微生物检验操作步骤
微生物限度检查操作规程
1 目的规范微生物限度检查操作。
2 适用范围适用于微生物限度的检查。
3 职责质量检定部人员严格按本SOP操作。
4 工作程序4.1 仪器4.1.1 超净工作台4.1.2 微生物检测系统4.2 试剂所用培养基及缓冲液均按《中华人民共和国药典》2005版三部要求进行配制。
玫瑰红钠培养基、营养琼脂培养基4.3 试验方法采用薄膜过滤法4.4试验前准备试验过程中所有用的器材都应进行灭菌后方可使用；超净工作台使用前需进行紫外灭菌30min。
4.5 试验步骤4.5.1 将样品加入薄膜过滤器的滤杯中4.3.1.3 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响4.3.1.4 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。
4.3.1.5 检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。
4.3.2 检验量4.3.2.1 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
4.3.2.2 除另有规定外，一般供试品的检查量为10g或10ml；化学膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
4.3.3 供试液的制备供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
4.3.3.1液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨脂80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
4.3.4 细菌、霉菌及酵母菌计数4.3.4.1 检查法薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。
选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。
滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。
使用时，应保证滤膜再过滤前后的完整性。
微生物限度检查法标准操作规程完整
范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
责任微生物限度检验人员内容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。
菌液制备按规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
微生物限度检查法标准操作规程完整
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查 供试品微生物计数中 所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性 试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法 适用性试验。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102])
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于。滤膜直径一般为50mm。滤器及滤膜使用 前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供 试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应 注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要 用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000m1；以免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”和“接种和 稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品 中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用 适量的冲洗液冲洗滤膜。测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨 琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖 琼脂培养基平板上，按规定条件培养、技术。每株试验菌每种培养基至少制备1张滤膜。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。
微生物限度检查操作规程
更改历史微生物限度检查操作规程1.0 目的建立微生物限度检查标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确2.0 范围适用于本公司采用微生物限度检查法测定的供试品。
3.0 职责质量部负责按本规程的要求执行微生物限度检查操作。
4.0 工作程序4.1 洁净区间的确认微生物计数检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全部过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品（即待检样品、产品）中微生物的检出。
4.2 培养基4.2.1 应使用按中国药典处方及规定的方法制备的培养基。
4.2.2 所用培养基可按中国药典规定的处方及制备方法自行配制，也可使用按中国药典规定的处方生产的脱水培养基进行配制；或购买商品化的预制培养基。
4.2.3 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25℃、避光的环境下保存。
4.2.4 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
4.2.5 供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
4.2.6 供试品的微生物计数方法、控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数或控制菌检查。
4.3 菌种及菌液制备检查所用的菌种及菌液制备见附件 1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
稀释剂、冲洗液及其制备的要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查。
