western blot参考资料
参考westernblotting
Western blot原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展。
Western Blot(PVDF膜)
美国芝加哥大学分子肿瘤实验室提供一、准备试剂：1、 TBST (Tris-Buffered Saline-Tween-20):10mM Tris-HCl (pH8.0)150mM NaCl0.05% Tween-20 (after all and water are mixed, add tween-20)2、 Transfer Buffer:800ml 甲醇（终浓度为20％）12.12g Tris Base57.63g 甘氨酸加入ddH2O 使总量达到4L注意：最终pH 值应该是8.3~8.6, 但不能通过加酸或者碱来调节。
二、实验步骤（一些具体步骤可以参考NC膜的方法）：1、首先，将蛋白质样品在SDS-PAGE胶中进行电泳（180V，30mA）。
2、将转移膜（PVDF）在甲醇中浸泡1分钟后，去离子水中洗涤3次，浸泡于转移缓冲液中待用。
3、组装转移组合，顺序如下：负极起：塑料底垫——底层泡沫——滤纸——SDS-PAGE胶————滤纸——上层泡沫——塑料底垫注意：应该绝对避免层与层之间有气泡的现象。
4、将转移组合放入转移电泳槽中进行蛋白质转移（4°C最佳）。
转移条件为：250mA ，60-100 minutes 。
5、转移完成后，将取出，采用封闭液(5-10% milk-TSBT) 在摇床上封闭2小时或过夜。
6、准备一抗：按一般推荐比例1:500-1:1000将一抗稀释在封闭液中。
7、将直接放入一抗-封闭液混合液体中，液体能够覆盖膜表面即可，室温下在摇床上震荡1-2小时。
注意：绝对避免让膜变干的现象8、使用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
9、准备二抗：按一般推荐比例1:5,000-10,000将二抗稀释于TBST缓冲液中（二抗直接联结于辣根过氧化酶HRP）。
10、将放入二抗-TBST混合液中，室温下在摇床上震荡1小时。
11、使用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
12、显色：按照显色底物说明配制HRP反应底物，将放入显色底物中，反应1分钟后取出。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
常用western blot 试剂配方
Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。
3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。
Western blot protocol
一．绘制BSA标准曲线(目的：测蛋白浓度)1.方法：BCA法(生工)2.需要配的试剂：1× PBS溶液10× PBS溶液：Na2HPO48 mMNaCl 136mMKH2PO4 2mMKCl 2.6mM3.注意：① 用分光光度计测定A562吸光值时，所需样品最小体积为1ml，即，加样体积为：1× PBS—0.5ml，BCA工作液—0.5ml；① 由于缓冲液1× PBS与BCA工作液是1:1等体积加的，所以，BSA被稀释为初次用1× PBS配制的梯度浓度的1/ 2，即，在绘制标准曲线时，BSA的终浓度需要÷ 2，切记！二．提取总蛋白1.试剂：配制时佩戴手套、口罩。
(1)单一母液：① 1M Tris (pH=8.0)：4℃保存称取12.114g Tris-base，加少于100ml蒸馏水溶解，调pH后，定容至100ml。
① 0.5M EDTA (pH=8.0)：4℃保存称取14.61g EDTA，加少于100ml蒸馏水，加固体NaOH至pH约为8.0时，EDTA方开始溶解，溶液状态变化过程：白色乳浊液——白色胶状物——白色乳浊液——无色透明液。
① 20% SDS：常温保存称取20g SDS，加蒸馏水定容至100ml.④100× PMSF (100 mM): 4℃保存称取261.3 mg PMSF，加15 ml 异丙醇溶解。
(2)复合母液：2× extraction buffer : 40ml1M Tris (pH=8.0) 2 ml0.5 M EDTA (pH=8.0) 160 μl20% SDS 4 mlWater 33.84 ml2.取样：取细胞浓度为2×107的藻液1ml于1.5ml EP管中，厌氧箱中离心1-2min，将沉淀物于液氮中速冻后置于-80①保存；3.提取总蛋白：3.1 根据样品数量计算所需的提取试剂体积：1个样品——1ml 1× extraction buffer3.2 配制1× extraction buffer:试剂：① 2× extraction buffer① 100× PMSF3.3 提取：将-80①保存的样品取出，置于冰上，加入步骤2.2配制的1× extraction buffer 1ml, 涡旋至EP管底部无沉淀黏着后，4①，12,000 rpm离心10 min，用1ml移液枪小心吸取上清于另一干净的1.5 ml EP管中，置于冰上。
Western Blot protocol
Western Blot protocol一、试剂准备1.蛋白裂解液配方：2. 1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)O 800 mlTris base (MW 121.1) 181.7g dd H2溶解之后用浓盐酸调PH至8.8（一般加几滴即可，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量），然后定容至1L。
高压灭菌后保存。
3. 1 mol/L Tris.HCL(PH 6.8)Tris base (MW 121.1) 30.9 g dd HO 200 ml2溶解之后用浓盐酸调PH至6.8（，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量。
一般）然后定容至250 ml，经高压灭菌后使用。
4.10% AP （过硫酸铵）:O 溶解后分装，-20℃保存。
0.1 g过硫酸铵 + 1.0 ml Dd H2O加100 g SDS加热至68℃助溶，然后用浓盐酸调节PH 5.10% SDS：用900 ml的H2至7.2，最后定容至1L。
6.分离胶( 12% )[常用]：7.浓缩胶( 5% )：8. 5 × Running Buffer（储存液）:9. 1 × Running Buffer （工作液）：200 ml的5 × Running Buffer + 800 ml的ddO。
H210.转膜缓冲液：3.03 g Tris base + 14.4g甘氨酸溶解在少量的蒸馏水中，完全溶解后加100ml的甲醇，再用蒸馏水定容至1L。
11.10 × TBS ( 储存液) ：24.2 g Tris base + 80 g NaCl 溶解，用Hcl调PH至7.6，最后定容至1L。
O。
12.1 × TBS （工作液）：100 ml的10 × TBS + 900 ml的dd H213.TBST：含0.1% 吐温—20的1 × TBS。
Westernblot实验技术
