1 was significantly repressed by PEG6000，while not markedly changed upon ABA or cold stress. OsSRMYB1 expression existed in the different tissues of rice and the expression was the highest in leaves. The tissue-specific expression of OsSRMYB1 indicated that it was highly expressed in the developing panicles. This study provide reference for the depth analysis of the biological functional of OsSRMYB1.Key wordsMYB；rice；osmotic stress；panicle development；transcription factor植物对非生物胁迫的适应依赖于一系列信号级联反应的激活，包括胁迫信号的感知、信号转导、胁迫相关基因的表达及胁迫相关代谢物的积累，从而对损伤进行修复，进而对细胞的稳态进行重建。
水稻磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及功能分析
万方数据
３８６
中国科学Ｃ辑生命科学
第３６卷
配和再转运中具有不同的功能Ⅲ，１３，１４’１６］．水稻是世界 上二分之一人口为食的粮食作物，而大多数水稻生 长在Ｅ利用率低的酸性土壤上，因此提高水稻的Ｐｉ 利用效率，尤其是吸收效率显得尤为重要．然而，有 关水稻中磷酸盐转运蛋白基因和功能的研究目前只 有一篇报道ｌｌ９１．本研究从水稻中分离到一个磷酸盐 转运蛋白编码基因ＯｓＰＴ６：Ｉ，并对其表达和功能进行 了初步研究．
１．３水稻基因组ＤＮＡ提取与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析 采用ＣＴＡＢ方法提取水稻基因组ＤＮＡ，分别经
Ｄｒａ Ｉ，ＥｃｏＲ Ｉ和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切后，电泳、转膜、杂交 （以ＯｓＰＴ６：Ｉ特异序列共４５９ ｂｐ为探针）、检测，具 体方法参见Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅ ＣＤＰ．Ｓｔａｒ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏ— ｓｃｉｅｎｃｅｓ）．
ＲＴ－ＰＣＲ方法分析ＯｓＰＴ６：Ｉ为组织特异性表达． 在正常营养液和低磷处理下，ＯｓＰＴ６：Ｉ在叶片中强表 达：低磷胁迫条件下根中ＯｓＰＴ６：Ｉ表达量显著提高 （数据不显示），此表达方式与马铃薯的ＳｔＰＴｌ类似【１１１． 进一步原位杂交结果显示，缺磷处理５天，ＯｓＰＴ６：Ｉ 在叶片中的表达信号主要集中在叶肉细胞、维管束 和木质部薄壁组织细胞中（图２（ａ）中的Ａ，Ｂ）；在正常 磷素供给下，仅表达在木质部薄壁组织细胞中（图２（ａ） 中的Ｃ，Ｄ）．对于根系，缺磷处理下表达信号多集中 在表皮与皮层（图２（ｂ）中的Ｅ，Ｆ），而在正常培养下， 微弱的表达信号出现（图２（ｂ）中的Ｇ Ｈ）．
收稿日期：２００６．０２—１７；接受日期：２００６．０６—２９ ｔ国家自然科学基金（批准号：３０３００１９３）、上海市青年科技启明星计划（０５ＱＭＸｌ４０８）和上海高校优秀青年后备人选（０４ＹＱＨＢ００６）资助项目 ＋＋Ｅ—ｍａｉｌ：ｆｍｉｎｇ＠ｆｕｄａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ ｔ同等贡献
盐胁迫条件下水稻抗氧化酶家族基因的表达分析
盐胁迫条件下水稻抗氧化酶家族基因的表达分析随着全球气候的变化，盐渍化土地的面积在逐年增加，严重威胁着农业生产的稳定性和可持续性。
水稻作为重要的粮食作物，其生产受到了盐渍化土地的影响。
研究水稻在盐胁迫条件下的表现及其应对机制对于提高水稻的耐盐性，保障粮食供应有着重要的意义。
水稻的抗氧化酶家族是水稻抗逆性研究的热点之一。
抗氧化酶家族通过清除细胞内产生的自由基，保护细胞免受氧化损伤，提高植物对环境胁迫的适应能力。
本文将从表达分析的角度探究水稻抗氧化酶家族基因在盐胁迫条件下的表达变化，为解决水稻盐渍化土地种植问题提供科学依据。
一、盐胁迫条件下水稻抗氧化酶家族基因表达的变化研究发现，在盐胁迫条件下，水稻植株的抗氧化酶(SOD)活性显著增强，同时其他抗氧化酶如过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)也得到了一定程度的提升。
这表明，在盐胁迫条件下水稻的抗氧化能力增强。
此外，研究者还发现，在盐胁迫条件下水稻的抗氧化酶家族基因表达发生了变化。