4.4 培养基的适用性检查供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
微生物限度检查所用的培养基每批均应进行适用性检查，检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。
具体要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
4.5 方法适用性试验供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
微生物限度检查-控制菌检查法标准操作规程
微生物限度检查-控制菌检查法标准操作规程1 目的明确微生物限度检查-控制菌检查法的过程，保证产品质量。
2 适用范围检查非无菌制剂及其原、辅料等是否存在特定的微生物（如：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）, 从而判断是否符合相应的微生物限度标准。
3 定义无。
4 职责与权限检验员：按本标准判定产品质量并出具报告。
负责人：监督执行情况，审批最终结果。
5 内容及流程5.1 实验说明5.1.1 TSB为“胰酪大豆胨液体培养基”。
5.1.2 所用材料及用具（待检品、菌株除外）应经过灭菌处理；检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
5.1.3 供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
5.2 检验量从一批中随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合后，从中抽取10g或10mL。
5.3 实验材料与用具5.3.1 混合后的待检品（供试品）、TSB培养基（9mL/管）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；5.3.2 铜绿假单胞菌实验用材料：铜绿假单胞菌菌悬液（≤100cfu/mL）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液（即用即配）；5.3.3 金黄色葡萄球菌实验用材料：金黄色葡萄球菌菌悬液（≤100cfu/mL）、甘露醇氯化钠琼脂培养基；5.3.4 用具：培养皿、接种环、洁净滤纸片、无菌玻棒。
5.4 供试液制备5.4.1 取供试品和pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以1:10稀释成供试液。
5.4.2 必要时，用统一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释；也可用混合的供试品原液作为供试液。
5.5 增菌培养5.5.1 供试品组：取1mL供试液，接种至9mL的TSB中，混匀，共接种2管。
5.5.2 阳性对照：取1mL菌液，与供试液同法操作，接种至9mL的TSB中，混匀，接种1管。
5.5.3 阴性对照：取1mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，与供试液同法操作，接种至9mL 的TSB中，混匀，接种1管。
微生物学检验--操作流程及评分标准
准备
待测水样、泥土、无菌吸管，平皿，无菌生理盐水
素质要求
让学生熟悉细菌在自然界和人体的分布情况
操
作
步
骤
1.空气中细菌的检查
（1）方法：取普通平板（或血平板）1个，选室内或室外的一处空间，在离地面1m左右高度的桌面（或台面）上，打开平板盖，让培养基暴露于空气中，10min之后，迅速盖好盖子，在底部写上标记，放35℃培养18~24h，观察结果。
2.尿囊腔接种
将蛋胚在检卵灯上照视，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。用带18mm长针头的1ml注射器吸取病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液。用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
3.羊膜腔接种
将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。用齿钻在气室顶端磨一三角形，用镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴，用镊子，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，用26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入病毒液 0．1ml。将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时。
扣分标准
扣分
目的
了解鸡胚培养常见的几种接种方法；
掌握鸡胚尿囊腔接种的操作技术。
用物
准备
受精卵、孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
素质要求
要求能够对不同的病毒通过鸡胚进行培养
操
作
用物
准备
菌种、葡萄糖蛋白胨培养基，甲基红
素质要求
能利用甲基红试验对大肠杆菌进行鉴定
微生物检验实验室嗜血杆菌属检验标准操作规程
微生物检验实验室嗜血杆菌属检验标准操作规程1. 概述嗜血杆菌属包括流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、杜克嗜血杆菌等9个种。
临床上以流感嗜血杆菌最为常见。
2. 标本类型血液、痰、脑脊液标本。
3.鉴定3.1 形态与染色革兰阴性短杆菌。
3.2 培养特性在巧克力琼脂平板上35℃培养18~24小时，形成微小、无色透明似露滴状的菌落。
在血琼脂平板上形成极小、圆形、透明的菌落，并有“卫星现象”。
3.3 生化反应分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖，吲哚、触酶和硝酸盐还原试验均为阳性。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，多形性，菌落为无色透明似露滴状，卫星现象阳性，生长需要X、V两种因子，普通培养基不生长。
3.4.2 流感嗜血杆菌的种间鉴别见表嗜血杆菌鉴别的关键性试验-++-++-++ 注：“+”为90%以上菌株阳性，“-”为90%以上菌株阴性，“V”为11-89%菌株阳性，“W”为弱发酵反应。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片、革兰染色呈革兰阴性短小杆菌。
3.5.2 鉴定从巧克力琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。