Western blot试剂配制1. 30%丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺用温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水（超纯水）溶后定容到100ml，过滤后于棕色瓶中储存0.8gN, N’-亚甲双丙烯酰胺注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反映是光催化或碱催化的，故应核算溶液的pH值不超过7.0。
这一溶液置棕色瓶中贮存于4℃，每隔几个月须重新配制。
小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
2. 10%SDS：称5gSDS，超纯水溶解后，定容到50ml。
贮存液保存于室温。
3. 10%AP（过硫酸铵）：称1gAP，溶于8ml超纯水中，定容到10ml，小量分装（250ul/管）保存于-20℃，过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，每次使用均要用新鲜的。
4. 1.5MTris-HCl：称18.2gTris（Mr=121.14）加50ml超纯水溶解后，用浓HCl调pH值8.8，定容到100ml。
5. 0.5MTris-HCl：称3gTris（Mr=121.14）加25ml超纯水溶解后，调pH值6.8，定容到50ml。
6. TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)：TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
一旦加入TEMED，立即开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
7. 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液【10×（25mMTris+0.25M+0.1%SDS）】pH8.330.3g Tris 15.15g Tris187.65g Glycine 溶于超纯水中，定容到1000ml 93.825g Glycine 5×缓冲液10g SDS 5g SDS8. 2×SDS上样缓冲液：2×（50mMTrispH6.8+2%SDS+10%甘油+0.1%溴酚蓝+50mMβ-巯基乙醇）loading buffer10ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8)2g SDS10ml 甘油超纯水定容到50ml。
western blot
Western blotMarker蛋白loading buffer(5×)(样品：loading buffer=4：1)5%牛奶：2.5 g光明脱脂奶粉，定容到50 Ml电泳缓冲液（10×）：甘氨酸 144gTris粉末 30.3gSDS 10gddH胶的制备：（溶质的质量分数=(溶质质量/溶液质量)×100%）8.8Buffer: Tris 18.17g10%SDS 4mL(10gSDS定容到100 mL，因为难溶，可以37度水浴一小时)ddH20 定容至100mL6.8 Buffer: Tris 6.06g10%SDS 4 mLddH20 定容至100mL5%浓缩胶（4 mL）：d H20 2.3 mL6.8 Buffer 1 mL30%Arc-Bis 660uL10%APS 40uL (10gAPS定容到100 mL)TEMED 4 uL（4度保存）分离胶配方（8 mL）封闭液：奶粉5g叠氮钠0.02g(防腐)PBS 定容到100mLAP显色液（50 mLA液+50 mLB液，然后定容到1升）3.仪器垂直电泳糟，制胶支架，制胶固定架4.操作方法(1)洗：将长、短玻璃板洗干净。
(2)做制胶单元：将长、短玻璃板平行合在一起，垂直插入制胶去架中（注意勿用手接触灌胶面的玻璃，短玻璃板面对操作者），在平整的桌面上将长短玻璃的底面在制胶支架内放平整，使三者的底面处于同一平面，将制胶支架上的锁紧门向二侧旋转锁紧，完成一个制胶单元。
(3)固定制胶单元：将制备好的制胶单元的底面压到制胶固定架的密封橡胶条上，使制胶支架的后面后边尽量靠近制胶回定架，左手轻轻下压垫条玻璃板上缘至制胶回定架的弹簧夹能卡住为止，右手调整弹簧夹，使弹簧夹能固定在垫条玻璃的中间位置。
(4)做分离胶：配好分离胶(量很少的两个药品可最后加，药品都加进去后，后枪头吹打使其混匀)，从固定着的两玻璃板的中间缝隙的一端加入，大约加7 mL。
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Western blot基础知识一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类根据凝胶电泳的类型，WB可分为：*还原（变性）WB：最常用的一类，使用SDS-PAGE电泳。
主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等*非还原（非变性）WB：主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。
一般不使用SDS、DTT等变性剂。
western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲叉双丙稀酰胺1g温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水至100ml终体积储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS 0.1g去离子水1ml室温保存。
3、分离胶缓冲液1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)Tris base 18.15g1mol/LHCL 48mlSW 至100ml终体积过滤后4℃保存。
4、浓缩胶缓冲液0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8)Tris base 6.05gSW 40ml用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
10%(w/v)过硫酸胺溶液。
提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油 6.4ml10%SDS 12.8ml巯基乙醇 3.2ml0.05%溴酚蓝 1.6mlH2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸188gSDS 10gSW 至1000ml得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液甘氨酸 2.9gTris碱 5.8gSDS 0.37g甲醇200mlSW 至总量1L9、丽春红染液储存液丽春红S 2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30gSW 至100ml加水用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、100mmol/L NaCl。
19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
四、实验流程第1步：组织或细胞蛋白提取蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！收集106细胞，加入150μl SDS裂解液，冰上超声5次，定量。
第2步：电泳、转膜电泳和转膜是保证成功进行WB后续检测的前提条件。