抗氧化酶家族基因是通过调控水稻植株对盐胁迫的应答来发挥作用。
研究者采用qPCR等分子生物学手段检测发现在盐胁迫条件下，水稻抗氧化酶家族基因表达水平显著提高，其中SOD基因家族表达量最高。
这表明，SOD基因家族在水稻对盐胁迫的应对中发挥了重要作用。
二、水稻抗氧化酶家族基因表达的调控机制在水稻的盐胁迫响应中，抗氧化酶基因的表达变化受到多个因素的调控，如转录因子的作用、miRNA的调节等。
1、转录因子的作用转录因子是通过结合到特定的启动子区域来调节基因表达的蛋白质。
在盐胁迫条件下，一些转录因子如AP2/EREBP、MYB、NAC和WRKY家族的基因表达增加，这些基因在水稻对盐胁迫的应答中发挥了关键作用。
例如，研究发现，在盐胁迫条件下水稻内源性转录因子OsNAC5的表达显著增强，可以调控盐胁迫 induced 基因的表达，最终促进植物对盐胁迫的适应。
2、miRNA的调节miRNA是一类短链非编码RNA，可以通过与靶基因mRNA结合从而调控其表达水平。
水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析
中国水稻科学(Chin J Rice Sci), 2018, 32(2): 111－118DOI: 10.16819/j.1001-7216.2018.7094 111水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析江绍锋王陈骄子舒灿伟周而勋*(华南农业大学农学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室, 广州510642; *通讯联系人, E-mail: exzhou@)Cloning and Expression Analysis of RsPhm Gene in Rhizoctonia solani AG-1ⅠA of Rice Sheath Blight PathogenJIANG Shaofeng, WANG Chenjiaozi, SHU Canwei, ZHOU Erxun*(Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control/College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; *Corresponding author, E-mail: exzhou@)Abstract:【Objective】In order to elucidate the functions of phenol 2-monooxygenase(RsPhm)gene in melanization of Rhizoctonia solani Kühn AG-1ⅠA, the causal agent of rice sheath blight,【Method】the gene was cloned by routine PCR and RT-PCR techniques, and the bioinformatics analysis of this gene was conducted; furthermore, the relative expression level under catechol stress was determined by using fluorescence quantitative real-time PCR (qRT-PCR) technique.【Result】Bioinformatics analysis showed that the full-length DNA and cDNA sequences of RsPhm gene were 2 628 bp and 1 983 bp, respectively, which encode 660 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed that RsPhm gene had a close relationship in different anastomosis groups (AGs) of R. solani, and a certain evolutionary conservation among different fungal species. Results of qRT-PCR indicated that the exposure to exogenous catechol could improve the expression level of RsPhm gene, and which peaked at 12.5 µg/mL of catechol, with a significant increase of 35.7 times,19.1 times and 28.4 times up-regulated at 25 µg/mL and 50 g/mL, respectively, but only 2.1 times up-regulated at 100g/mL.