5.质量控制见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析如果检出β-内酰胺酶阳性流感嗜血杆菌则提示对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药（耐药机制大多为TEM型β-内酰胺酶）。
如果流感嗜血杆菌β-内酰胺酶阴性，而对氨苄西林耐药，则对阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢克罗、头孢他啶、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛均耐药。
7.临床意义流感嗜血杆菌常寄居于正常人呼吸道（在呼吸道定植者可达到人群的50%），当机体抵抗力下降时，可引起人类呼吸道感染；也也可随血液入侵组织内部，引起脑膜炎、关节脓肿或其他部位的化脓感染。
副流感嗜血杆菌寄居在人类的上呼吸道，可引起呼吸道感染，偶尔引起心内膜炎等。
微生物检验操作规程
微生物检验操作规程微生物检验操作规程1. 目的建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。
2. 范围适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。
3. 职责3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程；3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。
4. 操作规程4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤4.1.1 一般的玻璃器皿（例如培养皿、试管、三角瓶等），可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤达到标准。
4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。
4.1.3 新购的玻璃器皿先用2％盐酸浸泡，再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。
4.2 器皿的包扎4.2.1 试管：塞上胶塞，然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。
做发酵试验时，将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。
4.2.2 三角瓶、抽滤瓶：将三角瓶（抽滤瓶）口塞上胶塞，然后用牛皮纸把塞头部包起来。
4.2.3 吸管：将耐高温的移液枪头装盒，用用牛皮纸或报纸包裹。
4.2.4 平皿：10个为一组，用牛皮纸包裹。
4.3消毒和灭菌：4.3.1 化学灭菌：此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。
如人手等。
（1）用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。
（2）一般用1～2%的甲醛液浸泡软管和用具。
（3）一般成品漂白粉的有效成分是25～32% 。
使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内，（对金属有腐蚀作用）放置10～15min后冲洗即可。
（4）氯灭菌剂的能力以有效氯表示，将氯水配制成50～100PPm 的有效氯溶液，可用于浸泡，冲洗和表面杀菌。
但氯对金属有腐蚀作用。
4.3.2 物理灭菌：4.3.2.1 干热灭菌：适用于干燥的玻璃器皿（吸管、平皿等）、金属器具（镊子等）、固体试液、液状石蜡等。
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微生物检验操作步骤
Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
样品制备：
取样品 10 g/ml加入至 90 ml灭菌生理盐水中，混匀，制成 1 ︰ 10 的稀释
液；
菌落总数：（结果报告：XXX cfu /g(ml)）
取上述 1 ︰ 10 的稀释液 1 ml加入至 9 ml灭菌生理盐水中，充分混匀，
制成 1 ︰100 的稀释液；
取上述两个稀释级的稀释液分别加入2块平皿中，每块平皿中加 20 ml，然后
往平皿中倒入约45℃的 卵磷脂吐温80琼脂 培养基，待培养基凝固，倒置
放于36+/-1 ℃培养箱中培养 48 h，点计菌落数。
霉菌和酵母菌：
操作同菌落总数，加入的培养基为 虎红 培养基，待培养基凝固，
倒置放于 ℃培养箱中培养 72 h，分别点计霉菌和酵母菌数。
粪大肠菌群：（结果报告（未）检出/ ）
取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 10 ml 双倍乳糖胆盐 培养基中，摇
匀，置 44 ℃培养箱中培养 48 h；
如果培养物产 酸 产 气 （现象为培养基呈 黄 色，小倒管内有 气
泡 ），则应取培养物分别接种至 伊红美蓝琼脂 平板于 37 ℃培养 18-24
h和 蛋白胨水 培养基中于 44 ℃培养 24 h。
在上述平板上，粪大肠菌群呈 深紫黑 色、圆形突起的菌落，并有 金属
光泽。
挑取分离的单个菌落，进行 革兰氏 染色和镜检，在显微镜下应观察到
红 色 短杆 状的菌。挑取菌落时，应使灭菌的接种环 冷却 后再行操作。
上述 蛋白胨水 培养基的培养物还需做 靛基质 试验，阳性现象为培养物表
层出现 玫瑰红 色。
铜绿假单胞菌：（结果报告（未）检出/ ）
取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 90 ml SCDLP 培养基中，摇匀，
置 37 ℃培养箱中培养 18-24 h；
挑取上述培养物，接种至 十六烷基三甲基溴化铵琼脂 平板于 37 ℃培养
18-24 h；在该平板上，铜绿假单胞菌应为 灰白色 色、圆形湿润的菌落，
周围培养基溶有 水溶性 色的色素；
挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到 红 色 杆 状的
菌。
如果平板上只分离到1个可疑菌落，不够做生化试验，则应 挑取该菌落于
SCDLP增菌培养 。
取分离的菌落分别做 氧化酶 试验、 绿脓菌素 试验、 硝酸盐还原产气 试
验、 明胶液化 试验和 42℃生长 试验。
金黄色葡萄球菌：
增菌培养同铜绿假单胞菌项下，
挑取上述增菌液的培养物，接种至 B-P 平板于 37 ℃培养 24-48 h；在该平板
上，金黄色葡萄球菌应为 灰黑 色、圆形的菌落，菌落周围有 混浊 带和 透
明 环
挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到 紫 色 球 状的菌。
取分离的菌落分别接种至 甘露醇发酵 培养基和 肉汤 培养基中，于 37 ℃培养
24 h；取上述肉汤培养物，做 血浆凝固酶 试验。