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。
常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。
在电泳和转移过程中，正确使用蛋白质分子量Marker，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证！SDS-PSGE电泳：1.准备各溶液。
小烧杯两个，5ml枪头6个，吸水纸，罐胶电泳设备。
2.准备罐胶槽。
将玻璃板擦干净，放入短架子内，薄板靠门，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面（否则漏胶）；将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜；将短架子装在长架子上（短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶）。
3.准备配胶。
将各溶液（ddH2O，单体，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次摆好，5ml 枪头插于长罐胶槽，调好取TEMED、APS的枪。
4.配分离胶。
在一小烧杯上装半杯ddH2O；另一小烧杯依次加上述各液（加TEMED、APS时要迅速），快速摇匀。
注：胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。
5.罐胶。
从玻璃板中间注入胶液，注胶速度均匀，不要产生气泡。
罐胶后用ddH2O 压胶。
6.等待时：将Tris-HCl换成pH6.8。
换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。
调好各移液器。
7.30分钟后。
倒掉压胶水，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。
8.配集成胶。
参见步骤4。
9.罐胶。
参见步骤5，灌满为止，不要有气泡。
10.插梳。
梳柱下面不要有气泡。
11.等待时。
A：配电泳缓冲液。
B：将样本煮沸5分钟。
C：水中冷却，短暂离心后依加样序排放好。
D：等胶近凝时，将玻璃板装在电泳架子上，罐内槽液于槽中，检查是否密封。
E：将上槽架子按于槽中。
12.30分钟后。
罐上槽液超过短玻璃板，拔梳（注意力道适中，不能太快）。
放置上样架子。
13.上样30μl。
枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，枪头随液面上涨而上提。
可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品都须同样处理。
14.加外槽液。
15.电泳。
转膜：1.准备。
分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具，在电泳槽中倒好转膜液2.揭胶。
电泳结束后，将电泳槽移至水池中，倒掉电泳液，将内槽提起放在水池边，取出两边玻璃板。
用纯水冲干净玻璃板，小心揭开短板，去掉集成胶，小心将胶转入转膜液在中。
3.转膜。
将夹子打开，黑色在底，依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵，关好夹子（均在液面下进行，注意气泡）快速放入架子中。
在电泳槽中放冰袋。
4.电泳。
蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。
浸泡在转膜缓冲液中5分钟左右，以平衡离子强度。
视情况决定是否切角标记。
2）电用结束前，应泡好3M滤纸2-6张均可（普通滤纸也可）和1张硝酸纤维素滤膜。
3）戴上手套按如下顺序安装转移装置：a.平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。
b.在海绵垫片上放置1-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。
c.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。
排除所有气泡。
d.把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。
e. 把最后1-3张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方，同样须确保不留气泡。
其实，用玻棒给点压力很容易排除气泡。
f.放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。
保证对凝胶有一定的压力。
4）连接电源。
电转过程中，尽量给个低温环境，我放在冰水里转膜，也用内置的冰盒。
5）断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。
将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否完全。
要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色3-10分钟，然后蒸馏水冲洗6）切去滤膜的左下角，以标记，如有预染MARKER也可不标。
7）杂交与显色：①封闭②一抗孵育：分别与相应的抗体及内参照抗体孵育③漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各10min。
④与二抗孵育：与辣根过化物酶标记的二抗孵育⑤漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗4次以上，每次各10min。
⑥ECL显像⑦显影定影完毕第3步：加入一抗孵育一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：1、选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）2、选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）3、选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体一抗的保存和使用：1、根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
2、抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周3、由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。
1.转膜等待时准备封闭液（即Non-fat milk 5% in TBST）。
2.转膜完毕后，将膜放入封闭液中，轻摇孵育1小时。
3.孵一抗。
将封闭好的膜在转移到一抗盒子中，室温孵育两小时或4℃过夜，4.洗涤将孵育好一抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
5.孵二抗。
将洗好的膜放在二抗中室温孵育两小时。
6.洗涤。
将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
7.ECL化学发光和曝光显影。
实验常见的问题指南1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz 的一抗仍不行。