【Conclusion】The full-length sequence of RsPhm gene was obtained, its basic biological information was understood, and its expression pattern under catechol stress was clarified. These findings will lay a basis for the scientific and systematic elucidation of regulatory mechanism of melanin formation by RsPhm gene of R. solani AG-1ⅠA.Key words: Rhizoctonia solani Kühn AG-1ⅠA; RsPhm gene; gene clone; expression analysis摘要：【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(RsPhm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析，通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。
水稻抗坏血酸过氧化酶鉴定与分析引言
水稻抗坏血酸过氧化酶鉴定与分析引言近年来，由于抗氧化剂在农产品中的广泛应用，抗坏血酸过氧化酶（POD）作为一种重要的抗氧化酶，受到了越来越多的关注。
抗坏血酸过氧化酶是一种位于植物细胞膜上的氧化酶，它在氧化过程中可以用来抗击氧自由基的过氧化氢分子。
研究发现，POD在抗氧化中发挥着重要作用，这不仅可以降低植物损伤，而且可以增加植物抗病能力。
水稻是我国的主要粮食作物，其POD的鉴定及其分析具有重要的意义。
由于水稻POD的结构比较复杂，所以在鉴定这样的酶时，必须有充足的研究来支持。
过去，主要采用结合特定体系的纯化测定方法，但受其繁琐且占用实验时间较长的缺点，许多研究者希望找到一种更快更方便的鉴定方法。
为了简化水稻POD鉴定过程，可以将它进行分析，以揭示其结构，特性，功能和相互作用。
由于进行POD分析存在很多不同的层级，比如蛋白质结构，形状，化学组成，活性和调节因子等，所以要对其进行有效的分析，必须采用合适的分析方法，并采用多种技术进行交叉分析。
目前，主要分析水稻POD的技术有分子生物学，蛋白质结构，形状和化学组成，活性和调节因子等。
分子生物学技术可以用来分析植物中POD的基因组结构，可以充分利用其特定的基因序列信息，进行POD基因组学研究。
蛋白质结构分析可以用来了解POD蛋白质结构的细节，以及活性与调节因子的相互作用，进而探究其功能。
形状和化学组成的分析可以用来了解POD的分子模式，从而深入了解其功能。
此外，活性和调节因子分析可以用来了解POD细胞膜膜上位点及其相关调节因子的功能，以及活性位点的酶学反应，进而提高水稻防氧化能力。
本文就水稻POD鉴定和分析作了简要介绍，在分析水稻POD时，可以采用不同的技术，如分子生物学，蛋白质结构，形状，化学组成，活性和调节因子等来综合识别其结构，特性，功能及其相互作用。
此外，需要结合实验验证，以正确理解水稻POD的功能。
过不断完善POD的分析技术，可以更好地探究水稻的防氧化机理，从而更好地保护植物。
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一个水稻NADPH氧化还原酶相似基因的克隆及表达分析陈 静1,# 姜 华1,2,# 万 佳1 高晓玲1 王平荣1 席 江1 徐正君1,2,*(1四川农业大学水稻研究所,四川温江611130;2四川农业大学作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室,四川雅安625014;#共同第一作者;*通讯联系人,E-mail:Zhengjunxu@h otm )C loning and Expression A nalysis of a NADPH Oxidoreductase-Like Gene f rom RiceC H EN Jing1,#,J IA NG Hua1,2,#,W AN Jia1,G AO Xiao-ling1,W A NG Ping-rong1,X I Jiang1,X U Zheng-jun1,2,*(1Rice Res earch I nstitute,S ich ua n A gricu ltura l University,Wen jiang611130,China;2Key La boratory of Crop Genetic Resources and Im-p ro vement,Min istry o f E ducatio n,S ich u an A gricu ltura l University,Y a′an625014,Ch ina;#Thes e autho rs co n tributed equally to this p a-per;*Co rrespo n ding au thor,E-mail:Zheng jun xu@hotmail.co m)Abstract:By using a fluorescent differential display method,the mRN A ex pression difference in rice leaves and roots un-de r drought stress and normal conditions w as compared.O ne positive fragment was isolated by combining the H. A.Yellow-PA GE(containing0.1%H. A.Yellow)separation w ith macroa rray screening methods.The g ene has96%identity to the Arabidopsis thaliana N ADPH oxido reductase gene.T he cDNA was1423bp in size,including a complete open reading frame of1048bp encoding a protein with345amino acid residues.T he gene expression level was higher under droug ht stress than that under normal conditions.T he possible role of NA DPH oxido reductase-like gene under drought stress w as discussed.Key words:rice;drought stress;N ADPH oxido reductase-like gene;cloning;gene expression摘 要:采用荧光差显(fluo rescent differential display,FDD)技术,比较分析了干旱处理与未处理水稻叶片及根中的mRNA表达,并利用H.A.Yellow-PAG E(含0.1%H. A.Yellow)再分离与大矩阵(macroar ray)筛选相结合的方法,发现1个与拟南芥N ADPH氧化还原酶高度相似(96%)的差异片段。
该基因的cDNA全长为1423bp,编码一个具有345个氨基酸残基的多肽。
在正常情况下该基因表达量很低,而在干旱处理中高表达。
讨论了干旱胁迫下NADPH氧化还原酶基因的可能功能。
关键词:水稻;干旱胁迫;N ADPH氧化还原酶相似基因;克隆;基因表达中图分类号:Q943.2;S511文献标识码:A文章编号:1001-7216(2006)03-0238-05 水稻(O ry za sativ a L.)抗旱性研究一直是稻作科学研究的重要课题之一[1-3],其抗旱基因的发掘已成为目前水稻遗传资源和品种改良研究的热点之一。
根据抗旱基因的作用方式,可将抗旱基因分成两类[4],第一类是功能基因,其编码产物如胚胎发育晚期富含蛋白(LEA)[5]、脯氨酸合成关键酶基因Δ1-吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)[6-7]和鸟氨酸-δ-氨基转移酶(δ-OA T)[8]、海藻糖合成酶基因海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸酯酶(T PP)等[9];第二类是调节基因,如编码DREB转录因子的基因[10-12]等。
属于第一类的NADPH氧化还原酶基因在植物逆境反应中起重要作用。
如在拟南芥中,它对氧化、高盐、干旱、高温和低温等非生物胁迫有很强的敏感性[13-14],并具有氧化防御作用和调节NADP/NADPH动态平衡的功能。
植物细胞在外界环境胁迫下会产生大量活性氧(active oxidative species,AOS),尤其是H2O2。
H ung等[15]认为,在ABA诱导水稻叶片过程中NADPH氧化还原酶是产生H2O2的关键酶。
苗雨晨等[16-17]认为,在水分胁迫下NADPH氧化酶可能是催化形成O2-的关键酶,它还可能参与脱落酸(ABA)诱导保卫细胞产生H2O2。
虽然,目前人们对N ADPH氧化还原酶参与调节渗透胁迫的关系研究较多[18-21],并认为干旱、盐渍、冷害和ABA诱导都能引起植物渗透胁迫而产生AOS,但由于植物在受到逆境胁迫后的生理变化非常复杂,NADPH 氧化还原酶参与的反应较多,对它参与信号传递及相关基因的表达仍缺乏深刻的了解。
特别是在水稻上,目前仍然没有关于该基因表达调控与逆境反应关系的报道。
本研究以干旱处理的水稻幼苗为材料,利用荧光差显(fluorescent differential display, FDD)方法克隆了NADPH氧化还原酶同源基因,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析了该收稿日期:2005-11-29;修改稿收到日期:2006-01-18。
基金项目:国际合作资助项目(05GH0001);教育部长江学者和创新团队发展计划(IRT0453);四川省青年科技基金资助项目。
第一作者简介:陈 静(1977-),女,硕士研究生;姜 华(1974 -),男,博士研究生。
238中国水稻科学(Chinese J Rice Sci),2006,20(3):238～242http://w ww.ricescience.o rg基因在干旱胁迫下的表达调控模式,并对其可能的功能进行了讨论。
1 材料与方法1.1 植物材料水稻品种日本晴(Ory za sativa L.subsp.ja-ponica)种子在浸种、催芽之后,播种在石英砂里并用(1/10)MS无机盐溶液浇灌,于25℃下培养至3叶期。
无伤幼苗被移植在干燥的石英砂上进行干旱处理(吸干根和叶上的水分,将幼苗根埋置石英砂中处理)。
在0min(对照)、15min、30min、1h、2h、4 h、6h后取幼苗的叶和根,在液氮中速冻后置于-80℃冰箱中保存备用。
1.2 方法1.2.1 RNA提取依据《分子克隆实验指南》[22]用盐酸胍-酸酚法提取各处理的水稻叶片和根的总RNA之后,用LiCl沉淀纯化RNA。
参照Sam brook等[23]的方法进行RNA甲醛变性凝胶电泳,在确认RNA完整性后,再经DN ase处理以消除DNA污染,供反转录用。
1.2.2 m RN A差异显示及基因片段克隆根据荧光差显试剂盒(TaKaRa)合成cDNA和调制反应体系,9个锚定引物和24个可变引物进行组合在第1轮PC R反应中使用。
PCR反应条件如下:S tep1(1cycle)为94℃下1min,94℃下2min, 38℃下5m in,72℃下5min;Step2(35cy cles)为94℃下30s,38℃下2min,72℃下1min;Step3为72℃下8m in,4℃,∞(保存)。
反应结束后,加入等量上样缓冲液用7mo l/L尿素PAGE(5.4%聚丙烯酰胺)进行分离,通过荧光扫描仪(BAS-3000,Fu-jiFilm)成像后,根据图像回收差异片段,于50μL灭菌水中放置30min,煮沸10min后,上清液作为第2轮PCR反应的底物。
根据第1轮PC R的锚定引物和可变引物扩增片段。
其反应条件如下:Step1为94℃下1min(预处理);Step2(15cy cles)为94℃下30s,40℃下2min,72℃下1min;Step3为72℃下3min,10℃,∞。
使用含0.1%H. A. Yello w(TaKaRa)的尿素PAGE分离样品和回收荧光强度最高的主带,作为第3轮PC R底物,其反应条件除循环数增加到42cy cles外,其余与第2轮相同。
反应后,每样品扩增产物的1μL点在尼龙膜上,风干后进行紫外线固定处理(2min),用于大矩阵(macro array)筛选。
使用3μg mRNA,通过M-M LVRT(Promega)酶合成dU TP-dig探针,筛选阳性克隆。
余下的扩增产物,在2%琼脂糖凝胶上电泳、回收。
使用玻璃粉(BIO101)纯化DNA片段,连接到T-easy载体,转化到JM109大肠杆菌进行克隆筛选。
1.2.3 序列测定及分析使用QIA prep Miniprep Kit(Q IAGEN)分离质粒,采用CEQ TM DTCS_Quick Start Kit(Beckm an)调制样品和测序(BECKMAN8000,Beckm an)。
用DNAM AN和NCBI网址的Blast程序进行相似性分析。
1.2.4 RT-PCR半定量检测应用Prime r primier 5.0设计引物,进行RT-RC R检测。
参照TOYOBO公司试剂盒提供的方法,利用Olig o(dT)18对总RNA样品进行逆转录反应。
cDNA第一链的合成:取1μg总RNA用于cDNA第一链的合成。
RT-PC R扩增时,选用水稻β-actin基因作为总RNA模板定量的内参,引物为: 5′-GAACTGG TA TGGTCAAGGCTG-3′和5′-AC ACGGAGCTCGT TGTAGAAG-3′;目的基因的特异引物为:5′-AGGGCAAAACA TCACCCAACGA AACG-3′与5′-AACAGGAAGAAGGAC TACAA GGACGG-3′,由上海博亚生物技术有限公司合成。